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1 162 药 学 学 报 Acta Pharmaceutica Sinica 2015, 50 (2): 藁 本 内 酯 对 谷 氨 酸 诱 导 的 PC12 细 胞 凋 亡 的 保 护 作 用 吴 倩, 汪 宁 *, 王 艳, 汪 光 云, 朴 新 新 ( 新 安 医 学 省 部 共 建 教 育 部 重 点 实 验 室, 安 徽 省 中 医 药 科 学 院 中 药 药 效 与 安 全 性 评 价 研 究 所, 安 徽 中 医 药 大 学 药 学 院, 安 徽 合 肥 ) 摘 要 : 研 究 藁 本 内 酯 对 谷 氨 酸 诱 导 PC12 细 胞 凋 亡 的 保 护 作 用 采 用 MTT 比 色 法 检 测 细 胞 存 活 率 ; Annexin V-FITC/propidium iodide (PI) 双 染 法 流 式 细 胞 术 (flow cytometry, FCM) 检 测 细 胞 凋 亡 率 ; Fluo-3/AM 荧 光 染 色 法 检 测 钙 离 子 含 量 ; Western blot 法 检 测 线 粒 体 和 胞 浆 中 细 胞 色 素 C (cytochrome C, Cyt C) 及 凋 亡 相 关 蛋 白 Caspase-3 Bcl-2 Bax 的 表 达 结 果 显 示, 谷 氨 酸 具 有 细 胞 毒 性, 其 半 数 抑 制 浓 度 (IC 50 ) 为 15 mmol L 1 ; 不 同 浓 度 藁 本 内 酯 ( µmol L 1 ) 预 处 理 可 显 著 提 高 细 胞 存 活 率 与 正 常 对 照 组 相 比, 谷 氨 酸 单 独 给 药 组 的 细 胞 凋 亡 率 为 13.39%; 藁 本 内 酯 给 药 组 ( µmol L 1 ) 使 细 胞 的 凋 亡 率 分 别 减 少 到 9.06% 6.48% 和 3.82% 并 且 藁 本 内 酯 可 以 显 著 减 少 谷 氨 酸 所 致 的 钙 离 子 内 流, Western blot 结 果 显 示, 藁 本 内 酯 可 能 通 过 减 少 线 粒 体 Cyt C 的 释 放, 抑 制 Caspase-3 活 性, 同 时 升 高 Bcl-2/Bax 比 值 来 保 护 谷 氨 酸 诱 导 的 PC12 细 胞 凋 亡 结 果 表 明, 藁 本 内 酯 对 谷 氨 酸 诱 导 PC12 细 胞 的 凋 亡 具 有 保 护 作 用 该 保 护 作 用 可 能 与 抑 制 细 胞 内 钙 离 子 内 流 及 阻 断 Cyt C 从 线 粒 体 释 放 入 胞 浆 有 关 关 键 词 : 藁 本 内 酯 ; PC12 细 胞 ; 谷 氨 酸 ; 钙 离 子 ; 细 胞 色 素 C; 细 胞 凋 亡 中 图 分 类 号 : R285.5 文 献 标 识 码 : A 文 章 编 号 : (2015) Protective effect of ligustilide against glutamate-induced apoptosis in PC12 cells WU Qian, WANG Ning *, WANG Yan, WANG Guang-yun, PIAO Xin-xin (Key Laboratory of Xin an Medicine, Ministry of Education, Institute for Pharmacodynamics and Safety Evaluation of Chinese Medicine, Anhui Academy of Chinese Medicine, College of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei , China) Abstract: To investigate the neuroprotective of ligustilide (LIG) against glutamate-induced apoptosis of PC12 cells, cell viability were examined by MTT assay. Flow cytometry was applied to assay cell apoptosis rate. Intracellular calcium concentration was measured by using fluorescent dye Fluo-3/AM. Cytochrome C (Cyt C), Caspase-3, Bax and Bcl-2 protein expression were assayed by western blot. The results showed that glutamate is cytotoxic with an inhibitory concentration 50 (ID 50 ) of 15 mmol L 1. Pretreatment with LIG (1, 5, 15 µmol L 1 ) significantly improved cell viability. The apoptosis rate in glutamate-induced PC12 cells was 13.39%, and decreased in the presence of LIG (1, 5, 15 µmol L 1 ) by 9.06%, 6.48%, 3.82%, separately. Extracellular accumulation of Ca 2+ induced by glutamate were significantly reduced by LIG. The results of western blot manifested that pretreatment LIG could decrease the release of Cyt C from mitochondria, down-regulate Caspase-3 protein expression and up-regulate Bcl-2/Bax ratio, thereby protects PC12 cells 收 稿 日 期 : ; 修 回 日 期 : 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 ( ); 十 二 五 科 技 支 撑 计 划 项 目 (2012BAI26B03); 2013 年 度 安 徽 省 学 术 及 技 术 带 头 人 及 后 备 人 选 科 研 活 动 经 费 资 助 项 目. * 通 讯 作 者 Tel: , Fax: , wnhefei@163.com

2 吴 倩 等 : 藁 本 内 酯 对 谷 氨 酸 诱 导 的 PC12 细 胞 凋 亡 的 保 护 作 用 163 from apoptosis. In summary, LIG had protective effect on glutamate-induced apoptosis in PC12 cells through attenuating the increase in intracellular Ca 2+ concentration, and inhibiting the release of Cyt C from mitochondria to cytoplasm. Key words: ligustilide; PC12 cell; glutamate; Ca 2+ ; cytochrome C; apoptosis 脑 缺 血 (cerebral ischemia) 是 一 种 发 病 率 高 致 残 率 高 死 亡 率 高 和 复 发 率 高 的 脑 血 管 疾 病 临 床 研 究 表 明 脑 缺 血 与 谷 氨 酸 兴 奋 性 毒 性 介 导 的 神 经 细 胞 [1, 损 伤 密 切 相 关 2] PC12 细 胞 为 大 鼠 肾 上 腺 嗜 铬 细 胞 瘤 (rat adrenal pheochromocytoma) 分 化 的 PC12 细 胞, 具 有 典 型 的 交 感 神 经 元 细 胞 特 征 应 用 谷 氨 酸 诱 导 PC12 细 胞 损 伤, 已 成 为 研 究 脑 缺 血 的 一 种 常 用 体 外 模 型 藁 本 内 酯 (Z-ligustilide, LIG) 是 中 药 川 芎 的 主 要 成 分 之 一, 而 川 芎 是 经 典 复 方 通 窍 活 血 汤 的 主 要 组 成 药 材 通 窍 活 血 汤 有 活 血 化 瘀, 通 络 开 窍 之 效, 临 床 上 对 缺 血 性 中 风 偏 头 痛 脑 外 伤 性 耳 鸣 等 疾 病 的 防 治 和 改 善 具 有 良 好 的 效 果, 疗 效 确 切 课 题 组 前 期 研 究 发 现, 通 窍 活 血 汤 含 药 血 清 对 谷 氨 酸 诱 导 PC12 细 胞 的 损 伤 具 有 很 好 的 保 护 作 用 [3], 并 在 给 予 通 窍 活 血 汤 的 脑 缺 血 大 鼠 的 脑 脊 液 中 检 测 到 了 藁 本 内 酯 的 成 分 该 成 分 对 心 脑 血 管 有 较 强 的 药 理 作 用, 如 脑 神 经 保 护 扩 张 血 管 和 抑 制 血 管 平 滑 肌 增 殖 等 [4 7] 已 有 研 究 证 实 藁 本 内 酯 能 明 显 减 少 脑 缺 血 再 灌 注 引 起 的 脑 梗 塞 体 积, 改 善 脑 神 经 功 能, 并 且 能 减 轻 大 鼠 [8, 皮 层 神 经 元 和 海 马 神 经 元 细 胞 的 损 伤 9] 本 研 究 在 此 基 础 上, 旨 在 研 究 藁 本 内 酯 对 谷 氨 酸 诱 导 PC12 细 胞 凋 亡 的 保 护 作 用, 并 探 讨 其 可 能 的 作 用 机 制 材 料 与 方 法 主 要 试 剂 PC12 细 胞 ( 中 国 科 学 院 上 海 生 命 科 学 研 究 院 细 胞 资 源 中 心 ) 藁 本 内 酯 对 照 品 购 自 成 都 科 曼 斯 特 生 物 科 技 有 限 公 司 ( 纯 度 98%), 先 用 DMSO 溶 解 浓 度 为 32 µmol L 1 的 母 液, 再 用 无 血 清 培 养 基 稀 释 至 所 需 浓 度 (DMSO 终 浓 度 < 0.3%) 丁 苯 酞 ( 合 肥 兰 旭 生 物 科 技 有 限 公 司 ), DMEM 高 糖 培 养 基 胎 牛 血 清 (HyClone 公 司 ), MTT (Sigma 公 司 ), Annexin V-FITC 凋 亡 试 剂 盒 核 / 胞 浆 蛋 白 提 取 试 剂 盒 ( 上 海 贝 博 生 物 公 司 ), Caspase-3 抗 体 Bax Bcl-2 (Santa Cruz 公 司 ), FITC 标 记 羊 抗 小 鼠 IgG FITC 标 记 羊 抗 兔 IgG ( 北 京 中 山 金 桥 生 物 技 术 有 限 公 司 ) 主 要 仪 器 ELX800UV 酶 标 仪 (Bio-TEK 公 司 ); CK2 型 倒 置 显 微 镜 ( 日 本 Olympus 公 司 ) PC12 细 胞 培 养 及 细 胞 存 活 率 检 测 细 胞 培 养 于 含 有 10% 胎 牛 血 清 的 DMEM, 置 于 37 5% CO 2 的 培 养 箱 中 培 养 取 对 数 生 长 期 的 PC12 细 胞, 以 细 胞 数 /ml 接 种 于 96 孔 培 养 板 内 (100 μl/ 孔 ), 常 规 培 养 24 h 后, 将 细 胞 分 为 正 常 对 照 组 模 型 对 照 组 阳 性 对 照 组 和 LIG 预 处 理 后 加 谷 氨 酸 组 正 常 对 照 组 采 用 DMSO 溶 剂 对 照, 谷 氨 酸 处 理 组 又 分 为 和 25 mmol L 1 剂 量 组, 以 选 择 合 适 的 造 模 浓 度 各 组 DMSO 终 浓 度 < 0.3% 阳 性 对 照 组 为 丁 苯 酞 (3-n-butylphthalide, NBP, 10 µmol L 1 ), LIG 预 处 理 组 分 为 1 5 和 15 µmol L 1 剂 量 组, 预 处 理 3 h 作 用 24 h 后, 每 孔 加 入 MTT (5 mg ml 1 ) 20 μl, 再 培 养 4 h 后, 小 心 吸 弃 上 清 液, 每 孔 加 入 DMSO 150 µl 溶 解 沉 淀 物, 振 荡 器 混 匀 后, 酶 标 仪 490 nm 测 定 吸 光 度 (A) 值 MTT 法 检 测 细 胞 的 存 活 率 按 下 式 计 算, 细 胞 存 活 率 (%) = A 实 验 组 / A 正 常 对 照 组 100%, 实 验 重 复 3 次 藁 本 内 酯 对 谷 氨 酸 损 伤 后 PC12 细 胞 凋 亡 的 影 响 Annexin V-FITC/propidium iodide (PI) 双 染 法 检 测 细 胞 凋 亡 造 模 结 束 后, 去 除 细 胞 培 养 液, 胰 酶 消 化, PBS 洗 细 胞 3 次, 按 试 剂 盒 说 明 书 进 行 Annexin V 和 PI 染 色, 经 流 式 细 胞 仪 检 测, 每 组 3 个 样 本, 采 用 FCS 4 流 式 软 件 分 析 细 胞 凋 亡 率 细 胞 内 Ca 2+ 含 量 检 测 细 胞 内 钙 离 子 浓 度 采 用 荧 光 染 料 Fluo-3/AM 荧 光 探 针 法 造 模 结 束 后, 加 入 Fluo-3/AM 染 色 液 (5 μmol L 1 ) 与 37 培 养 箱 避 光 孵 育 30 min, 用 PBS 洗 涤 细 胞 3 次, 以 充 分 去 除 未 进 入 细 胞 内 的 荧 光 探 针 在 荧 光 显 微 镜 下 随 机 选 取 不 同 区 域 的 3 个 视 野, 观 察 并 拍 照 Western blot 检 测 线 粒 体 和 胞 浆 中 Cyt C Caspase-3 Bax 和 Bcl-2 蛋 白 的 表 达 取 对 数 生 长 期 的 PC12 细 胞 种 于 培 养 瓶 中, 分 组 处 理 后, 收 集 细 胞 1 提 取 细 胞 总 蛋 白 质 : 每 组 加 入 含 1% 苯 甲 基 磺 酰 氟 (PMSF) 的 蛋 白 裂 解 液, 冰 上 裂 解 30 min 后, 离 心 30 min, 取 上 清 液 2 提 取 胞 浆 和 线 粒 体 蛋 白 : 按 胞 浆 / 线 粒 体 蛋 白 分 离 试 剂 盒 说 明 书 操 作 3 SDS-PAGE 凝 胶 电 泳 分 离 蛋 白 质, 将 蛋 白 带 转 移 到 硝 酸 纤 维 素 膜 上, 5% 脱 脂 奶 粉 封 闭 2 h, 一 抗 Cyt C/Caspase-3/Bcl-2/

3 164 药 学 学 报 Acta Pharmaceutica Sinica 2015, 50 (2): Bax (mouse monoclonal IgG, ) 4 孵 育 过 夜, PBST ( 含 0.1% Tween 20 的 PBS) 洗 3 次, 每 次 10 min 加 入 对 应 的 二 抗 室 温 孵 育 1.5 h, PBST 洗 3 次, 每 次 10 min 采 用 化 学 发 光 方 法 显 影 定 影, 经 AlphaView SA 软 件 分 析 蛋 白 表 达 统 计 学 处 理 实 验 数 据 以 x ± s 表 示, 采 用 SPSS 17.0 统 计 软 件 进 行 数 据 分 析 多 组 间 均 数 比 较 采 用 单 因 素 方 差 分 析, 两 组 间 均 数 比 较 采 用 Student s t-test 的 方 法, 以 P < 0.05 为 差 异 具 有 统 计 学 意 义 结 果 1 藁 本 内 酯 对 谷 氨 酸 损 伤 的 PC12 细 胞 存 活 率 的 影 响 为 选 择 谷 氨 酸 损 伤 的 最 佳 浓 度, PC12 细 胞 给 予 不 同 浓 度 的 谷 氨 酸 作 用 24 h 5~25 mmol L 1 谷 氨 酸 对 PC12 细 胞 活 力 呈 剂 量 依 赖 的 抑 制 作 用 ( 图 1A) 在 15 mmol L 1 谷 氨 酸 作 用 下, PC12 细 胞 的 存 活 率 为 52.3%, 因 此 选 择 15 mmol L 1 谷 氨 酸 作 为 造 模 浓 度 但 当 藁 本 内 酯 ( µmol L 1 ) 作 用 于 损 伤 的 PC12 细 胞 后, 细 胞 的 存 活 率 分 别 提 高 到 80.0% 84.5% 和 93.8% ( 图 1B) 2 藁 本 内 酯 对 谷 氨 酸 损 伤 后 PC12 细 胞 凋 亡 的 影 响 为 了 定 量 检 测 藁 本 内 酯 对 谷 氨 酸 损 伤 的 PC12 细 胞 凋 亡 的 影 响, 采 用 PI 双 染 法 检 测 细 胞 凋 亡 率 与 正 常 对 照 组 相 比 (3.22%), 谷 氨 酸 单 独 给 药 组 的 细 胞 凋 亡 率 为 13.39%; 而 藁 本 内 酯 给 药 组 ( µmol L 1 ) 使 细 胞 的 凋 亡 率 减 少 到 9.06% 6.48% 和 3.82% 结 果 表 明 不 同 浓 度 的 藁 本 内 酯 均 可 抑 制 谷 氨 酸 诱 导 PC12 细 胞 的 凋 亡 见 图 2 3 藁 本 内 酯 对 谷 氨 酸 损 伤 后 PC12 细 胞 Ca 2+ 浓 度 变 化 的 影 响 与 模 型 对 照 组 相 比, 正 常 对 照 组 几 乎 见 不 到 绿 色 荧 光, 而 谷 氨 酸 处 理 组 绿 色 荧 光 非 常 强, 藁 本 内 酯 干 预 后, 绿 色 荧 光 减 弱, 表 明 藁 本 内 酯 可 以 抑 制 谷 氨 酸 诱 导 所 致 PC12 细 胞 钙 离 子 的 内 流 见 图 3 4 藁 本 内 酯 对 谷 氨 酸 损 伤 的 PC12 细 胞 线 粒 体 和 胞 浆 中 Cyt C 表 达 的 影 响 Western blot 结 果 表 明, 正 常 对 照 组 Cyt C 主 要 表 达 在 线 粒 体 中, 线 粒 体 中 谷 氨 酸 组 Cyt C 漏 出 量 明 显 增 多, 而 藁 本 内 酯 给 药 组 Cyt C 漏 出 量 较 谷 氨 酸 组 明 显 减 少 ; 胞 浆 中 谷 氨 酸 组 Cyt C 表 达 明 显 增 多, 而 藁 本 内 酯 给 药 组 Cyt C 表 达 较 谷 氨 酸 组 明 显 减 少 见 图 4 5 藁 本 内 酯 对 谷 氨 酸 损 伤 的 PC12 细 胞 凋 亡 蛋 白 Caspase-3 表 达 的 影 响 Western blot 结 果 表 明, 正 常 对 照 组 的 活 化 Caspase-3 (cleaved-caspase-3) 无 表 达, 而 谷 氨 酸 组 的 活 化 Caspase-3 表 达 明 显 上 调, 藁 本 内 酯 给 药 组 的 活 化 Caspase-3 的 表 达 与 模 型 组 相 比 显 著 降 低 ( 图 5) 6 藁 本 内 酯 对 谷 氨 酸 损 伤 的 PC12 细 胞 Bcl-2/Bax 比 率 表 达 变 化 的 影 响 Western blot 结 果 表 明, 与 模 型 对 照 组 相 比, 藁 本 内 酯 给 药 组 的 Bcl-2/Bax 比 率 明 显 增 高 ( 图 6) 结 果 表 明, 藁 本 内 酯 通 过 降 低 促 凋 亡 蛋 白 Bax 的 表 达 和 增 加 抗 凋 亡 蛋 白 Bcl-2 的 表 达 抑 制 谷 氨 酸 诱 导 的 PC12 细 胞 凋 亡 讨 论 谷 氨 酸 是 中 枢 神 经 系 统 中 一 类 重 要 的 兴 奋 性 氨 基 酸 (excitatory amino acid, EAA), 脑 缺 血 时 谷 氨 酸 浓 度 的 异 常 升 高 可 过 度 激 活 离 子 型 谷 氨 酸 受 体, 引 起 细 胞 内 钙 离 子 浓 度 持 续 升 高, 导 致 钙 超 载 现 象 发 生, 继 而 引 起 DNA 损 伤 和 细 胞 凋 亡 的 级 联 反 [10, 应 11] 已 证 实 藁 本 内 酯 对 缺 血 性 脑 损 伤 具 有 神 经 保 Figure 1 Effect of Z-ligustilide (LIG) on the viability of damaged PC12 cells elicited by glutamate. A: PC12 cells were treated with glutamate at concentrations of 5 25 mmol L 1 for 24 h. B: PC12 cells were incubated with vehicle, LIG (1, 5, 15 μmol L 1 ) or 10 µmol L 1 3-n-butylphthalide (NBP) for 3 h, and then exposure to 15 mmol L 1 glutamate for 24 h. The data are represented as means ± SD (n = 6). ## P < 0.01 vs control group; ** P < 0.01 vs glutamate alone group

4 吴 倩等: 藁本内酯对谷氨酸诱导的 PC12 细胞凋亡的保护作用 165 Figure 2 Effect of LIG on glutamate-induced PC12 cell apoptosis. Cells were incubated with different treatments, labeled with a combination of Annexin V-FITC/PI and measured by flow cytometry. (a) PC12 cells were incubated with culture medium only; (b) 15 mmol L 1 glutamate alone; (c) 10 µmol L 1 NBP + 15 mmol L 1 glutamate; (d) 1 µmol L 1 LIG + 15 mmol L 1 glutamate; (e) 5 µmol L 1 LIG + 15 mmol L 1 glutamate; (f) 15 µmol L 1 LIG + 15 mmol L 1 glutamate. n = 3, x ± s. ##P < 0.01 vs control group; **P < 0.01 vs glutamate alone group Figure 3 Effect of LIG on glutamate-induced intracellular Ca 2+ influx (magnification, 100). (a) PC12 cells were incubated with culture medium only; (b) 15 mmol L 1 glutamate alone; (c) 10 µmol L 1 NBP + 15 mmol L 1 glutamate; (d) 1 µmol L 1 LIG + 15 mmol L 1 glutamate; (e) 5 µmol L 1 LIG + 15 mmol L 1 glutamate; (f) 15 µmol L 1 LIG + 15 mmol L 1 glutamate

5 166 药 学 学 报 Acta Pharmaceutica Sinica 2015, 50 (2): Figure 4 (A) Effect of LIG (15 µmol L 1 ) on the expression levels of Cyt C in mitochondrial and cytosolic fractions of PC12 cells. (B) show densitometry analysis for the data from (A). n = 3, x ± s. ## P < 0.01 vs control group; * P < 0.05 vs glutamate (15 mmol L 1 ) alone group Figure 5 (A) LIG suppressed glutamate-induced expression of cleaved-caspase-3 in PC12 cells. (B) showed densitometry analysis for the data from (A). n = 3, x ± s. ## P < 0.01 vs control group, ** P < 0.01 vs glutamate alone group 护, 而 与 藁 本 内 酯 具 有 相 似 化 学 结 构 的 丁 苯 酞, 是 中 国 医 学 科 学 院 药 物 研 究 所 研 制 并 开 发 的 一 类 新 型 且 具 有 前 景 的 抗 脑 缺 血 药 物, 对 急 性 缺 血 性 脑 卒 中 具 [12, 有 明 显 的 疗 效 13] 已 有 研 究 证 实 丁 苯 酞 能 抑 制 神 经 细 胞 凋 亡, 保 护 缺 血 缺 氧 引 起 的 神 经 细 胞 损 伤 [14] 作 为 丁 苯 酞 的 衍 生 物, 藁 本 内 酯 与 其 化 学 结 构 相 似, 因 此 选 择 丁 苯 酞 作 为 阳 性 对 照 药 脑 缺 血 时, 氧 葡 萄 糖 等 物 质 的 运 输 受 限, 能 量 骤 减 后 导 致 离 子 梯 度 不 可 维 持 膜 电 位 下 降 膜 去 极 化, 细 胞 内 电 压 依 赖 的 Ca 2+ 通 道 被 激 活 使 得 细 胞 外 Figure 6 (A) Effect of LIG on the expression levels of Bcl-2 and Bax in PC12 cells. (B) showed densitometry analysis for the data from (A). n = 3, x ± s. ## P < 0.01 vs control group, ** P < 0.01 vs glutamate alone group Ca 2+ 进 入 细 胞 内, 同 时 因 能 量 耗 竭 使 钙 泵 功 能 失 调, 导 致 细 胞 内 Ca 2+ 排 除 障 碍 造 成 钙 超 载, 导 致 线 粒 体 损 伤, 引 起 Cyt C 自 线 粒 体 释 放 致 胞 浆, 活 化 Caspase-3, [15, 诱 导 细 胞 凋 亡 16] 而 本 研 究 结 果 表 明, 藁 本 内 酯 能 明 显 逆 转 谷 氨 酸 诱 导 的 PC12 细 胞 中 Ca 2+ 浓 度 的 升 高 在 谷 氨 酸 所 致 PC12 细 胞 凋 亡 机 制 研 究 中, 有 3 条 已 知 的 凋 亡 途 径 : 线 粒 体 凋 亡 途 径 死 亡 受 体 途 径 和 内 质 网 途 径, 其 中 线 粒 体 凋 亡 通 路 是 主 要 的 途 径,

6 吴 倩 等 : 藁 本 内 酯 对 谷 氨 酸 诱 导 的 PC12 细 胞 凋 亡 的 保 护 作 用 167 同 时 线 粒 体 在 细 胞 凋 亡 的 过 程 中 起 着 至 关 重 要 的 作 用 [17 19] Bcl-2 和 Bax 是 Bcl-2 家 族 中 两 个 主 要 的 成 员, Bcl-2 家 族 主 要 调 节 细 胞 的 凋 亡 和 坏 死 Bax 作 为 细 胞 损 伤 和 刺 激 的 传 感 器, 一 般 位 于 胞 浆 中, 当 细 胞 受 到 损 伤 和 刺 激 后, Bax 可 以 构 成 跨 线 粒 体 外 膜 的 孔, 导 致 膜 电 位 的 降 低 和 Cyt C 及 其 他 凋 亡 诱 导 因 子 的 外 流, 并 激 活 Caspase-3, 同 时 破 坏 正 常 状 态 下 具 有 抗 凋 亡 功 能 的 Bcl-2 蛋 白 而 抗 凋 亡 蛋 白 Bcl-2 是 一 种 重 要 的 细 胞 内 组 分, 通 过 阻 断 Cyt C 自 线 粒 体 释 放 和 Caspase-3 聚 集 抑 制 Bax 的 过 表 达, 并 且 联 系 线 粒 体 外 膜, 稳 定 膜 的 渗 透 性, 保 护 线 粒 体 的 完 整 性, 进 而 [20, 抑 制 细 胞 凋 亡 21] 两 者 在 线 粒 体 途 径 中 起 到 重 要 的 调 节 作 用 因 此, Bax/Bcl-2 的 比 值 被 视 为 与 凋 亡 相 关 的 重 要 指 标 由 此, 本 研 究 检 测 了 Bax 和 Bcl-2 的 表 达 变 化, 结 果 表 明, 藁 本 内 酯 阻 止 了 Cyt C 从 线 粒 体 释 放 到 胞 浆, 参 与 上 调 Bcl-2 蛋 白 和 下 调 Bax 蛋 白 的 表 达 并 抑 制 Caspase-3 蛋 白 的 过 表 达 提 示 藁 本 内 酯 通 过 调 节 抗 凋 亡 蛋 白 Bcl-2 和 促 凋 亡 蛋 白 Bax 之 间 的 平 衡, 抑 制 Caspase-3 的 活 化, 从 而 发 挥 抗 凋 亡 作 用 本 实 验 从 分 子 水 平 上 阐 明 了 藁 本 内 酯 的 神 经 保 护 作 用, 该 作 用 可 能 通 过 抑 制 细 胞 内 钙 离 子 内 流, 抑 制 Cyt C 自 线 粒 体 的 释 放, 诱 导 了 抗 凋 亡 蛋 白 Bcl-2 蛋 白 的 表 达 增 加, 抑 制 促 凋 亡 蛋 白 Bax 和 Caspase-3 的 过 表 达, 最 终 抑 制 谷 氨 酸 诱 导 的 PC12 细 胞 凋 亡 References [1] Yu XY, Sun L, Luo XY, et al. Investigation of the neuronal deathmode induced by glutamate treatment in serum-, antioxidant-free primary cultured cortical neurons [J]. Brain Res Dev Brain Res, 2003, 145: [2] Li Z, Lin XM, Gong PL, et al. Effects of Gingko biloba extract on glutamate-induced [Ca 2+ ] i changes in cultured cortical astrocytes after hypoxia/reoxygenation, H 2O 2 or L-glutamate injury [J]. Acta Pharm Sin ( 药 学 学 报 ), 2005, 40: [3] Wang N, Deng Y, Wei W, et al. Serum containing Tongqiaohuoxue decoction suppresses glutamate-induced PC12 cell injury [J]. Neural Regen Res, 2012, 7: [4] Zuo AH, Wang L, Xiao HB. Research progress studies on pharmacology and pharmacokinetics of ligustilide [J]. China J Chin Mat Med ( 中 国 中 药 杂 志 ), 2012, 37: [5] Peng B, Zhao P, Lu YP, et al. Z-Ligustilide activates the Nrf2/HO-1 pathway and protects against cerebral ischemia reperfusion injury in vivo and in vitro [J]. Brain Res, 2013, 1520: [6] Feng ZB, Lu YP, Wu XM, et al. Ligustilide alleviates brain damage and improves cognitive function in rats of chronic cerebral hypoperfusion [J]. J Ethnopharmacol, 2012, 144: [7] Qi HY, Han YF, Rong JH. Potential roles of PI3K/Akt and Nrf2 Keap1 pathways in regulating hormesis of Z-ligustilide in PC12 cells against oxygen and glucose deprivation [J]. Neuropharmacology, 2012, 62: [8] Guo J, Shang EX, Duan JA, et al. Determination of ligustilide in the brains of freely moving rats using microdialysis coupled with ultra performance liquid chromatography/mass spectrometry [J]. Fitoterapia, 2011, 82: [9] Kuang X, Yao Y, Du JR, et al. Neuroprotective role of Z-ligustilide against forebrain ischemic injury in ICR mice [J]. Brain Res, 2006, 1102: [10] Pakhomova ON, Gregory B, Semenov I, et al. Calciummediated pore expansion and cell death following nanoelectroporation [J]. Biochim Biophys Acta, 2014, 1838: [11] Reynolds IJ, Hastings TG. Glutamate induces the production of reactive oxygen species in cultured forebrain neurons following NMDA receptor activation [J]. J Neurosci, 1995, 15: [12] Zhang LH, Yu WH, Wang YX, et al. DL-3-n-Butylphthalide, an anti-oxidant agent, prevents neurological deficits and cerebral injury following stroke per functional analysis, magnetic resonance imaging and histological assessment [J]. Curr Neurovasc Res, 2012, 9: [13] Li JM, Li Y, Ogle M, et al. DL-3-n-Butylphthalide prevents neuronal cell death after focal cerebral ischemia in mice via the JNK pathway [J]. Brain Res, 2010, 1359: [14] Chang Q, Wang XL. Effects of chiral 3-n-butylphthalide on apoptosis induced by transient focal cerebral ischemia in rats [J]. Acta Pharm Sin ( 药 学 学 报 ), 2003, 24: [15] Szydlowska K, Tymianski M. Calcium, ischemia and excitotoxicity [J]. Cell, 2010, 47: [16] Zhao Q, Wang S, Li Y, et al. The role of the mitochondrial calcium uniporter in cerebral ischemia/reperfusion injury in rats involves regulation of mitochondrial energy metabolism [J]. Mol Med Rep, 2013, 7: [17] Yu LC, Wang N, Zhang YF, et al. Neuro-protective effect of muscone on glutamate-induced apoptosis in PC12 cells via antioxidant and Ca 2+ antagonism [J]. Neurochem Int, 2014, 70: [18] Wang CY, Zhang SP, Xu Y, et al. Effect of safflor yellow B

7 168 药 学 学 报 Acta Pharmaceutica Sinica 2015, 50 (2): on vascular endothelial cells injury induced by angiotensin-ii [J]. Acta Pharm Sin ( 药 学 学 报 ), 2012, 47: [19] Ma J, Chen HM, Yan XJ, et al. Astaxanthin inhibits sodium azide-induced cytotoxicity in hepatocyte L-02 cells probably by H + transferring function [J]. Acta Pharm Sin ( 药 学 学 报 ), 2011, 46: [20] Fu JJ, Huang HQ, Liu JJ, et al. Tanshinone IIA protects cardiac myocytes against oxidative stress-triggered damage and apoptosis [J]. Eur J Pharmacol, 2007, 568: [21] Zhao H, Yenari MA, Cheng D, et al. Bcl-2 overexpression protects against neuron loss within the ischemic margin following experimental stroke and inhibits cytochrome C translocation and Caspase-3 activity [J]. J Neurochem, 2003, 85: 正 大 天 晴 药 业 集 团 股 份 有 限 公 司 为 国 内 肝 健 康 药 物 研 发 和 生 产 基 地 之 一, 是 国 家 重 点 高 新 技 术 企 业 国 家 火 炬 计 划 连 云 港 新 医 药 产 业 基 地 重 点 骨 干 企 业 国 内 最 佳 研 发 生 产 线 十 佳 工 业 企 业 ( 第 2 名 ) 江 苏 省 创 新 型 企 业 企 业 效 益 连 续 多 年 增 长 30% 以 上 并 连 续 多 年 位 居 全 国 医 药 行 业 百 强 之 列, 且 逐 年 上 升, 工 信 部 发 布 的 2012 年 度 中 国 制 药 工 业 百 强 榜 中, 正 大 天 晴 排 名 第 28 位 公 司 现 有 员 工 2750 人, 拥 有 5 个 全 资 子 公 司 6 个 控 股 子 公 司, 在 连 云 港 南 京 盐 城 和 淮 安 分 别 建 有 研 发 和 生 产 基 地 正 大 天 晴 药 业 产 品 治 疗 涉 及 肝 病 肿 瘤 糖 尿 病 呼 吸 心 脑 血 管 感 染 等 多 个 疾 病 领 域, 在 肝 病 药 物 研 发 领 域 具 备 突 出 优 势,2013 年 肝 病 药 物 产 品 在 国 内 医 院 市 场 占 有 率 已 达 到 19%(IMS) 正 大 天 晴 一 贯 重 视 研 发 创 新 工 作, 始 终 把 技 术 创 新 视 为 企 业 生 命 的 源 泉, 经 过 40 多 年 的 发 展 和 探 索, 逐 步 形 成 了 完 善 的 创 新 体 系 目 前 拥 有 研 发 人 员 500 余 名, 高 级 工 程 师 23 名, 博 士 17 名, 硕 士 200 余 名, 博 士 硕 士 及 具 有 高 级 技 术 职 称 的 人 员 占 40% 以 上, 逐 渐 形 成 了 以 国 家 千 人 计 划 等 高 端 人 才 组 成 的 海 归 团 队 博 士 项 目 创 新 团 队 高 工 经 验 技 术 团 队 和 专 家 学 术 支 持 团 队 几 大 人 才 梯 队, 承 担 着 正 大 天 晴 药 业 的 新 药 研 发 工 艺 改 造 等 一 系 列 重 要 的 科 研 任 务 公 司 先 后 成 功 地 研 制 了 具 有 自 主 知 识 产 权 的 肝 病 治 疗 药 物, 并 成 功 完 成 了 数 十 个 科 研 成 果 的 产 业 化 十 五 以 来, 公 司 先 后 承 担 了 国 家 省 重 点 科 技 项 目 30 多 个, 通 过 这 些 重 点 项 目 的 实 施 及 产 业 化, 加 大 了 企 业 与 科 研 院 所 之 间 学 术 交 流 产 品 研 究 技 术 支 持 成 果 转 让 等 方 面 的 合 作 力 度, 使 得 企 业 创 新 能 力 及 科 技 管 理 水 平 得 到 了 明 显 提 高, 为 公 司 的 快 速 发 展 提 供 了 有 力 的 支 持

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