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1 30(4) 中 国 生 物 防 治 学 报 Chinese Journal of Biological Control 2014 年 8 月 印 楝 内 生 放 线 菌 鉴 定 及 对 稻 瘟 病 菌 拮 抗 作 用 研 究 张 丽 1, 纪 明 山 1,2*, 谷 祖 敏 1, 田 宏 哲 1, 李 修 伟 1, 李 兴 海 (1. 沈 阳 农 业 大 学 植 物 保 护 学 院, 沈 阳 ;2. 辽 宁 省 生 物 农 药 工 程 技 术 研 究 中 心, 沈 阳 ) 1 摘 要 : 从 印 楝 叶 片 和 果 实 中 分 离 93 株 内 生 放 线 菌 生 长 速 率 法 测 定 表 明 29 株 内 生 放 线 菌 对 稻 瘟 病 菌 Magnaporthe grisea 具 有 拮 抗 作 用, 其 中 菌 株 YL-2 对 稻 瘟 病 菌 的 抑 制 率 达 82.65% 杯 碟 法 测 定 表 明 菌 株 YL-2 发 酵 液 对 供 试 的 18 种 植 物 致 病 真 菌 均 具 有 抑 菌 活 性, 盆 栽 试 验 表 明 菌 株 YL-2 发 酵 液 对 稻 瘟 病 防 效 达 85.41%, 显 著 高 于 浓 度 为 25 mg/l 春 雷 霉 素 可 湿 性 粉 剂 的 防 效 根 据 形 态 特 征 生 理 生 化 特 性 细 胞 壁 化 学 成 分 和 16S rdna 序 列, 初 步 鉴 定 菌 株 YL-2 为 娄 彻 氏 链 霉 菌 Streptomyces rochei 关 键 词 : 印 楝 ; 内 生 放 线 菌 ; 娄 彻 氏 链 霉 菌 ; 拮 抗 作 用 ; 稻 瘟 病 菌 中 图 分 类 号 :S476 文 献 标 识 码 :A 文 章 编 号 : (2014) Identification of Endophytic Actinomycete from Azadirachta indica A. Juss. and Its Effect on Magnaporthe grisea ZHANG Li 1, JI Mingshan 1,2*, GU Zumin 1, TIAN Hongzhe 1, LI Xiuwei 1, LI Xinghai 1 (1. College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang , China; 2. Liaoning Biological Pesticide Engineering Research Center, Shenyang , China) Abstract: Ninety-three endophytic actinomycetes were isolated from the leaf and fruit of Azadirachta indica A. Juss.. The results showed that 29 strains had antagonistic activities against Magnaporthe grisea by measuring mycelial growth rate method. The strain YL-2 had a strong antifungal activity against M. grisea with the inhibition rate of 82.65%. And it exhibited antagonistic activities against 18 kinds of plant pathogenic fungi by cylinder-plate method. The pot experiment showed that the control efficiency of filtrate from YL-2 fermentation liquid on M. grisea was significantly higher than 25 mg/l Kasugamycin WP which could be up to 85.41%. According to the morphological characteristics, physiological and biochemical properties, chemical composition of the cell wall and 16S rdna, the strain YL-2 was preliminarily identified as Streptomyces rochei. Key words: Azadirachta indica; endophytic actinomycete; Streptomyces rochei; antagonism; Magnaporthe grisea 稻 瘟 病 Magnaporthe grisea 为 水 稻 重 要 病 害 之 一, 遍 及 全 国 各 大 稻 区, 流 行 年 份 一 般 可 造 成 10%~20% 的 经 济 损 失, 严 重 者 可 达 50% 以 上, 对 水 稻 产 业 的 可 持 续 发 展 构 成 严 重 威 胁 [1~3] 目 前, 国 内 防 治 稻 瘟 病 主 要 依 赖 于 瘟 特 灵 春 雷 霉 素 等 化 学 药 剂 然 而, 化 学 药 剂 长 期 大 量 的 使 用 不 仅 使 病 菌 产 生 抗 药 性 而 且 会 给 生 态 平 衡 带 来 沉 重 负 担, 因 此 探 寻 高 效 有 益 于 绿 色 发 展 的 生 物 控 制 剂 刻 不 容 缓 近 几 年 来, 利 用 植 物 内 生 菌 防 治 病 害 成 为 生 物 防 治 研 究 的 热 点 [4] 其 中 内 生 放 线 菌 因 分 布 广 泛 种 类 多 样, 而 且 可 产 生 丰 富 的 生 理 活 性 物 质, 使 其 在 微 生 物 农 药 的 筛 选 上 引 起 人 们 的 关 注 如 澳 大 利 亚 Coombs 和 Franco [5] 研 究 小 组 从 小 麦 根 部 分 离 的 内 生 放 线 菌 在 温 室 试 验 中 可 使 小 麦 全 蚀 病 的 危 害 降 低 [6] 70%, 邢 鲲 等 从 辣 椒 中 分 离 内 生 放 线 菌 Lj20 的 发 酵 液 对 向 日 葵 菌 核 病 的 菌 丝 生 长 抑 制 率 达 80% 印 收 稿 日 期 : 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 ( ) 作 者 简 介 : 张 丽 (1985-), 女, 博 士 研 究 生, zl @163.com;* 通 信 作 者, 教 授, jimingshan@163.com

2 第 4 期 张 丽 等 : 印 楝 内 生 放 线 菌 鉴 定 及 对 稻 瘟 病 菌 拮 抗 作 用 研 究 535 楝 Azadirachta indica A. Juss. 为 楝 科 植 物, 可 防 治 的 害 虫 超 过 400 种, 还 对 多 种 线 虫 和 真 菌 具 有 生 物 活 性 商 品 化 的 印 楝 制 剂 Trilogy 和 Triacinbsp 用 于 防 治 果 树 和 作 物 的 叶 斑 病 霜 霉 病 白 粉 病 等 多 种 病 害 研 究 证 实 具 有 药 用 性 能 的 植 物, 其 所 含 的 内 生 菌 有 可 能 产 生 植 物 相 同 或 相 似 的 抗 菌 活 性 物 质, 或 产 生 的 抗 菌 活 性 物 质 可 能 参 与 了 药 用 植 物 的 抗 菌 过 程 本 研 究 对 印 楝 叶 片 和 果 实 样 品 中 内 生 放 线 菌 进 行 分 离 和 鉴 定, 筛 选 出 对 稻 瘟 病 菌 具 有 拮 抗 活 性 的 菌 株, 期 望 能 获 得 结 构 新 颖 活 性 显 著 的 新 先 导 化 合 物, 为 开 发 新 型 生 物 农 药 奠 定 基 础 1 材 料 与 方 法 1.1 供 试 材 料 试 验 样 品 : 印 楝 枝 叶 和 果 实,2011 年 12 月 采 集 自 泰 国 印 楝 种 植 基 地,4 保 藏 检 测 菌 株 :18 种 植 物 病 原 真 菌 ( 表 2), 由 沈 阳 农 业 大 学 农 药 学 教 研 室 提 供 春 雷 霉 素 :2% 可 湿 性 粉 剂, 湖 北 兴 银 河 化 工 有 限 公 司 生 产 水 稻 品 种 : 盐 丰 47 PDA 培 养 基 : 土 豆 200 g 葡 萄 糖 20 g 琼 脂 20 g 蒸 馏 水 1000 ml 高 氏 一 号 培 养 基 (GAU): 可 溶 性 淀 粉 20 g KNO 3 1 g K 2 HPO g MgSO g NaCl 0.5 g FeSO g 琼 脂 20 g 水 1000 ml ph 7.2~7.4 基 础 发 酵 培 养 基 : 葡 萄 糖 9 g 玉 米 粉 9 g 黄 豆 粉 9 g 酵 母 膏 1.2 g 牛 肉 膏 0.3 g (NH 4 ) 2 SO g NaCl 0.6 g K 2 HPO g FeSO g ZnSO g MgSO g 蒸 馏 水 300 ml,ph 7.2~7.4 主 要 仪 器 : 光 学 显 微 镜 (213 型, 江 南 光 学 仪 器 厂 );PCR 扩 增 仪 (TP600 型,Takara Bio Inc.); 核 酸 电 泳 仪 (Mupid-One 型,Advance-Bio Co., Ltd); 蛋 白 质 电 泳 仪 (EPS300 型, 上 海 天 能 科 技 有 限 公 司 ); DNA 测 序 仪 (ABI PRISM TM 3730 XL DNA Sequencer 型,Applied Biosystem) 1.2 印 楝 内 生 菌 的 分 离 筛 选 内 生 放 线 菌 的 分 离 与 纯 化 按 照 Coombs 和 Franco [5] 的 方 法 对 样 品 进 行 消 毒 取 处 理 过 的 叶 片 和 果 实 各 3 g, 各 加 10 ml 无 菌 水 研 碎 静 置 15 min, 梯 度 浓 度 稀 释, 用 无 菌 移 液 枪 分 别 吸 取 50 μl 涂 在 高 氏 一 号 培 养 基 上, 置 于 28 培 养 箱 中 培 养 7 d, 同 时 将 最 后 1 次 处 理 样 品 的 清 洗 液 也 涂 布 于 高 氏 一 号 培 养 基 上 用 以 检 查 表 面 消 毒 是 否 彻 底 待 菌 落 出 现 后, 根 据 菌 落 形 态 颜 色 的 差 异 挑 取 到 斜 面 培 养 基 上 进 行 反 复 划 线 培 养 直 至 获 得 纯 种 内 生 放 线 菌, 编 号, 保 存 于 4 冰 箱 中 待 用 [7] 拮 抗 内 生 放 线 菌 的 筛 选 采 用 生 长 速 率 法 对 93 株 内 生 放 线 菌 进 行 活 体 抑 菌 活 性 检 测 以 稻 瘟 病 菌 为 指 示 菌, 点 接 在 含 分 离 内 生 放 线 菌 菌 液 的 PDA 培 养 基 上 ( 含 菌 量 为 cfu/ml), 以 不 加 放 线 菌 的 PDA 培 养 基 为 对 照 25 培 养 72 h, 记 录 菌 落 生 长 半 径 试 验 设 3 次 重 复, 挑 选 抑 菌 活 性 优 异 的 菌 株 作 为 目 的 生 防 菌 抑 制 率 (%)=( 处 理 菌 落 半 径 - 对 照 菌 落 半 径 )/ 对 照 菌 落 半 径 100 [8] 内 生 放 线 菌 YL-2 菌 株 发 酵 液 抗 菌 谱 测 定 采 用 杯 碟 法 对 菌 株 YL-2 发 酵 液 进 行 抗 菌 谱 测 定 牛 津 杯 内 盛 200 μl 发 酵 液, 以 18 种 植 物 病 原 真 菌 作 为 指 示 菌,PDA 培 养 基 中 含 植 物 病 原 菌 为 cfu/ml 25 培 养 72 h 后 测 定 抑 菌 直 径, 试 验 设 3 次 重 复 室 内 防 治 效 果 测 定 将 水 稻 种 子 浸 泡 在 水 中, 于 25~30 培 养 2 d 催 芽, 每 天 换 水 然 后 在 40 cm 30 cm 10 cm 的 塑 料 盒 子 中 盛 2/3 富 含 营 养 物 质 的 黑 土, 用 清 水 浇 灌 土 壤, 待 水 完 全 浸 湿 土 壤 后 将 发 芽 的 水 稻 种 子 轻 轻 洒 在 土 壤 表 层, 在 种 子 上 覆 盖 薄 薄 一 层 土 壤, 以 不 露 种 子 为 宜, 洒 水 放 置 25 温 室 培 养, 保 持 土 壤 的 含 水 量, 待 盆 栽 水 稻 幼 苗 长 至 2~3 叶 期 时 备 用 选 取 长 势 一 致 的 2~3 叶 期 盆 栽 水 稻 幼 苗, 以 菌 株 YL-2 发 酵 液 发 酵 液 稀 释 50 倍 发 酵 液 稀 释 500 倍 进 行 防 效 测 定 将 20 ml 不 同 浓 度 发 酵 液 在 水 稻 叶 片 上 进 行 喷 雾 处 理, 以 湿 而 不 滴 为 宜,24 h 后 喷 洒 20 ml 浓 度 为 cfu/ml 的 稻 瘟 病 病 原 孢 子 悬 浮 液, 同 时 设 25 mg/l 春 雷 霉 素 为 药 剂 对 照, 清 水 为 空 白 对 照 (CK) 每 个 处 理 3 次 重 复, 每 次 重 复 3 盆 水 稻 幼 苗 处 理 后 的 幼 苗 放 置 于 人 工 气 候 室 (25,RH 90%) 培 养 4 10 d 后 调 查 发 病 情 况 按 文 献 [9] 的 分 级 标 准 进 行 病 害 分 级, 并 计 算 病 情 指 数 和 防 治 效 果 防 效 (%)=( 对 照 病 情 指 数 处 理 病 情 指 数 )/ 对 照 病 情 指 数 100

3 536 中 国 生 物 防 治 学 报 第 30 卷 1.3 内 生 放 线 菌 YL-2 菌 株 的 分 类 鉴 定 形 态 观 察 与 培 养 特 征 采 用 插 片 法 [10],28 培 养 7 d, 光 学 显 微 镜 20 倍 下 观 察 菌 丝 等 形 态 特 征 [11] 培 养 特 征 按 阎 逊 初 所 用 的 方 法 进 行 试 验 生 理 生 化 检 测 参 照 链 霉 菌 鉴 定 手 册 [12] 推 荐 的 部 分 培 养 基 和 方 法 进 行 试 验, 观 察 记 录 细 胞 壁 化 学 成 分 分 析 采 用 快 速 薄 板 层 析 法 (TCL) [13,14], 进 行 全 细 胞 水 解 液 的 氨 基 酸 和 糖 型 分 析 [15] S rdna 测 序 及 序 列 分 析 参 照 Christensen 等 方 法 提 取 菌 株 YL-2 的 DNA, 进 行 PCR 的 扩 增 根 据 16S rdna 结 构 特 点 及 其 保 守 区 设 计 特 异 引 物, 引 物 1:5 -GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3 ; 引 物 2:5 -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3 采 用 3% 的 琼 脂 糖 凝 胶 对 PCR 产 物 电 泳 检 测 [16] 将 目 的 DNA 片 段 与 其 它 DNA 尽 可 能 分 开, 回 收 DNA 的 琼 脂 块, 经 连 接 转 化 后, 将 转 化 好 的 菌 体 穿 刺 培 养, 由 大 连 宝 生 物 ( 工 程 ) 有 限 公 司 测 序 将 所 得 的 基 因 序 列 送 到 NCBI 进 行 Blast 比 对, 试 验 菌 株 序 列 及 其 在 GenBank 中 相 近 的 模 式 菌 基 因 序 列 一 并 调 入 DNAStar 软 件 中 进 行 序 列 分 析, 最 后 构 建 N-J 系 统 发 育 树, 确 定 分 离 菌 株 的 分 类 地 位 1.4 数 据 统 计 与 分 析 采 用 SPSS 17.0 软 件 对 数 据 进 行 差 异 显 著 性 (One-way ANOVA,P=0.05) 和 相 关 性 分 析 2 结 果 与 分 析 2.1 内 生 放 线 菌 的 分 离 与 纯 化 从 试 验 样 品 中 分 离 得 93 株 内 生 放 线 菌 在 用 最 后 1 次 清 洗 液 涂 布 的 平 板 上 未 见 菌 落 生 长, 因 此 表 面 消 毒 可 靠, 分 离 菌 株 可 用 2.2 拮 抗 内 生 放 线 菌 的 筛 选 对 93 株 内 生 放 线 菌 进 行 抑 菌 活 性 的 初 筛, 获 得 拮 抗 放 线 菌 29 株 ( 表 1) 菌 株 YL-2 对 稻 瘟 病 菌 的 抑 菌 活 性 最 高, 抑 制 率 达 到 82.65% 菌 株 YL-14 YL-4 GL-7 YL-18 对 稻 瘟 病 菌 的 抑 制 率 分 别 为 80.38% 73.29% 76.11% 70.81%, 抑 菌 活 性 均 显 著 低 于 菌 株 YL-2, 选 取 菌 株 YL-2 为 目 的 生 防 菌 表 1 稻 瘟 病 菌 拮 抗 放 线 菌 的 筛 选 Table 1 Selection antagonistic actinomycetes against M. grisea 拮 抗 放 线 菌 抑 制 率 拮 抗 放 线 菌 抑 制 率 拮 抗 放 线 菌 抑 制 率 Antagonistic actinomycetes Inhibitory rate (%) Antagonistic actinomycetes Inhibitory rate (%) Antagonistic actinomycetes Inhibitory rate (%) YL m YL p YL u YL a YL n GL p YL hi YL j GL n YL d YL b GL f YL g YL s GL p YL n YL h GL k YL l YL o GL o YL r YL e GL c YL t YL q GL s YL f YL i 注 : 同 列 数 据 后 的 不 同 字 母 表 示 0.05 水 平 上 差 异 显 著 下 同 Note: Values in each column followed by different letters were significantly different at 0.05 level. The same below. 2.3 内 生 放 线 菌 YL-2 发 酵 液 抗 菌 谱 的 测 定 抗 菌 谱 测 定 发 现, 菌 株 YL-2 发 酵 液 对 18 种 常 见 植 物 病 原 真 菌 均 产 生 不 同 程 度 的 抑 制 效 果 该 菌 株 除 了 对 稻 瘟 病 菌 表 现 出 较 强 的 拮 抗 性 外, 对 水 稻 恶 苗 病 菌 Fusarium moniliforme 和 小 麦 根 腐 病 菌 Bipolaris sorokinianum 也 表 现 出 良 好 的 抑 制 效 果, 抑 菌 直 径 分 别 达 到 和 mm 所 形 成 的 明 显 的 抑 菌 圈 也

4 第 4 期 张 丽 等 : 印 楝 内 生 放 线 菌 鉴 定 及 对 稻 瘟 病 菌 拮 抗 作 用 研 究 537 表 明 了 该 菌 株 能 分 泌 抑 菌 活 性 物 质 ( 表 2) 2.4 内 生 放 线 菌 YL-2 对 水 稻 稻 瘟 病 的 室 内 防 效 试 验 结 果 表 明, 处 理 后 10 d 的 试 验 组 与 对 照 组 发 病 情 况 显 著 不 同, 菌 株 YL-2 发 酵 滤 液 发 酵 滤 液 50 倍 稀 释 液 和 500 倍 稀 释 液 对 水 稻 稻 瘟 病 均 具 有 较 好 的 防 治 效 果, 防 效 分 别 为 85.41% 73.73% 和 70.25%, 显 著 高 于 化 学 对 照 25 mg/l 春 雷 霉 素 的 58.70% 防 效 ( 表 3) 表 2 菌 株 YL-2 发 酵 液 对 18 种 植 物 病 原 真 菌 的 抑 菌 效 果 Table 2 Inhibition effect of fermentation filtrate of strain YL-2 on 18 plant pathogens 病 原 菌 Plant pathogens 抑 菌 直 径 Inhibitory diameter (mm) 病 原 菌 Plant pathogens 抑 菌 直 径 Inhibitory diameter (mm) 大 豆 根 腐 病 菌 Phytophthora sojae ij 番 茄 根 腐 病 菌 Pyrenochaeta lycopersici l 小 麦 根 腐 病 菌 Bipolaris sorokinianum c 水 稻 稻 瘟 病 菌 Magnaporthe grisea a 番 茄 灰 霉 病 菌 Botrytis cinerea kl 辣 椒 疫 霉 病 菌 Phytophthora capsici h 小 麦 赤 霉 病 菌 Fusarium graminearum f 黄 瓜 炭 疽 病 菌 Colletotrichum lagenarium i 镰 刀 病 菌 Fusarium roseum n 梨 轮 纹 病 菌 Macrophoma kuwatsukai g 黄 瓜 褐 斑 病 菌 Corynespora cassiicola h 辣 椒 枯 萎 病 菌 Fusarium oxysporum f 棉 花 黄 萎 病 菌 Verticillium dahliae j 甜 瓜 蔓 枯 病 菌 Didymella bryoniae k 辣 椒 炭 疽 病 菌 Colletotrichum capsici e 番 茄 叶 霉 病 菌 Fulvia fulva d 水 稻 恶 苗 病 菌 Fusarium moniliforme b 番 茄 早 疫 病 菌 Alternaria solani m 表 3 菌 株 YL-2 发 酵 滤 液 对 水 稻 稻 瘟 病 的 防 治 效 果 Table 3 Control efficiency of culture filtrate of the strain YL-2 on M. grisea in pot trial 处 理 4 d 10 d Treatment 病 情 指 数 Disease index 防 治 效 果 Control efficiency (%) 病 情 指 数 Disease index 防 治 效 果 Control efficiency (%) 发 酵 滤 液 Culture filtrate ±1.16 a ±0.12 a 发 酵 滤 液 50 倍 稀 释 液 50-fold dilution of culture filtrate ±0.01 b ±0.40 b 发 酵 滤 液 500 倍 稀 释 液 500-fold dilution of culture filtrate ±0.27 b ±0.69 c 25 mg/l 春 雷 霉 素 可 湿 性 粉 剂 25 mg/l kasugamycin WP ±0.03 b ±0.70 d 清 水 对 照 CK 内 生 放 线 菌 YL-2 的 鉴 定 形 态 观 察 与 培 养 特 征 通 过 光 学 显 微 镜 观 察, 拮 抗 放 线 菌 YL-2 基 丝 不 断 裂 无 横 隔 成 分 枝 状 ; 孢 子 丝 直 松 敞 柔 曲 ; 孢 子 长 圆 或 卵 圆 形 ( 图 1) 拮 抗 放 线 菌 YL-2 在 高 氏 合 成 一 号 察 氏 葡 萄 糖 - 天 冬 门 素 等 6 种 培 养 基 上 生 长 良 好, 菌 落 为 灰 色, 不 透 明 表 面 成 丰 茂 绒 丝 状 气 生 菌 丝 体 为 灰 色, 基 内 菌 丝 微 褐 色, 有 时 略 带 微 红 色 调, 无 可 溶 色 素 ( 表 4) 生 理 生 化 特 征 拮 抗 放 线 菌 YL-2 革 兰 氏 染 色 阳 性 ; 明 胶 部 分 液 化 ; 牛 奶 不 凝 固 ; 淀 粉 不 水 解 ; 纤 维 素 上 生 长 好 ; 硝 酸 盐 还 原 为 阳 性 ; 不 产 生 黑 色 素 和 H 2 S; 能 利 用 葡 萄 糖 果 糖 木 糖 肌 醇 蔗 糖 鼠 李 糖 甘 露 醇 在 生 理 生 化 特 征 上 与 娄 彻 氏 链 霉 菌 Streptomyces rochei 基 本 一 致 细 胞 壁 化 学 成 分 分 析 试 验 结 果 表 明, 菌 株 Y L-2 细 胞 壁 含 LL- 二 氨 基 庚 二 酸 (LL-DAP) 和 甘 氨 酸, 细 胞 壁 属 于 Ⅰ 型, 无 特 征 性 糖, 糖 型 C, 符 合 链 霉 菌 属 的 化 学 分 类 特 性 S rdna 序 列 分 析 通 过 PCR 扩 增 方 法 克 隆 菌 株 YL-2 的 16S rdna( 图 2), 获 得 16S rdna 近 全 长 序 列, 共 1423 bp Blast 相 似 性 分 析 表 明, 内 生 放 线 菌 YL-2 与 娄 彻 氏 链 霉 菌 S. rochei 的 16S rdna 序 列 同 源 性 为 99%, 建 立 系 统 发 育 树 ( 图 3) 可 知 内 生 放 线 菌 YL-2 与 S. rochei 处 于 同 一 分 支 因 此, 初 步 鉴 定 菌 株 YL-2 为 娄 彻 氏 链 霉 菌

5 538 中 国 生 物 防 治 学 报 第 30 卷 M 图 1 菌 株 YL-2 菌 丝 形 态 (20 ) Fig. 1 Mycelium of antagonistic actinomycete strain YL-2 (20 ) M: DL 2000 DNA Marker;1: PCR 产 物 PCR production;+: 正 对 照 Positive control; : 负 对 照 Negative control 图 2 内 生 放 线 菌 YL-2 16S rdna 扩 增 结 果 Fig. 2 PCR amplification products of strain YL-2 表 4 菌 株 YL-2 的 培 养 特 征 Table 4 Cultural properties of strain YL-2 培 养 基 Medium 气 生 菌 丝 Aerial mycelium 基 内 菌 丝 Kiene mycelium 可 溶 性 色 素 Soluble pigment 生 长 状 况 Growth status 高 氏 一 号 合 成 GAU 灰 白 色 Offwhite 无 色 Colorless 葡 萄 糖 - 天 冬 门 素 GAS 灰 白 色 Offwhite 褐 色 Brown 伊 莫 逊 EM 灰 白 色 Offwhite 褐 色 Brown - ++ 蔗 糖 察 氏 Sucrose czapek 灰 白 色 Offwhite 无 色 Colorless 马 铃 薯 浸 汁 Potato juice 灰 色 Gray 灰 色 Gray - ++ 无 机 盐 淀 粉 I norganic salts starch 灰 色 Gray 无 色 Colorless 注 :++: 生 长 的 好 ;+++: 生 长 的 最 好 ; 表 示 不 产 生 可 溶 性 色 素 Note: ++: good growth status; +++: best growth status; : does not produce soluble pigment. 图 3 内 生 放 线 菌 YL-2 与 相 关 菌 株 的 系 统 发 育 树 Fig. 3 Phylogenetic tree of strain YL-2 and related strains 3 讨 论 化 学 防 治 过 程 中 所 产 生 的 有 害 物 再 猖 獗 (resurgence) 抗 药 性 (resistance) 残 留 (residue) 和 环 境 污 染 (pollution) 问 题, 给 人 们 带 来 深 深 的 思 考, 使 得 植 物 内 生 菌 研 究 倍 受 科 研 人 员 的 关 注 迄 今 为 止, 已 研 究 过 的 数 百 种 植 物 相 对 于 自 然 界 存 在 的 25 万 余 种 植 物 来 说 是 微 不 足 道 的 [17], 所 以 植 物 内 生 菌 资 源 潜 在 开 发 空 间 十 分 广 阔 印 楝 全 身 都 是 宝, 根 皮 叶 和 果 实 均 具 有 防 腐 灭 虫 杀 菌 作 用, 素 有 乡 村 药 房 之 称 [18] 关 于 印 楝 内 生 菌 防 治 植 物 病 害 的 研 究 报 道 较 少,Verma 等 [19] 2009 年 从 印 楝 内 生 菌 Chloridium sp. 中 提 纯 的 抑 菌 活 性 物 质 Javanicin 对 纹 枯 病 菌 黄 萎 病 菌 和 花 生 褐 斑 病 菌 表 现 出 强 烈 的 抑 制 效 果 2011 年 从 印 楝 根

6 第 4 期 张 丽 等 : 印 楝 内 生 放 线 菌 鉴 定 及 对 稻 瘟 病 菌 拮 抗 作 用 研 究 539 部 分 离 的 链 霉 菌 AzR 和 051 对 大 肠 杆 菌 抑 制 作 用 较 显 著, 从 叶 片 中 分 离 的 诺 卡 氏 菌 AzL025 对 枯 草 芽 孢 杆 菌 有 明 显 的 抑 菌 效 果,AzR 和 AzL025 AzS030 能 有 效 抑 制 红 色 毛 癣 菌 石 膏 样 小 孢 子 菌 白 色 念 珠 菌 等 人 类 病 原 菌 [20] 本 研 究 从 印 楝 叶 片 中 获 得 对 稻 瘟 病 菌 具 有 较 高 抑 制 活 性 的 内 生 放 线 菌 YL-2, 其 发 酵 滤 液 对 稻 瘟 病 菌 的 抑 菌 直 径 可 达 mm, 对 水 稻 稻 瘟 病 盆 栽 的 防 效 达 85.41%, 有 潜 力 开 发 成 为 防 治 水 稻 稻 瘟 病 的 生 物 制 剂 通 过 形 态 和 培 养 特 征 生 理 生 化 特 征 细 胞 壁 化 学 成 分 分 析 及 16S rdna 序 列 分 析, 初 步 鉴 定 菌 株 YL-2 为 娄 彻 氏 链 霉 菌 S. rochei 试 验 结 果 显 示 : 该 菌 株 在 形 态 特 征 培 养 特 征 和 生 理 生 化 特 性 方 面 与 S. rochei 依 旧 存 在 一 些 差 异, 并 且 目 前 虽 然 16S rdna 基 因 序 列 广 泛 应 用 于 菌 种 鉴 定 或 构 建 细 菌 的 系 统 进 化 关 系, 但 在 亲 缘 关 系 很 近 的 分 类 类 群 间, 由 于 序 列 间 相 似 度 太 高 而 失 效 因 此, 对 菌 株 YL-2 具 体 的 分 类 地 位 尚 需 进 一 步 用 DNA-DNA 杂 交 来 验 证, 以 弥 补 16S rdna 基 因 序 列 的 不 足 目 前, 关 于 将 从 印 楝 中 筛 选 的 娄 彻 氏 链 霉 菌 应 用 于 防 治 水 稻 病 害 的 研 究 尚 未 见 报 道 因 此, 开 展 对 该 菌 株 的 系 统 探 讨 可 以 为 其 在 生 产 实 践 中 的 应 用 奠 定 基 础, 更 为 发 展 生 物 防 治 开 辟 另 一 新 途 径 至 于 菌 株 YL-2 所 产 生 的 拮 抗 物 质 是 否 为 印 楝 素 还 有 待 进 一 步 确 定 今 后 将 致 力 于 深 入 研 究 抗 菌 活 性 成 分 的 种 类 结 构 及 作 用 机 制, 进 而 创 制 农 用 抗 生 素 的 新 产 品 或 品 种 的 新 用 途 参 考 文 献 [1] 孙 国 昌, 杜 新 法, 陶 荣 祥, 等. 水 稻 稻 瘟 病 防 治 研 究 进 展 和 21 世 纪 初 研 究 设 想 [J]. 植 物 保 护, 2000, 26(1): [2] 彭 化 贤, 刘 波 微, 陈 小 娟, 等. 水 稻 稻 瘟 病 拮 抗 细 菌 的 筛 选 与 防 治 初 探 [J]. 中 国 生 物 防 治, 2002, 18(1): [3] 许 煜 泉, 张 彦, 俞 吉 安, 等. 一 株 拮 抗 稻 瘟 病 菌 的 产 荧 光 假 单 胞 杆 菌 [J]. 上 海 交 通 大 学 学 报, 1998, 32(3): [4] Sharma N, Sharma S. Control of foliar diseases of mustard by Bacillus from reclaimed soils[j]. Microbiology Research, 2008, 163: [5] Coombs J T, Franco C M M. Isolation and identification of actinobacteria from surface-sterilized wheat roots[j]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69: [6] 邢 鲲, 韩 巨 才, 刘 慧 平, 等. 辣 椒 内 生 放 线 菌 的 分 离 鉴 定 和 拮 抗 作 用 [J]. 安 徽 农 业 科 学, 2005, 33(5): [7] 周 德 庆. 微 生 物 学 实 验 手 册 [M]. 上 海 : 上 海 科 学 技 术 出 版 社, [8] 潘 金 菊, 于 婷, 尚 玉 珂, 等. 生 防 菌 BMP-11 对 瓜 果 腐 霉 病 菌 的 抑 制 活 性 及 其 鉴 定 [J]. 植 物 保 护 学 报, 2008, 35(4): [9] 农 业 部 农 药 检 定 所 生 测 试. 农 药 田 间 药 效 实 验 准 则 ( 一 )[M]. 北 京 : 中 国 标 准 出 版 社, [10] Park D H, Kim J S, Kwon S W, et al. Streptomyces luridiscabiei sp. nov., Streptomyces puniciscabiei sp. nov. and Streptomyces niveiscabiei sp. nov., which cause potato common scab disease in Korea[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2003, 53: [11] 阎 逊 初. 放 线 菌 的 分 类 和 鉴 定 [M]. 北 京 : 科 学 出 版 社, [12] 中 国 科 学 院 微 生 物 研 究 所 放 线 菌 分 类 组. 链 霉 菌 鉴 定 手 册 [M]. 北 京 : 科 学 出 版 社, [13] 王 平. 测 定 放 线 菌 菌 体 中 氨 基 酸 和 单 糖 的 快 速 方 法 薄 层 层 析 法 [J]. 微 生 物 学 通 报, 1986, 13(5): [14] 阮 继 生, 刘 志 恒, 梁 丽 糯, 等. 放 线 菌 的 研 究 及 应 用 [M]. 北 京 : 科 学 出 版 社, [15] Christensen H, Angen O, Mutters R, et al. DNA-DNA hybridization determined in micro-wells using covalent attachment of DNA[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2000, 3: [16] Urakawa H, Kita-Tsukamoto K, Ohwaha K. Microbial diversity in marine sediments from Sagami Bayand Tokyo Bay, Japan, as determined by 16S rrna gene analysis[j]. Microbiology, 1999, 145: [17] 刘 芸, 殷 红, 彭 辉, 等. 植 物 内 生 真 菌 - 潜 在 的 天 然 药 物 新 来 源 [J]. 中 华 现 代 中 西 医 杂 志, 2005, 3(5): [18] Koul O, Isman M B, Ketkar C M. Properties and uses of neem, Azadirchta indica[j]. Canadian Journal of Botany, 1990, 68: [19] Verma V C, Kharwar R N, Gond S K, et al. Javanicin, an antibacterial naphthaquinone from an endophytic fungus of neem, Chloridium sp.[j]. Current Microbialogy, 2009, 58: [20] Verma V C, Gond S K, Kumar A, et al. Endophytic fungal flora from roots and fruits of an indian neem plant Azadirachta indica A. Juss., and impact of culture media on their isolation[j]. Indian Journal of Microbiology, 2011, 51(4):

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