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1 维 甲 酸 诱 导 显 性 脊 柱 裂 胎 鼠 骶 尾 部 神 经 前 # 体 细 胞 凋 亡 的 变 化 规 律 研 究 * 袁 正 伟 ( 中 国 医 科 大 学 附 属 盛 京 医 院 卫 生 部 小 儿 先 天 畸 形 重 点 实 验 室 ) 摘 要 : 神 经 管 畸 形 (Neural tube defects, NTDs) 是 最 常 见 的 严 重 中 枢 神 经 系 统 先 天 畸 形, 世 界 范 围 内 人 群 发 生 率 为 0.6 ~6, 但 目 前 尚 无 良 好 治 疗 方 法 我 们 前 期 的 研 究 表 明 神 经 元 在 NTDs 大 鼠 胚 胎 期 的 发 育 异 常, 然 而 神 经 元 发 育 损 伤 的 机 制 尚 不 明 确 本 研 究 利 用 全 反 式 维 甲 酸 诱 导 的 显 性 性 脊 柱 裂 大 鼠 模 型, 在 NTDs 发 生 早 期 ( 胚 胎 发 育 的 第 天 ), 利 用 免 疫 荧 光 染 色 检 测 脊 髓 缺 损 部 位 细 胞 凋 亡 的 变 化 结 果 显 示 NTDs 大 鼠 胚 胎 骶 尾 部 神 经 管 中 神 经 前 体 细 胞 凋 亡 增 多, 这 可 能 是 脊 柱 裂 胚 胎 神 经 元 发 育 异 常 的 主 要 原 因 之 一 关 键 词 : 医 学 遗 传 学 ; 神 经 管 畸 形 ; 细 胞 凋 亡 中 图 分 类 号 :R394.1 Altered apoptosis in developing neuroepithelium of lumbo-sacral neural tubes in spina bifida aperta in rat YUAN Zhengwei (Key Laboratory of the Health Ministry for Congenital Malformation, Shengjing Hospital, China Medical University, Shenyang ) Abstract: Neural tube defects (NTDs) are severe congenital anomalies of the central nervous system that result from incomplete neurulation, the frequency of NYDs in human is 0.6 ~6, but most of the patients who survive with NTDs still suffer from associated conditions.our previous work has demonstrated that motor and sensory neurons develop defectively in rat embryos with spina bifida aperta. In this paper, we investigated cell apoptosis and proliferation of neural progenitor cells in the spinal neural tube during neurulation in retinoic acid (atra)-induced spina bifida in fetal rats. Cell apoptosis was assessed by TUNEL assay on serially sectioned samples of rat embryos with spina bifida. We found an excess of apoptosis in the neuroepithelium of embryos with spina bifida, which became more marked as embryos progress from E11 to E13. Thus, atra-induced spina bifida in rat shows perturbed apoptosis of neural progenitors in the lumbo-sacral spinal cord during embryonic development, which might be attributed to the developmental deficit of neurons. Key words: Medical genetics; Neural tube defects; cell apoptosis 引 言 神 经 管 畸 形 (Neural tube defects, NTDs) 是 严 重 的 中 枢 神 经 系 统 先 天 性 畸 形, 世 界 范 围 内 人 群 中 的 发 病 率 高 达 [1], 但 是 目 前 尚 无 良 好 的 治 疗 方 法 下 肢 运 动 感 觉 神 经 功 能 障 碍 尿 便 失 禁 脊 椎 弯 曲 及 脑 积 水 等 依 然 是 严 重 的 术 后 神 经 后 遗 症 我 们 前 期 的 研 究 结 果 表 明 这 些 临 床 表 型 可 能 由 感 觉 运 动 神 经 元 数 目 基 金 项 目 : 高 等 学 校 博 士 学 科 点 专 项 科 研 基 金 ( 博 导 类 )( ) 作 者 简 介 : 袁 正 伟 (1964-), 男, 教 授, 主 要 研 究 方 向 : 常 见 小 儿 先 天 畸 形 胚 胎 发 生 机 制 与 早 期 诊 断 治 疗. yuanzw@hotmail.com - 1 -

2 40 减 少 导 致 [2-3] NTDs 神 经 元 发 育 异 常 的 确 切 发 生 机 制 尚 不 清 楚, 这 给 NTDs 的 早 期 针 对 性 预 防 和 治 疗 带 来 了 很 大 的 困 难 因 此, 研 究 NTDs 神 经 元 发 育 损 伤 的 胚 胎 发 生 机 制, 为 畸 形 的 早 期 诊 断 和 治 疗 提 供 理 论 依 据, 对 减 少 出 生 缺 陷, 提 高 人 口 素 质 具 有 极 其 重 要 的 意 义 神 经 管 发 育 过 程 中, 各 类 功 能 性 神 经 元 是 由 神 经 前 体 细 胞 (neural progenitor 45 cells, NPCs) 产 生 的, 而 这 一 复 杂 的 生 物 学 过 程 需 要 细 胞 增 殖 迁 移 分 化 和 凋 亡 等 一 系 列 细 胞 活 动 的 参 与 [4], 影 响 这 些 细 胞 学 机 制 的 因 素 可 能 与 NTDs 的 神 经 元 发 育 缺 损 相 关 已 有 研 究 报 道 表 明 在 atra 诱 导 产 生 的 脊 柱 裂 胎 鼠 中, 骶 尾 部 神 经 管 的 NPCs 在 胚 胎 发 育 的 晚 期 ( 从 E15.5 到 E19.5) 凋 亡 异 常 增 多 [5], 而 尾 芽 细 胞 的 凋 亡 在 atra 处 理 12 小 时 后 过 度 增 多 [6] 然 而,atRA 致 脊 柱 裂 发 生 早 期 50 胚 胎 NPCs 凋 亡 的 变 化 情 况 仍 不 清 楚 本 研 究 应 用 TUNEL 染 色 (Whole-mount terminal deoxynucleotidyl transferase (Tdt)-mediated dutp nick end labeling,whole-mount TUNEL), 利 用 atra 诱 导 产 生 的 脊 柱 裂 胎 鼠, 研 究 神 经 前 体 细 胞 凋 亡 在 畸 形 发 生 的 早 期 阶 段 (E11 到 E13) 的 变 化 规 律, 探 讨 先 天 性 脊 柱 裂 胎 鼠 神 经 元 发 育 异 常 的 机 制 55 1 材 料 与 方 法 : 1.1 实 验 材 料 全 反 式 维 甲 酸 多 聚 甲 醛 粉 末 ( 国 药 ),In Situ Cell Death Detection Kit, POD ( 原 位 细 胞 凋 亡 检 测 试 剂 盒 TUNEL)(Roche 公 司, Germany),DNA 酶 (TaKaRa 公 司, 日 本 ) 多 聚 赖 氨 酸 ( 北 京 中 杉 金 桥 公 司, 中 国 ); DAPI ( 碧 云 天 生 物 60 技 术 研 究 所, 中 国 ) 1.2 实 验 方 法 动 物 模 型 建 立 与 标 本 收 集 由 中 国 医 科 大 学 附 属 盛 京 医 院 实 验 动 物 中 心 提 供 的 成 熟 未 孕 Wistar 大 鼠, 体 重 250g 300g, 饲 养 于 温 度 为 C, 湿 度 为 50-70% 的 可 控 环 境, 雌 雄 按 5:1 比 例 午 夜 合 笼, 65 次 日 晨 8~9 时 阴 道 涂 片, 显 微 镜 下 见 到 精 子 的 当 天 记 为 胚 胎 E0(embryonic day 0),E10 天 已 孕 雌 鼠 随 机 分 为 维 甲 酸 致 畸 组 和 正 常 对 照 组 两 组 用 橄 榄 油 将 atra 溶 解 成 40mg/ml 的 混 悬 液, 维 甲 酸 致 畸 组 以 150mg/ kg 剂 量 经 胃 管 灌 入 (n=15), 对 照 组 给 予 等 体 积 的 橄 榄 油 (n=12) [7] 孕 鼠 分 别 于 E11, E12 及 E13 时 10% 水 合 氯 醛 (3ml/kg) 腹 腔 注 射 麻 醉, 剖 腹 取 出 子 宫, 快 速 置 于 冰 的 磷 酸 盐 缓 冲 液 中 (phosphate buffered saline, PBS, ph 7.4), 于 体 式 - 2 -

3 70 显 微 镜 下 小 心 剥 离 出 胚 胎, 观 察 胚 胎 生 长 及 畸 形 情 况 胚 胎 置 于 4% 的 多 聚 甲 醛 中 4 C 固 定 过 夜, 选 择 体 节 对 数 分 别 为 22-24, 30-32, 的 E11, E12 及 E13 胚 胎 进 行 细 胞 凋 亡 及 细 胞 增 殖 染 色 石 蜡 切 片 胚 胎 经 4% 多 聚 甲 醛 固 定 后, 进 行 脱 水, 蜡 块 包 埋 :70% 乙 醇 20min 80% 乙 醇 75 20min 90% 乙 醇 20min 100% 乙 醇 30min 100% 乙 醇 30min 100% 乙 醇 / 二 甲 苯 (1:1) 10min 二 甲 苯 10min 2 二 甲 苯 / 石 蜡 (1:1)60 C, 5min 石 蜡,60 C, 40min 石 蜡 包 埋, 4.5µm 切 片 切 片 TUNEL 染 色 (1) 选 取 骶 尾 部 神 经 管 切 片, 脱 蜡 复 水,PBS, 5min 3 80 (2) 抗 原 修 复 及 细 胞 通 透 : 切 片 滴 加 15μg/ml 蛋 白 酶 K,37,8min,PBST, 5min 3, 含 0.1% 曲 拉 通 x-100 的 10 mm 柠 檬 酸 钠 缓 冲 液 冰 浴 10min,PBST, 5min 3 (3)DNA 片 段 标 记 :TUNEL 反 应 液 ( 同 全 胚 胎 TUNEL) 滴 加 到 切 片 上,37 C, 避 光 反 应 1.5h,PBS, 5min 3 阳 性 对 照 与 阴 性 对 照 同 全 胚 胎 TUNEL (4)DAPI 复 染 : 滴 加 DAPI(1:1000), 避 光,5min 85 (5) 图 像 采 集 :C1 共 聚 焦 显 微 镜 采 集 染 色 结 果 数 据 统 计 分 析 分 别 计 数 脊 柱 裂 组 和 对 照 组 不 同 胚 胎 发 育 期 骶 尾 部 神 经 管 内 NPCs 总 数 TUNEL 阳 性 细 胞 数, 计 算 NPCs 中 TUNEL 阳 性 率, 数 据 以 均 数 ± 标 准 差 表 示 采 用 SPSS13.0 软 件 对 实 验 数 据 进 行 t 检 验 和 SNK-q 检 验, 以 P 值 表 示 统 计 差 异,P<0.05 认 为 差 异 有 统 计 学 意 义 90 2 结 果 2.1 骶 尾 部 脊 柱 裂 大 鼠 模 型 维 甲 酸 致 畸 组 于 不 同 胚 胎 发 育 期 (E11, E12, E13) 共 获 得 胎 鼠 135 只, 其 中 死 胎 或 吸 收 胎 发 生 率 11%(15/135), 骶 尾 部 显 性 脊 柱 裂 49%(66/135), 另 外 无 尾 或 短 尾 畸 形 发 生 率 为 100% 正 常 对 照 组 共 剖 出 胚 胎 132 只, 均 未 见 上 述 畸 形 ( 图 95 1) - 3 -

4 中国科技论文在线 图 1 E12正常胎鼠和脊柱裂胎鼠骶尾部神经管形态对比图 A为E12正常对照组胎鼠 B为脊柱裂胎鼠动物 模型 箭头所指为尾部脊柱裂 Fig. 1 Rat embryos on E12 obtained from atra-treated and normal pregnancies TUNEL染色检测细胞凋亡的研究结果 骶尾部神经管切片TUNEL染色显示 E11与E12胚胎中 凋亡的NPCs主要集 中在神经管的背部中线处 而在E13胚胎中 细胞凋亡在神经管背腹侧均匀分布 在E11, E12和E13正常胚胎中 NPCs的凋亡率随着胚胎发育逐渐升高 而脊柱裂 105 组胚胎畸形发生部位的NPCs的凋亡率明显高于正常对照组 E11: 2.02±0.52% vs. 0.57± 0.23%, P<0.001; E12: 3.56±0.33% vs. 0.93±0.14%, P<0.001; E13: 3.76±0.37% vs. 1.24±0.21%, P<0.001; 图2 A-G 并且细胞凋亡的异常增多在E12胚胎中表现 更为明显 -4-

5 图 2 E11, E12 和 E13 脊 柱 裂 胚 胎 与 正 常 胚 胎 骶 尾 部 神 经 管 切 片 TUNEL 染 色 结 果 A, C, E 图 分 别 为 E11, E12, E13 脊 柱 裂 胚 胎 骶 尾 部 神 经 管 ;B, D, F 分 别 为 E11, E12, E13 正 常 对 照 胚 胎 骶 尾 部 神 经 管 ;G 图 为 声 长 足 和 脊 柱 裂 组 胚 胎 骶 尾 部 神 经 管 神 经 上 皮 细 胞 随 胚 胎 发 育 变 化 的 折 线 图 箭 头 所 指 为 TUNEL 阳 性 细 胞 DM, 生 皮 节 ; NT: 神 经 管 ;SCL: 生 骨 节 Fig. 2 Spatiotemporal analysis of apoptosis in rat embryos. TUNEL staining of embryos at E11, E12 and E13. 3 结 论 本 文 发 现 在 胚 胎 发 育 的 第 11 到 第 13 天,atRA 诱 导 的 脊 柱 裂 大 鼠 胚 胎 中 骶 尾 部 NPCs 凋 亡 增 多 因 此, 在 脊 柱 裂 大 鼠 胚 胎 发 育 过 程 中, 骶 尾 部 神 经 管 的 NPCs 的 增 殖 出 现 异 常, 这 可 能 在 NTDs 的 发 生 及 神 经 元 发 育 不 良 中 起 着 重 要 的 作 用 120 脊 柱 裂 胚 胎 中, 骶 尾 部 神 经 上 皮 的 过 度 凋 亡 在 E12 时 更 加 明 显 ( 图. 2G) 提 示 E12 胚 胎 的 NPCs 对 于 atra 的 毒 性 效 应 更 加 敏 感 然 而 在 本 论 文 中,atRA 作 用 后, NPCs 凋 亡 异 常 开 始 及 到 达 峰 值 的 时 间 点 仍 未 确 定, 这 需 要 在 更 早 及 更 晚 的 胚 胎 发 育 阶 段 进 行 进 一 步 的 研 究 [ 参 考 文 献 ] (References) [1] HTMolloy AMTH, HTKappen CTH. Papers from the 7th International Neural Tube Defects Conference[J]. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol,2012, 94(10): [2] Guan KP, Li H, Fan Y, et al. Defective development of sensory neurons innervating the levator ani muscle in fetal rats with anorectal malformation[j]. Birth Defects Rese A: Clin Mol Teratol, 2009, 85(7): [3] Yuan ZW, Lui VC, Tam PK. Deficient motor innervation of the sphincter mechanism in fetal rats with anorectal malformation: a quantitative study by fluorogold retrograde tracing[j]. J Pediatr Surg, 2003, 38(9): [4] Copp AJ, Brook FA, Estibeiro JP, et al. The embryonic development of mammalian neural tube defects[j]. Prog Neurobiol, 1990, 35: [5] Meuli M, Meuli-Simmen C, Hutchins GM, et al. In utero surgery rescues neurological function at birth in sheep with spina bifida[j]. Nat Med. 1995, 1(4): [6] Zhao JJ1, Sun DG, Wang J, et al. Retinoic acid downregulates micrornas to induce abnormal development of spinal cord in spina bifida rat model[j]. Childs Nerv Syst. 2008, 24(4): [7] Cai W, Zhao H, Guo J, et al. Retinoic acid-induced lumbosacral neural tube defects: myeloschisis and hamartoma[j]. Childs Nerv Syst, 2007, 23:

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