标题

Size: px

Start display at page:

Download "标题"

牛陈
4 years ago
Views:

1 第 15 卷第 4 期 17 年 7 月生物加工过程 Chinese Journal of Bioprocess Engineering Vol 15 No 4 Jul. 17 doi: 3969 / j issn 液质联用检测果蔬中阿维菌素甲维盐的残留朱丽清 1, 陈泳 2, 冷波 1 1, 潘裕添 (1 闽南师范大学菌物产业工程技术中心, 福建漳州 ; 2 漳州出入境检验检疫局, 福建漳州 ) 摘要 : 建立利用分散固相萃取高效液相色谱串联质谱法 (QuEChERS LC / MS / MS) 同时测定蔬菜和水果中阿维菌素和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐 ( 甲维盐 ) 残留的方法均质样品经过醋酸乙腈提取, 由 N 丙基乙二胺 (PSA) 吸附剂分散固相萃取净化后, 利用液相色谱串联质谱分离测定, 并对质谱条件进行优化结果表明 : 碰撞气 Pa 气帘气 Pa 雾化气 Pa 辅助加热气 Pa 离子喷雾电压 V 以及去溶剂温度 300 时, 检测灵敏度最高对 3 种蔬菜和水果样品中添加阿维菌素和甲维盐, 进行 2 个水平的加标回收试验, 每个水平重复 6 次,3 种样品的平均回收率范围为 81 3 ~ 112 9, 相对标准偏差为 ~ , 达到技术标准要求该方法被证实是稳定高效的, 可适用于多种蔬菜水果中阿维菌素和甲维盐的测定关键词 : 分散固相萃取高效液相色谱串联质谱 ; 阿维菌素 ; 甲维盐 ; 农产品检测中图分类号 :TS255 7 文献标识码 :A 文章编号 : (17) Determination of avermectin and emamectin residues in vegetables and fruits by QuEChERS LC / MS / MS ZHU Liqing 1,CHEN Yong 2,LENG Bo 1,PAN Yutian 1 (1. The Engineering Technological Center of Mushroom Industry,Minnan Normal University,Zhangzhou ,China; 2. Zhangzhou Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau,Zhangzhou ,China) Abstract:We developed a method to determine avermectin and emamectin residues in vegetables and fruits by QuEChERS LC / MS / MS. Samples were extracted by acetonitril with 1 acetate, followed by purifying with dispersive solid phase extraction using PSA. Avermectin and emamectin in samples were determined by LC / MS / MS. The conditions of mass spectrometry was optimized as following: CAD at Pa,CUR at Pa,GS1 (nebulizer gas) at Pa,GS2 (heater gas) at Pa,IS (ion spray voltage) at V,and TEM at 300. Avermectin and emamectin in two levels were spiked into 3 vegetables or fruits and determined (6 replicates of each level). The average recovery ranged from 81 3 to 112 9, the precisions ( RSD) from to , meeting the requirements of technical standards. This method was proved to be robust,efficient and competent to determine avermectin and emamectin residues in fruits and vegetables. Keywords:QuEChERS LC / MS / MS; avermectin; emamectin; detection of agricultural products 阿维菌素是一类具有杀虫杀线虫活性的十六元大环内酯化合物, 而甲氨基阿维菌素苯甲酸盐收稿日期 :16-- 作者简介 : 朱丽清 (1991 ), 女, 福建龙岩人, 研究方向 : 化学生物学 ; 潘裕添 ( 联系人 ), 教授,E mail:xmpyt@ sina.com

2 第 4 期朱丽清等 : 液质联用检测果蔬中阿维菌素甲维盐的残留 29 ( 甲维盐 ) 是以阿维菌素为原料经过结构修饰而得到的一种高效生物杀虫剂 [1] 因为它独特的致毒机理, 使甲维盐成为高效广谱的新型抗生素类的杀虫剂, 同时, 由于甲维盐对线虫与节肢动物驱杀效果显著, 已被广泛应用于果蔬虫害的防治 [2-4], 属于一种高效低毒生物杀虫剂 [5] 欧盟规定最大残留限量值为 0 01 mg / kg, 我国规定最大残留限量值为 0 02 ~ 0 05 mg / kg [6] 分散固相萃取 (QuEChERS) 技术是由美国学者于 02 年提出的农药残留快速提取的方法 [7] 它能提供高质量的农药残留分析, 是一种快速简洁低成本的前处理方法, 最近几年来发展迅速经多方研究学者反复多次实验证实 QuEChERS 法可检测 0 多种农药, 其中包括含有脂肪的介质体系 [8-] QuEchERS 法的主要步骤是 : 样品在传统萃取液乙腈中添加 1 醋酸后进行浸提, 混匀后加入无水 MgSO 4 和醋酸钠, 充分振荡促使其分层, 再将浸提液移到吸附剂 (PSA) MgSO 4 的离心管后进行离心, 将离心上清液通过 GC / MS( 气质联用 ) 或 LC / MS 进行测定本文中采用分散固相萃取高效液相色谱串联质谱法, 以创建可以同时测定果蔬中阿维菌素和甲维盐的方法, 以期能适用于果蔬中阿维菌素和甲维盐的检测 1 材料与方法 1 1 仪器材料与试剂 API 4000 四极杆串联质谱仪, 美国 AB 公司 ; 10 Series 液相色谱仪, 美国 Agilent 公司 ;T25 型高速分散机, 德国 IKA 公司 ;3 30K 型高速冷冻离心机,Sigma 公司 ;QT 2 型旋涡混合器, 上海琪特分析仪器有限公司 ; MilliQ 高纯水发生器, 美国 Millipore 公司 ; XP4 型分析天平 ( 可读性 0 1 mg), 瑞士 Mettler 公司毛豆白花菜和蜜柚 3 种待测样品, 市售阿维菌素和甲维盐标准品 ( 纯度均为 99), Sigma Aldrich 公司 ; 甲酸 ( 色谱纯 ), 美国 Fluka 公司 ; 无水 MgSO 4 无水醋酸钠( 优质纯 ), 美国 Waters 公司 ; 乙腈 ( 色谱纯 ), 德国 Merck 公司 ; 乙二胺 N 丙基硅烷吸附剂 (PSA, 粒径 40 μm), 美国 Waters 公司 ; 实验用水均为高纯水试剂配制单一标准工作液的配制分别精密称取阿维菌素 g 甲维盐 g 标准品于不同的 50 ml 容量瓶中, 用乙腈定容, 避光保存, 待用该溶液可在 0 ~ 4 存放 6 个月, 质量浓度分别为 402 和 416 μg / ml 混合标准工作液的配制分别准确移取上述的 2 个单标储备液 μl 于 50 ml 的容量瓶, 采用乙腈定容, 稀释成 1 μg / ml 的混合标准工作液, 用于添加回收实验和制备标准溶液系列,4 条件下避光保存基质匹配溶液的配制基质匹配溶液的配制情况见表 1 Table 1 ρ( 基质匹配溶液 ) / (ng ml -1 ) 表 1 基质匹配溶液配制 Matrix matching solution preparation V( 阿维菌素或甲维盐溶液 ) / μl V( 基质溶液 ) / μl V( 乙腈 ) / μl 方法制样分别取毛豆白花菜和蜜柚 3 种待测样品 500 g, 使用组织捣碎机捣碎均匀, 放入洁净的盛样袋内, 密封后标明标记将待测样于 -4 条件下冰箱冷冻保藏提取及净化准确称取 00 g 搅碎后的待测样品, 精确至 0 01 g, 放入 50 ml 离心管中, 加 19 8 ml 乙腈,0 2 ml 醋酸, 再加入 1 5 g 无水醋酸钠和 6 g 无水 MgSO 4, 用均质器以 r / min 高速均质 1 min 后, 以 r / min 离心 5 min 取 6 ml 上层乙腈提取液于装有 900 mg 无水 MgSO 4 和 150 mg PSA 的离心管中, 旋涡混合 1 min 后, 以 r / min 离心 5 min, 取 0 75 ml 上清液与水 1 1 体积比混合均匀经 0 2 μm 微孔滤膜过滤, 待测 [11]

3 30 生物加工过程第 15 卷优化质谱参数对气帘气 ( CUR) 雾化气 ( GS1) 辅助加热气 (GS2) 离子喷雾电压 (IS) 去溶剂温度 (TEM) 和调节碰撞气 (CAD)6 个参数分别进行优化, 即改变其中 1 个参数时, 其他 5 个参数不变, 最终选择信号最佳时的参数值为该参数的优化值仪器条件 HPLC 条件色谱柱 CORTECS C18(0 mm 2 1 mm,2 7 μm), 柱温为 35, 进样量为 μl Table 2 总时间 / min 表 2 梯度洗脱流动相及流速 Gradient elution mobile phase and flow rate 流速 / (μl min -1 ) φ( 水 1 ) / φ( 乙腈 ) / 注 :1 含 0 1 甲酸及 5 mmol / L 的醋酸铵 MS / MS 条件电喷雾离子源 ( ESI), 离子喷雾电压 V; 气帘气流速 15 ml / min; 雾化器流速 50 ml / min; 碰撞气 ( N 2 ) 流速 5 ml / min; 辅助加热气流速 25 ml / min; 去溶剂温度 300 ; 正离子模式 ; 动态多反应监测 ( Dynamic MRM) 方法采集, 质谱采集速率 0 ms / 转, 其他参数见表 3 Table 3 表 3 目标化合物阿维菌素和甲维盐的母离子子离子及碰撞能量和去簇电压 Avermectin and emamectin s mother ion,subion, impact energy and cluster voltage 母离子 m / z 阿维菌素甲维盐注 :2 为选择的子离 2 对 2 结果与讨论 2 1 质谱条件的优化子离子 m / z ) ) 81 6 碰撞能 / ev 去簇电压 / V ESI 离子源为软电离方式, 阿维菌素和甲维盐在 ESI 离子源内与 H + + NH 4 等结合形成准分子离子峰因为甲氨基阿维菌素在自然界不稳定, 经过化学修饰后是以甲维盐的形式相对稳定存在, 甲维盐分子量为 [12] 本实验对标准品甲维盐进行了母离子扫描 ( MS scan) 获得了一级质谱图, 在扫描图里没有发现 [ M+H] ( m / z 为 ) 的离子峰, 这是由于甲维盐在水介质中已经完全解离成甲氨基阿维菌素 (C 19 H 75 NO 13, 分子量为 886 4) 与苯甲酸盐 ( C 7 H 6 O 2, 分子量为 122), 因此本实验是以甲氨基阿维菌素为检测目标甲氨基阿维菌素是以准分子离子峰 [ M C 7 H 5 O 2 +H] ( m / z 为 886 4) 的形式存在实验对阿维菌素也进行了母离子扫描 (MS scan) 获得一级质谱图, 得知阿维菌素的准分子离子峰为 [M+NH + 4 ] (m / z 为 890 6) 离子源去溶剂气体温度离子喷雾电压等因素对阿维菌素和甲维盐的离子加合物形态有较大的影响, 为此本实验通过优化了去溶剂气温度离子喷雾电压等参数, 为使母离子强度达到最高, 结果见图 1 由图 1(a) 可知, 当碰撞气 ( CAD) 选择 Pa 时, 阿维菌素和甲维盐的检出信号最高由图 1 (b) 可知, 当气帘气 (CUR) 选择 Pa 时, 阿维菌素和甲维盐的检出信号最高由图 1(c) 可知, 当雾化气 (GS1) 选择 Pa 时, 阿维菌素和甲维盐的检出信号最强由图 1( d) 可知, 对于甲维盐, 当离子喷雾电压 (IS) 为 V 时, 其信号值最高, 但是阿维菌素的信号值却是在 IS 为 V 时最高由于甲维盐在 IS 为 V 时的信号值与 V 时的信号值相差不大, 而阿维菌素却有显著差异, 综合考虑, 实验最终选择了 IS 为 V 由图 1(e) 可知, 当去溶剂温度 ( TEM) 为 0 时, 阿维菌素的信号值最高, 但甲维盐的信号值却最低, 综合考虑到两种物质的检出信号, 实验最终选择 TEM 为 300, 虽然这个时候两种物质信号值均不是最高, 但是跟最大值的差距不大由图 1(f) 可知, 当辅助加热气 (GS2) 选择 Pa 时, 阿维菌素和甲维盐的检出信号最高由图 1 可得最优参数组合为 CAD 为 Pa,CUR 为 Pa,GS1 为 Pa, IS 为 V,TEM 为 300,GS2 为 Pa

4 第 4 期朱丽清等 : 液质联用检测果蔬中阿维菌素甲维盐的残留线性范围与检出限对空白毛豆白花菜和蜜柚进行基质配标, 制得不同浓度的 5 种阿维菌素混合标准溶液, 按本实验方法进行测定, 以 3 倍空白基质信噪比计算出方法的检出限, 以倍信噪比计算方法定量下限阿维菌素检出限为 0 4 μg / kg, 甲维盐的检出限为 0 9 μg / kg 分别以各化合物定量离子的峰面积对浓度绘制标准曲线, 得到阿维菌素和甲维盐的回归方程线性范围及相关系数 (r), 见表 4 由表 4 可知, 在各自的定量下限至 0 μg / L 时, 目标物的峰面积 (Y) 与其质量浓度的线性关系良好, r 均达到以上图 1 Fig 1 碰撞气 (CAD), 气帘气 (CUR), 雾化气 (GS1), 去溶剂温度 (TEM), 离子喷雾电压 (IS) 和辅助加热气 (GS2) 对阿维菌素和甲维盐检出信号的影响 Effects of CAD,CUR,GS1,TEM,IS and GS2 for avermectin and emamectin detection signal 表 4 阿维菌素和甲维盐的线性方程相关系数 (r) 检出限和定量下限 Table 4 Avermectin and emamectin s linear equation,correlation coefficient( r), idetection limit and quantification offline 样品指标线性范围 / (μg L -1 ) 线性方程 r 检出限 / 定量下限 / 毛豆阿维菌素甲维盐 1 0~ 0 3 0~ 0 Y = x+29 4 Y = x 白花菜蜜柚阿维菌素甲维盐阿维菌素甲维盐 1 5~ 0 3 0~ 0 0 7~ 0 3 0~ 0 Y = x+8 41 Y = x+421 Y = x+65 7 Y = x

5 32 生物加工过程第 15 卷 2 3 本方法的平均回收率与精密度以毛豆白花菜和蜜柚 3 种果蔬作为空白基质 ~ 图 2 为 2 种化合物在白花菜中 μg / kg 添加进行了 2 个水平的加标回收实验 (n = 6), 它们的添加水平均为 μg / kg, 平均回收率和精密度结果见表 5 由表 5 可知, 阿维菌素和甲维盐的平均回收率为 81 3 ~ 112 9, 相对标准偏差 ( RSD) 为水平的提取离子色谱图由图 2 可以看出, 空白样品的背景并未干扰到目标分析物的测定, 并不影响实际样品中阿维菌素和甲维盐的定性和定量分析表 5 阿维菌素和甲维盐在水果蔬菜中的平均回收率和相对标准偏差 (n = 6) Table 5 Avermectin and emamectin in fruits,vegetables,standard addition recoveries and relative standard deviation (n = 6) 项目甲维盐样品毛豆蜜柚白花菜加入量 / 检出量 / 平均回收率 / 相对标准偏差 / 阿维菌素毛豆蜜柚白花菜图 2 甲维盐的白花菜基质匹配标准溶液 ( μg / kg) 的提取离子色谱 Fig 2 Extracted ion chromatogram of a matrix matched standard solution at μg / kg prepared in cleome for emamectin and avermectin 3 结论采用乙腈高速匀浆提取样品, PSA 吸附剂净化, 于加热电喷雾离子源正离子模式采集三重四级杆质谱仪选择性反应监测下, 对果蔬中阿维菌素和甲维盐药物残留进行测定对质谱条件进行优

6 第 4 期朱丽清等 : 液质联用检测果蔬中阿维菌素甲维盐的残留 33 化, 结果表明, 碰撞气 Pa 气帘气 Pa 雾化气 Pa 辅助加热气 Pa 离子喷雾电压 V 去溶剂温度 300 时检测灵敏度最高在对 3 种蔬菜和水果样品中添加阿维菌素和甲维盐, 进行 2 个水平的加标回收试验, 每个水平重复 6 次,3 种样品的平均回收率范围达到 81 3 ~ 112 9, 相对标准偏差为 ~ 该方法前处理简便, 灵敏度准确度和精密度均高, 各种指标符合残留监测的相关要求, 可用于果蔬中阿维菌素和甲维盐的检测参考文献 : [ 1 ] 马海芹, 丁佩. 阿维菌素的研究应用存在问题及对策 [ J]. 农药科学与管理,09,30(): 23. [ 2 ] 刘淼. 阿维菌素防治茄子 ( 保护地 ) 红蜘蛛技术试验报告 [ J]. 农民致富之友,16(2):169. [ 3 ] 刘文斌, 黄宗福, 郑纪良, 等.5 甲维盐水分散粒剂防治水稻稻纵卷叶螟的效果研究 [J]. 现代农业科技,15():93. [ 4 ] 王龙, 贾变桃. 阿维菌素与毒死蜱混用对小菜蛾的增效作用 [J]. 山西农业科学,16,44(3): [ 5 ] 陈金松, 刘梅, 张立新, 等. 从阿维菌素获得诺贝尔奖到中国创造 [J]. 微生物学报,16,56(3): [ 6 ] 吴宇宽, 赵静, 高进, 等. 高效液相色谱串联质谱法检测蔬菜水果中阿维菌素甲维盐残留 [J]. 湖北大学学报 ( 自然科学版 ),13,35(4): [ 7 ] ANASTASSIADES M, LEHOTAY S J, STAJNBAHER D, et al. Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction / partitioning and " dispersive solid phase extraction" for the determination of pesticide residues in produce[ J]. J AOAC Int,03,86(2): [ 8 ] LEHOTAY S J,DE K A,HIEMSTRA M,et al.validation of a fast and easy method for the determination of residues from 229 pesticides in fruits and vegetables using gas and liquid chromatography and mass spectrometric detection [ J]. J AOAC Int,05,88(2): [ 9 ] MASTOVSKA S,YU S. Evaluation of two fast and easy methods for pesticide residue analysis in fatty food matrices[ J]. J AOAC Int,05,88(2): [] 王连珠, 周昱, 陈泳, 等.QuEChERS 样品前处理液相色谱串联质谱法测定蔬菜中 66 种有机磷农药残留量方法评估 [ J]. 色谱,12,30(2): [11] 王连珠, 周昱, 黄小燕, 等. 基于 QUEChERS 提取方法优化的掖棺色谱串联质谱法测定蔬菜中 51 种氨基甲酸酯类农药残留 [J]. 色谱,13,31: [12] 李增梅, 赵善仓, 梁京芸, 等. 超高效液相色谱串联质谱法测定水稻田中甲氨基阿维菌素苯甲酸盐的残留量 [ J]. 分析测试学报,14,33(1): ( 责任编辑周晓薇 )

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.