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1 Vol.9 No 年 5 月 May 2016 空肠弯曲杆菌 Cj0448c 缺失突变体的构建郝海红, 胡 * 博, 刘振利, 袁宗辉 ( 华中农业大学动物医学学院, 武汉 ) 摘要 : 空肠弯曲杆菌 (Campylobacter jejuni) 是一种广泛存在的人畜共患的病原菌, 其耐药性问题引起了世界的广泛关注前期研究通过基因芯片方法, 发现一种假定的信号转导基因 Cj0448c 在中高水平大环内酯类耐药空肠弯曲杆菌中下调表达为探究 Cj0448c 对空肠弯曲杆菌耐药性和毒力的影响, 以 C. jejuni NCTC1168 为空白菌, 首先应用体外诱导方法, 获得了大环内酯类耐药突变菌 ; 再应用插入失活技术成功构建了 Cj0448c 的缺失突变体本研究将为进一步验证该基因的功能和分析该基因的调控机制奠定基础关键词 : 兽医药理学 ; 空肠弯曲杆菌 ; 耐药性 ;Cj0448c; 基因敲除中图分类号 :S859.7 文献标识码 :A 文章编号 : (2016) Establishment of Cj0448c mutant in Campylobacter jejuni HAO Haihong, HU Bo, LIU Zhenli, YUAN Zonghui (College of Veterinary Medicine, Huazhong Agricultural University, Wuhan , China) Abstract: Campylobacter jejuni is one of a leading zoonotic pathogen. The antibiotic resistance of this pathogen has raised the world concern. In the previous study, the microarray assay indicated that Cj0448c was down-regulated in the intermediate-to-high level of macrolide resistant C. jejuni. The aim of this study was to investigate the role of this gene on the resistance and virulence. In the present study, C. jejuni NCTC1168 was used as the reference strain, the macrolide resistant mutant was obtained by exposure of the reference strain to increased concentration of erythromycin. The Cj0448c deletion mutant was constructed via insertional inactivation. The result of this study can provide a basis for further study on the function and regulation mechanism of this gene. Key words: veterinary pharmacology; Campylobacter jejuni; antibiotics resistance; Cj0448c; gene knock out 0 引言弯曲菌属 (Campylobacter) 是一种人畜共患病原菌, 可导致人类及畜禽的多种疾病, 包括细菌性腹泻胃肠炎格林 - 巴利综合症米勒 - 费歇尔综合症等多种疾病 [1] 其中空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni) 可寄生在空肠回肠或结肠, 在全世界普遍被认为是引起肠道感染的主要原因 [2] 近年来, 由于抗菌药物的广泛使用, 细菌耐药问题日益严重, 空肠弯曲杆菌对抗生素耐药性引起全世界的广泛关注 [3] 目前已经发现多种耐药菌株 [4], 对阐明空肠弯曲杆菌的耐药机制尤为重要前期研究显示,Cj0448c 在中高水平大环内酯类耐药空肠弯曲杆菌中下调表达, 其基因功能注释显示该基因是一种假定的信号转导基因, 因此推测该基因可能对空肠弯曲杆菌的耐药性和毒力具有重要作用 [5] 有文献报道空肠弯曲杆菌中 Cj0448c 的表达与适应低氧环境有关 [6], 但是目前此基因对耐药性的影响机制所知甚少为研究空肠弯曲杆菌中 Cj0448c 对空肠弯曲杆菌耐药性和毒力的影响, 通过构建 Cj0448c 缺失突变基金项目 : 高等学校博士学科点专项科研基金 ( 新教师基金 )( ) 作者简介 : 郝海红 (1981 ), 女, 副教授, 主要研究方向 : 细菌耐药性. haohaihong@mail.hzau.edu.cn

2 2016 年 5 月中国科技论文在线精品论文 962 体, 将 Cj0448c 基因从野生菌株中敲除, 为后续探究该基因的功能奠定基础 1 材料与方法 1.1 菌株空肠弯曲杆菌 NCTC11168 由实验室保存, 源于中国疾病控制中心 ; 红霉素耐药空肠弯曲菌株 CR, 本次实验中诱导获得, 可对红霉素产生稳定的耐药性 ; 大肠杆菌 DH5α 感受态细胞, 购于北京全式金生物技术有限公司 ; 转化缺失突变载体的敏感空肠弯曲杆菌株 CP-N, 本次实验诱导 1.2 耐药空肠弯曲杆菌的诱导本实验室保存有空肠弯曲杆菌 11168, 通过红霉素的压力筛选可以筛选出对红霉素耐药的菌株将菌种从冰箱取出复苏后, 于 N 2 85% CO 2 10% O 2 5% 条件下培养培养基 :MH 肉汤培养基,10 ml 细菌瓶中培养, 瓶盖拧松以方便气体交换以培养基中红霉素浓度 1 mg/l 为 1 单位浓度,48 h 为一个诱导周期每隔 48 h 传一代, 红霉素浓度依次为 1 单位浓度,2 单位浓度,4 单位浓度,,2 N 单位浓度每传一代需测定一次最小抑菌浓度 (minimal inhibitory concentration,mic), 以 MIC 为标准确定下一代的浓度是否增加,MIC 测定方法为微量肉汤稀释法 (M100-S19,2009) 待菌株对红霉素耐药浓度达到 64 单位浓度, 且在无抗生素条件下反复传代, 耐药性保持稳定的情况下, 对菌株 32sRNA V 区 A2074C/A2075G 位点突变进行测定, 出现突变位点说明已经筛选到对红霉素耐药菌株 1.3 引物设计从 NCBI 找到登录的 Cj0448c 基因序列 (gi: ) 通过 NEB cutter 软件分析基因内酶切位点, 同时结合 PUC19 质粒图谱, 可以找到酶切位点 PstΙ XbaI KpnI EcoRI. 由于这四种酶可以共用 TaKaRa 公司的 1 M 缓冲液, 故采用这四种酶可以便于双酶切反应根据基因序列酶切位点和所加保护碱基可以设计三对引物 : 一对引物扩增 Cj0448c 上游基因, 插入到 PstI 和 XbaI 之间 ; 一对扩增 Cj0448c 下游基因, 插入到 KpnI 和 EcoRI 之间 ; 另一对引物扩增抗性片断卡那霉素抗性 Km R 基因, 插入到 XbaI 和 KpnI 之间 ( 如表 1 所示 ) 引物设计采用 Primer Premier 5.0 软件, 根据基因位置及同源臂找到所需的最优引物序列其中, 卡那霉素抗性基因引物由于本实验室已有合成, 故没有再行设计合成引物合成后需要先于 r/min 离心, 后进行稀释, 长期保存需分装置于 20, 短期保存置于 4. Tab. 1 表 1 PCR 引物 Primers designed for PCR 引物名称引物序列酶切位点 Cj0448c-PstΙ-F1 5'-AACTGCAGAAATCACAGGCAAGGGTC-3' PstI Cj0448c-XbaΙ-R1 5'-GCTCTAGATTTTGAAGATCAGAATGG-3' XbaI Cj0448c-KpnΙ-F2 5'-CGGGGTACCATTAGAACAAGCGGCT-3' KpnI Cj0448c-EcoRΙ-R2 5'-CGGAATTCTCTGAAGCGATACCAACT-3' EcoRI Km R -XbaΙ-F1 5'-GCTCTAGAAATGGGCAAAGCAT-3' XbaI Km R -KpnΙ-R2 5'-GGGGTACCATAATGCTAAGACAAT-3' KpnI 1.4 卡那霉素基因及 Cj0448c 基因片段克隆在 PCR 反应过程中短片段 (Cj0448c 基因上下游片段 ; 分别为 626 bp 和 621 bp) 采用纯 pfu 酶扩增,

3 Vol.9 No.9 May 2016 郝海红等 : 空肠弯曲杆菌 Cj0448c 缺失突变体的构建 963 以保证短片段的扩增正确率两短基因扩增的 PCR 程序为 :95 2 min,95 30 s,56 30 s,72 1 min, 30 个循环 ;72 10 min. 长片段 ( 卡那霉素抗性基因 ;1 202 bp) 采用 pfu:taq=4:1 进行扩增, 长片段基因扩增的 PCR 程序为 :95 2 min;95 30 s,55 30 s,72 2 min,30 个循环 ;72 10 min. PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳后用胶回收试剂盒进行回收, 片段大小无误后测量浓度, 于 20 保存 1.5 缺失突变载体的构建本实验采用 PUC19 质粒作为基因载体, 将 PUC19 质粒转化进 DH5α 菌株中进行扩增, 提取质粒进行酶切, 琼脂糖凝胶电泳检测无误后作为备用质粒每一段基因连接前均需要进行双酶切, 酶切体系 : 10 M buffer 4 μl;a 酶 3 μl;b 酶 3 μl;dna 30 μl. 酶切后需要进行胶回收, 再与经处理的载体进行连接连接体系 :10 T4 连接酶缓冲液 1 μl; 目的基因片段 4 μl; 质粒 PUC19 4 μl;t4 连接酶 1 μl. 采用此方法进行第一段基因即 Cj0448c 上段基因的载体连接由于连接效率问题, 故未按照上述方法继续进行后面两个片段的连接而是将后面两个片段先连接后作为模板进行 PCR 扩增, 经双酶切后再与上面获得的载体进行连接连接体系 :10 T4 连接酶缓冲液 1 μl;cj0448c 下段基因 4 μl; 卡那霉素抗性基因 4 μl;t4 连接酶 1 μl. PCR 扩增酶 pfu:taq=4:1, 直接以连接产物作为 PCR 反应模板, 程序 :95 2 min;95 30 s,53 30 s,72 3 min,30 个循环 ;72 10 min. 将此复合基因与前期所得载体连接至此获得含有 Cj0448c 与卡那霉素抗性基因复合基因的载体扩增后将此质粒进行多段双酶切, 验证无误后将此载体送至 Invitrogen 公司测序, 经图 1 PUC-CK 质粒图谱 Fig. 1 Plasmid profile of PUC-CK 比对无误后命名重组质粒为 PUC-CK( 如图 1 所示 ). 1.6 缺失突变载体转化空肠弯曲杆菌前期实验已经获得对红霉素稳定耐药的空肠弯曲杆菌菌株 CR, 和原始菌株一起共有两株菌种, 即红霉素耐药菌和敏感菌根据同源重组原理, 将前面构建所得的 PUC-CK 质粒转化进空肠弯曲杆菌感受态细胞中, 即可将 Cj0448c 基因失活, 同时菌种获得卡那霉素抗性 2 结果与分析 2.1 基因片段克隆结果 Cj0448c 基因经 PCR 扩增后获得两段基因片段 ( 如图 2 所示 ), 大小分别为 626 bp(1) 和 621 bp(2), 卡那霉素抗性基因大小 bp( 如图 3 所示 ),PCR 扩增结果与预期相符 2.2 PUC-CK 质粒构建结果质粒构建成功后以 EcoRI 进行单酶切验证 ( 如图 4 所示 ), 经验证的 4 个样品中,1 号 2 号 4 号样品大小符合 bp. 然后将质粒进行双酶切验证 ( 如图 5 所示 ), 双酶切组合为 1:PstI+XbaI,2: XbaI+KpnI,3:KpnI+EcoRI, 预期结果分别为 1:626 bp bp;2:1 202 bp bp;3:621 bp bp, 经验证和预期结果一致, 表示 PUC-CK 质粒构建与预期一致

2016 年 5 月中国科技论文在线精品论文 964 图 2 Cj0448c 基因 PCR 扩增结果图 3 Km R 基因 PCR

3 PCR product of Km R 图 4 重组 PUC-CK EcoRI 酶切鉴定 Fig.

2.3 空肠弯曲杆菌转化实验结果经过多次转化, 仅在红霉素敏感菌中筛选到转化 PUC-CK 的菌株而在本实验所做的多次重组转化质粒,

), 并可以表现出对卡那霉素和氨苄西林的双重抗性, 表明质粒已经转染进该菌株 2.

4 2016 年 5 月中国科技论文在线精品论文 964 图 2 Cj0448c 基因 PCR 扩增结果图 3 Km R 基因 PCR 扩增结果 Fig. 2 PCR product of Cj0448c Fig. 3 PCR product of Km R 图 4 重组 PUC-CK EcoRI 酶切鉴定 Fig. 4 Identification of the recombinant plasmid PUC-CK by restricted enzyme EcoRI 图 5 重组 PUC-CK 双酶切鉴定 Fig. 5 Identification of the recombinant plasmid PUC-CK by double digestion 2.3 空肠弯曲杆菌转化实验结果经过多次转化, 仅在红霉素敏感菌中筛选到转化 PUC-CK 的菌株而在本实验所做的多次重组转化质粒, 并未筛选到转化 PUC-CK 重组质粒的红霉素耐药菌经验证, 在经过电转化后, 一株敏感菌中可以扩增出 Km R 基因 ( 如图 6 所示 ), 并可以表现出对卡那霉素和氨苄西林的双重抗性, 表明质粒已经转染进该菌株 2.4 PUC-CK 测序后与同源臂的比对结果图 6 转化实验的 PCR 扩增结果 Fig. 6 PCR product of transformation PUC-CK 经测序后与原始基因的对比显示, 同源臂上段有 2 bp 的突变, 且在同源臂端侧, 在基因测序误差允许范围内, 且不影响同源臂长度 ; 下段有 1 bp 的突变, 同样也在接受范围内 ( 如图 7a 图 7b 所示 )

5 Vol.9 No.9 May 2016 郝海红等空肠弯曲杆菌 Cj0448c 缺失突变体的构建图 7 PUC-CK 的 DNA 测序结果 Fig. 7 DNA sequencing of PUC-CK 965

6 2016 年 5 月中国科技论文在线精品论文讨论由于大环内酯类抗生素的广泛使用, 空肠弯曲杆菌对该类药物的耐药性问题日益呈现研究空肠弯曲杆菌对大环内酯类药物的耐药机制势在必行因此, 本研究首先应用红霉素对母源菌进行体外长期诱导, 获得红霉素耐药空肠弯曲杆菌菌株, 为后期耐药机制的研究奠定了基础本研究成功构建了空肠弯曲杆菌 Cj0448c 基因的缺失载体 PUC-CK, 获得了缺失 Cj0448c 基因的空肠弯曲杆菌菌株在构建载体过程中, 发现先对两个末端具有相同限制性酶切位点的 PCR 产物片段进行连接, 而后直接将此连接产物作为模板进行 PCR 扩增可以快速得到两段相连接的基因, 然后将这两段相连接的基因与载体连接可以大大减少实验时间, 提高工作效率但同时发现一个问题, 当已经连接的两段基因酶切后再进行第三段基因连接时, 本次实验中并未获得预期的三个基因的 PCR 扩增产物, 反而产物的非特异扩增现象十分严重推测此现象的出现可能有以下三方面的原因 :1) 在连接阶段可能由于长片段和短片段浓度比例问题导致连接失败 ;2) 在 PCR 扩增过程中可能由于 T m 值设定及其他条件设定导致扩增失败 ;3) 某种机制在抑制三段短基因的连接当改变浓度进行重复实验, 把剩余一条基因片段直接连接到载体上后, 发现前面所得的基因片段可顺利与载体相连虽然本实验获得了原始空肠弯曲杆菌菌株的 Cj0448c 基因缺失菌株, 但却没有获得红霉素耐药菌株 CP-N 的 Cj0448c 基因缺失菌株在前期所做的研究中,CP-N 菌株和菌株是进行同步实验的, 其制作感受态细胞和转化条件均一致但经过多次电转化和自然转化方法, 仍然无法筛选出 [6] 具有卡那霉素抗性基因的红霉素耐药菌株据文献报道, 同源臂越长转化成功率越高, 空肠弯曲杆菌内的同源臂长度在 200 bp 以上才可有效进行同源重组 [7] 这里所构建的质粒同源臂为 600 bp, 从理论上而言并不存在问题这里推测未能在红霉素耐药菌中成功构建 Cj0448c 的原因可能是 :1)CP-N 产生了某种机制排斥 PUC-CK 质粒, 即使制作为感受态细胞其仍然会拒绝 PUC-CK 质粒进入菌体 ; 2)CP-N 产生某种切除或修复机制, 将进入菌体的质粒切除, 或将已经重组的基因切除修复 ;3)CP-N 在同源臂位置产生了突变, 即在同源臂相应位点产生突变, 从而导致无法进行同源重组 ;4)CP-N 由于某种机制导致其无法表达卡那霉素抗性基因, 从而无法被筛选到 ;5) 实验条件及操作不当导致的实验失败后期将采取相应的验证方法对以上推测进行验证 :1)CP-N 转化后提取质粒, 如果可以提取出 PUC-CK 质粒则表示质粒可以进入细胞, 并可以保持完整 ;2) 对 CP-N 同源臂基因测序, 检测其相应基因位点突变情况 ;3) 显微注射其他可以表达 Km R 基因的质粒, 测其表达量及菌种 MIC. 根据这些验证实验结果可以排除 CP-N 难以获得 Cj0448c 基因缺失突变株的各种可能, 并改进相应的实验条件和技术, 以在红霉素耐药菌株中获得 Cj0448c 缺失突变体 4 结论本研究在空肠弯曲杆菌中首次成功构建了信号转导蛋白 Cj0448c 的缺失突变体, 为该基因功能和调控机制研究奠定了基础, 为空肠弯曲杆菌耐药性控制和新药靶标设计提供了参考致谢本研究获得了美国 Iowa State University 兽医学院预防兽医系沈张奇博士的帮助, 他在引物设计和方案选择上提供了建设性意见

7 Vol.9 No.9 May 2016 郝海红等 : 空肠弯曲杆菌 Cj0448c 缺失突变体的构建 967 [ 参考文献 ] (References) [1] LEVIN R E. Campylobacter jejuni: a review of its characteristics, pathogenicity, ecology, distribution, subspecies characterization and molecular methods of detection[j]. Food Biotechnology, 2007, 21(4): [2] PEDERSEN K, WEDDERKOPP A. Resistance to quinolones in Campylobacter jejuni and Campylobacter coli from Danish broilers at farm level[j]. Journal of Applied Microbiology, 2003, 94(1): [3] 侯凤琴, 沈宝铨, 孙新婷. 200 株弯曲菌对抗生素敏感性研究 [J]. 中华医院感染学杂志,2001,11(6): HOU F Q, SHEN B Q, SUN X T. Susceptibility testing 200 strains of Campylobacter to antibacterials[j]. Chinese Journal of Nosocomiology, 2001, 11(6): (in Chinese) [4] 黄金林. 我国部分地区鸡源空肠弯曲菌流行病学及运送 flaa 基因的壳聚糖纳米 DNA 疫苗免疫生物学特性研究 [D]. 扬州 : 扬州大学,2008. HUANG J L. Vaccine study on chicken Campylobacter epidemiology in some regions of China and biological characteristics of chitosan nano DNA carrying flaa gene[d]. Yangzhou: Yangzhou University, (in Chinese) [5] HAO H H, YUAN Z H, SHEN Z Q, et al. Mutational and transcriptomic changes involved in the development of macrolide resistance in Campylobacter jejuni[j]. Antimicrob Agents Chemother, 2013, 57(3): [6] WOODALL C A, JONES M A, BARROW P A, et al. Campylobacter jejuni gene expression in the chick cecum: evidence for adaptation to a low-oxygen environment[j]. Infection and Immunity, 2005, 73(8): [7] WASSENAAR T M, FRY B N, van der ZEIJST B A M. Genetic manipulation of Campylobacter: evaluation of natural transformation and electro-transformation[j]. Gene, 1993, 132(1):

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽