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1 糖尿病肾病易感基因相关研究 中日友好医院检验科 曹永彤 2018 年 11 月 9 日

2 主要内容 一 糖尿病肾病概述二 糖尿病肾病易感基因研究进展三 EPHX2 基因多态性与糖尿病肾病相关性研究四 糖尿病肾病的精准治疗

3 第一节 糖尿病肾病概述

4 糖尿病发病情况 % 9.7% 4.50% 2.28% 0.67% 1.04% ( 年 Xu Y. et al. JAMA. 2013, 310(9):

5 患病数亿 尿毒症患病数 ( 每百万人口 ) 糖尿病肾病发病情况 800 尿毒症主要诱发病因 糖尿病肾病 600 高血压肾病 33.6% 糖尿病肾病 慢性肾小球肾炎 囊性肾脏病 IDF2016 中国 : 糖尿病肾病致死人数急剧增加 时间 ( 年 ) USRDS 2016 ADR 年 2013 年慢性肾小球肾炎 -3.9% 337.2% 1990 年 2013 年糖尿病肾病 5 Lancet 2016; 387:

6 糖尿病性肾病 糖尿病性肾病 (diabetic nephropathy,dn) 是糖尿病引起的严重和危害性最大的一种慢性并发症, 是糖尿病全身性微血管病变表现之一, 临床特征为蛋白尿, 渐进性肾功能损害, 高血压, 水肿, 晚期出现严重肾功能衰竭, 是糖尿病患者的主要死亡原因之一

7 糖尿病性肾病损害的发展过程 从糖尿病进展至肾病, 一般可分为 5 个阶段, 丹麦学者 Mogensen 将糖尿病肾病分为以下 5 期 : 1 期 ( 功能改变期 ): 肾小球滤过率增高期 2 期 ( 早期肾小球病变期 ): 正常白蛋白尿期 3 期 ( 隐性肾病期 ): 或早期糖尿病肾病, 常出现在胰岛素依赖性糖尿病 5~15 年后 4 期 ( 糖尿病肾病期 ): 又称持续性蛋白尿期或临床糖尿病肾病 5 期 ( 尿毒症期 ): 即终末期肾病 (ESRD)

8 糖尿病性肾病发病机制 1. 肾内脂肪酸结构改变 2. 改变肾小球血液流变 3. 促进释放 TGF-β 早期 RAS 激活, Ang Ⅱ AT1R 高表达,GBM 增厚, ECM 增多, 足细胞损伤, 肾小球硬化 TNFα VEGF 等释放增多, 刺激系膜细胞增生, 诱导足细胞凋亡 糖代谢紊乱 脂代谢紊乱 氧化应激 血流动力学 细胞因子 炎症因子 遗传因素 1. 多元醇通路活化 1. 高糖诱发 ROS,PKC 通 1. 促进细胞肥大及系 易感基因的研究 2. 蛋白质非酶糖基化 路 膜基质增多 中候选基因研究 3. 蛋白激酶 C 激活 2. 诱导 Ang Ⅱ 产生, 2. TGF-β 促进肾素分 为有效方法 改变肾小球血流动力学 泌, 产生 Ang Ⅱ

9 疾病与基因 Monogenic Diseases Complex Diseases Environmental Diseases - Environment - Genes

10 糖尿病性肾病是多基因疾病 糖尿病肾病 : 多基因疾病 ( 遗传度 ) DN 有家族性聚集现象 : 有 DN 家族史者发生 DN 的概率是正常人的 3 倍, DN 患者的同胞发生 DN 的风险是无肾脏疾病糖尿病患者同胞的 2.3 倍 DNA sequence (Genotype) A C A C G C A... T C G A G T C... A C A C G C A... T C G G G T C... Environment Biology (Phenotype) 100% genetic 100% environmental Fogarty DG, et al. Kidney Int 2000;57: Langefeld CD, et al. Am J Kidney Dis 2004;43:

11 第三节 糖尿病肾病易感基因研究进展

12 糖尿病性肾病易感基因研究方法及研究 候选基因研究 家系连锁分析 炎症 : CCR5 VEGFA EPO 糖 脂代谢 :PAI-1 APOE ADIPOQ 糖尿病肾病 RAS 相关 : ACE AGT AGTR1 基因组关联研究 氧化应激 : HP PPARγ NOS3 UNC13B 细胞因子 : TGF-β1 IL-6 TNFα 预测风险, 早期干预 ; 了解发病机制 ; 发现治疗靶点 Mooyaart AL, et al.diabetologia,2011;54: McKnight AJ, et al. Curr Diab Rep,2015;15:41

13 糖尿病肾病与易感基因 易感性模式有 3 种 : (1) 主要基因效应 (major gene effect): 指由于某一种主要基因多态性 ( 或突变 ) 与血糖控制不良之间相互作用而发生 DN (2) 平均基因效应 (moderate gene effects): 指由于几种基因多态性 ( 或突变 ) 共同与血糖控制不良之间相互作用而发生 DN 这几种疾病等位基因独立地发生作用, 并且出现相加作用 (3) 多基因效应 (polygenic effects) 或微小基因效应 (minor gene effects): 既许多基因多态性 ( 或突变 ) 共同与血糖控制不良之间相互作用而发生 DN, 每个等位基因对 DN 遗传易感性只发挥微小作用

14 糖尿病肾病易感基因研究进展 目前 meta 分析研究表明多个基因多态性与糖尿病肾病有关 ( 左图 ), 但也有基因经 meta 分析与糖尿病肾病无关 ( 右图 ) A.L.Mooyaart et al. Diabetologia,2011,54:

15 肾素 - 血管紧张素 - 醛固酮系统 (RAS) 中 ACE 与 DN 的关联 7 ACE2 ACE 血管紧张素 1-9 血管紧张素 1-7 扩血管 降血压促进细胞凋亡抑制细胞增殖调节水钠平衡 血管紧张素原 (AGT) 血管紧张素 Ⅰ(AngⅠ) 血管紧张素 Ⅱ(AngⅡ) AT2 肾素 血管紧张素转化酶 (ACE) ARB 类 AT1 收缩血管 醛固酮释放 肾小球滤过率 蛋白尿 肾小球硬化 ACE 多态性 缓激肽 P 物质脑啡肽 无活性的片段

16 ACE 与 DN 相关性研究 ACE I/D 基因多态性与 DN 有相关性, 在亚洲人群比较明显

17 肾脏疾病相关基因最新进展 2008 年 Kao 等通过对 1372 例 ESRD 患者及 806 例对照人群的全基因组分析发现, MYH9 基因上的多个单核苷酸多态性是引起非洲后裔美国人非糖尿病性 ESRD 发病率高于其他美国人 2-4 倍的主要原因 MYH9( 非肌性肌球蛋白重链 9) 位于染色体 22q1 区域, 是非肌肉肌球蛋白重链 ⅡA 的编码基因, 该蛋白是非肌细胞骨架的重要组成部分,MYH9 可表达在肾小球足细胞 毛细血管和肾小管,MYH9 异常表达 定位和功能改变都会导致异常的肌球蛋白表达, 使得足细胞和肾小管的细胞骨架受损, 进一步导致蛋白尿 血尿甚至肾衰竭 MYH9 与罕见的巨型血小板组疾病发生有关, 该病常常伴随肾小球疾病 Bostrom 等发现与 MYH9 有关的肾病还包括 HIV 相关性肾病 局灶节段性肾小球硬化 (FSGS) 及高血压相关肾病, 并将这些疾病称之为 MYH9 相关性肾病 Kao WH, Nat Genet,2008,40(10):

18 MYH9 基因 SNP 与糖尿病肾病 相关研究表明 MYH9 rs 基因多态性可能与糖尿病肾病有关 Jessica N. Cooke Nephrol Dial Transplant (2012)27:

19 APOL1 基因突变与肾脏病 Tzur 等通过 千人基因组计划 的测序分析结果显示, 临近 MYH9 的 APOL1 基因突变与非洲后裔人群 CKD 相关性更强 APOL1 基因突变存在 2 种形式 : 第一种是含 2 个基因的单倍型, 发生在 APOL1 基因最后的外显子上, 分别为 rs (s342g) 和 rs (I384M), 称为 G1 ; 第 2 种是临近 G1 序列的 6 对碱基缺失, 为 rs (deln388/y389), 称为 G2 临床常见的与 APOL1 有关的肾脏病称为 APOL1 相关性肾脏疾病, 包括 : 局灶节段性肾小球硬化 (FSGS) 人类免疫缺陷病毒相关性肾病(HIVAN) 高血压相关性肾病 严重狼疮性肾炎 镰状红细胞贫血性肾病 APOL1 基因突变引起肾脏疾病的具体机制亟待阐明 Tzur S, Hum Genet, (3):

20 APOL1 主要发生于美国黑人,APOL1 基因突变与非裔美国人肾脏病之间确实存在联系 Afshin Parsa, N Engl J Med, 2013

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22 第四节 EPHX2 基因多态性与糖尿病肾病相关性研究

23 研究背景 课题组前期蛋白质组学发现自发性 2 型 DN 模型 OLETF 大鼠肾皮质 seh ( 可溶性环氧化物水解酶 ) 氨基酸位点发生改变 (seh 蛋白是 EPHX2 基因的表达产物 ) 对照组 LETO LETO LETO OLETF 正常 DN LETO 正常 OLETF DN DN 组 OLETF OLETF LETO OLETF 正常 DN OLETF 大鼠 122V I 247R C 475S N 可溶蛋白 难溶蛋白 EPHX2 人与大鼠 EPHX2 seh 蛋蛋白极为相近 该位点在多种物种中较为保守

24 研究背景 seh( 可溶性环氧化物水解酶 ) 可以将 EET( 环氧二十碳三烯酸 ) 水解为活性较弱的 DHET EET 在调节炎症 血压 以及疼痛具有比较强的作用 seh 相关基础研究表明 seh 蛋白 C 端和 N 端具有不同的功能

25 研究背景 rs 基因多态性位于 C 端, 该突变可以 EPHX2 基因外显子区存在多个 SNP 位点, 使 seh 酶活性降低,EETs 水解速度减慢 主要包括 : rs (R287Q) rs (K55R) MAF GLOBAL MAF CHB rs (r103c) rs (c154t) /Asian 48 Sandberg M, et al. J Biol Chem. 2000,275(37): EnayetAllan AE, et al. J Biol Chem.2008,283(52):

26 研究背景 EPHX2 rs 基因多态性与缺血性脑卒中 ( 大血管 ) 临床相关研究背景 EPHX2 G860A 中 A 等位基因是脑卒中的保护因素 Laxi Zhang, Pharmacogenetics and Genomics,2008,18:45-51

27 研究背景 EPHX2 rs 基因多态性与 IgA 肾病临床相关研究背景 EPHX2 A 等位基因对 IgA 肾病肾脏具有保护作用 Jung Pyo Lee, et al. Am J Physiol Renal Physiol. 2011

28 研究背景 EPHX2 基因敲除基础研究 EPHX2 基因敲除能够提高链脲霉素诱导的 1 型糖尿病鼠肾脏内皮功能, 降低肾脏炎症和损伤 Elmarakby AA, Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 301:R1307-R1317,2011

29 研究背景 从 2004 年至今关于 EPHX2 基因 rs 基因多态性的临床研究主要包括 : 冠状动脉钙化 脑梗死 家族性高胆固醇血症 IgA 肾病等相关疾病 其中, EPHX2 基因 rs 基因多态性中 A 等位基因对 IgA 肾病患者肾脏具有保护作用 多项研究将 seh 作为治疗靶点, 用 seh 抑制剂或敲除 EPHX2 基因, 在动物肾脏疾病模型均显示出较好疗效 该 rs 基因多态性与 DN 的相关性未见报道 该多态性在 DN 体外作用机制也未见报道 Fornage M, et al. Circulation.2004;109: Sato K, et al. J Hum Genet. 2004;49(1):29-34 Lee J P, et al. Am J Physiol Renal Physiol. 2011; 300(6):F

30 研究方案 病例筛选流程 : 筛选 2 型 DM 患者 (N=1604) 可能合格 2 型 DM 患者 ( N=1178) 排除 : 临床信息不完整病例 (n=323) 年龄不符 ( n=21) 合并肿瘤 ( n=82) 剔除 : 膜性肾病 (n=4) 血尿 (n=13) 肾结石 (n=62) IgA 肾病 (n=8) 诊断 DM 之前伴蛋白尿 (n=25) ACR 30mg/g (N=518) 合格 DN 患者 (N=406) ACR<30mg/g (N=660) 合格 Non-DN 患者 (N=464) 剔除 : 病史不足 7 年 ( n=196) SNP 基因分型检测

31 研究结果 EPHX2 rs 多态性中 A 等位基因对 DN 的发生具有保护作用 本实验临床研究仅在中国人群进行了初步探讨, 在其他种族尚 有待于进一步研究

32

33 第二节 糖尿病肾病的精准治疗

34 一 糖尿病肾脏疾病治疗现状 肾脏疾病的治疗缺乏基于发病机制的临床试验依据, 尚处于经验性 治疗水平 目前降尿蛋白和降血压是糖尿病肾病治疗中很关键的环节 ACEI ARB ARB+ACEI: 有效, 副作用大 ACEI 是目前公认的在预防和治疗糖尿病肾病 减少尿蛋白排泄的最有效 的药物 糖尿病患者, 无论有无高血压均应启用 ACEI 治疗 刘志红, 精准医学与肾脏疾病 : 应用与思考,2018,98(14):

35 糖尿病肾病抗高血压精准治疗 ( 一 ) 血管紧张素转换酶抑制剂 (ACEI) 不同 ACE(I/D) 基因型的高血压患者用依那普利治疗前后的血压值 (x±s,mmhg) ACE 基因型 SBP DBP 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 DD (n=23) ± ±12.04* 94.50± ±8.83* ID (n=21) ± ±13.54* 97.16± ±12.94* II (n=24) ± ±10.50* 95.83± ±9.78* 不同 ACE(I/D) 基因型的高血压患者用依那普利治疗后的有效率 ACE 基因型显效有效无效总有效率 DD (n=23) %** ID (n=21) %** II (n=24) % 显效 :DBP 下降 10mmHg 并降至正常或 DBP 未降至正常, 但下降 20mmHg; 有效 :DBP 下降 < 10mmHg, 但降至正常或下降 10-19mmHg 者 ; 无效 : 未达以上标准, ** P<0.01 compared with group II *P<0.05 compared with Before 唐强, 黄友良, 俞群军, 等. 血管紧张素转化酶基因多态性与依那普利降压疗效的相关性研究, 中国临床药理学与治疗学.2009,Jan;14(1):70-75

36 104 位希腊高血压患者,ACE 不同基因型与福辛普利抗高血压疗效相关性研究 Stavroulakis G A et al. Cardiovascular drugs and therapy, 2000, 14(4):

37 ( 二 ) 血管紧张素 Ⅱ 受体拮抗剂 (ARB) ARB 类药物通过选择性的与血管紧张素 Ⅱ1 型受体 (AT1R) 结合, 阻滞血管 紧张素 Ⅱ 的缩血管作用, 降低血压 CYP2C9 代谢酶能影响 ARB 类药物在体内的代谢 AGTR1 能影响靶受体功能, 引起疗效的差异 CYP2C9*3 是东方人群中的常见突变, 该突变导致酶活性降低, 药物代谢能力降低

38 1087 例中国志愿者接受 28 天的厄贝沙坦 突变导致酶活性降低 LOG(C24h):the log concentrations of irbesartan in plasma at 24 h post-dosing on the 27th day LOG(C6h):the log concentrations of irbesartan in plasma at 6 h post-dosing on the 28th day CYP2C9*3 基因型患者在给药后 6h 和 24h 具有较高的厄贝沙坦血药浓度 Hong X et al. European journal of clinical pharmacology. 2005, 61(9):

39 二 精准医学助力肾脏疾病诊断体系和个体化治疗的发展 ( 一 ) 基于发病机制的诊断 : 迈向分子诊断及分子分型 肾小球足细胞上 SRGAP2a 分子的发现及其在介导 DN 患者足细胞损伤中的机制研究 发现 : SRGAP2a 的干预措施有望为 DN 的防治提供新的靶点 Pan yu, et al. Dissection of Glomerular Transcriptional Profile in Patients with Diabetic Nephropathy: SRGAP2a Protects Podocyte Structure and Function. Diabetes,2017

40 进一步通过体外细胞实验, 斑马鱼和糖尿病小鼠体内研究证实 SRGAP2a 是足细胞特异性蛋白, 在 DN 的足细胞损伤和蛋白尿形成过程中发挥了关键作用, 针对 SRGAP2a 的干预措施有望为 DN 的防治提供新的靶点 Pan yu, et al. Dissection of Glomerular Transcriptional Profile in Patients with Diabetic Nephropathy: SRGAP2a Protects Podocyte Structure and Function. Diabetes,2017

41 ( 二 ) 基于分子靶点的治疗, 迈向个体化治疗 研究者们发现丙酮酸激酶 (PKM2) 差异表达与肾脏保护作用相关,PKM2 激动剂 (TEPP-46) 能够 降低高糖刺激所生成的糖毒性产物, 改善线粒体功能, 证实了 PKM2 有可能是 DN 治疗的新靶点 比较 DN 患者和长期患有糖尿病而无肾脏受累患 者的肾小球蛋白图谱, 发现丙酮酸激酶 (PKM2) 的表达水平和活性在 DN 患者肾小球中明显降低 Qi W, Pyruvate kinase M2 activation may protect against the progression of diabetic glomerular pathology and mitochondrial dysfunction. Nature medicine. 2017,23(6):

42 丙酮酸激酶 (PKM2) 敲除的小鼠足细胞的线粒体功能障碍, 凋亡发生率较高 足细 胞特异性的 PKM 敲除小鼠在糖尿病情况下, 可以发生更加严重的蛋白尿和肾小球损伤 Qi W, Pyruvate kinase M2 activation may protect against the progression of diabetic glomerular pathology and mitochondrial dysfunction. Nature medicine. 2017,23(6):

43 总 结 EPHX2 基因突变可降低 seh ( 可溶性环氧化物水解酶 ) 活性, 减少 EET( 环氧二十碳 三烯酸 ) 的水解, 对糖尿病肾病的发生及发展有保护作用, EPHX2 基因多态性的研究一方面对于糖尿病肾病的风险管理具有重要指导作用, 同时对于外源 EET( 环氧二十碳三烯酸 ) 和 seh( 可溶性环氧化物水解酶 ) 抑制剂 的开发及使用在临床治疗糖尿病肾病具有重要意义

44 请各位专家批评指正 谢谢!

WHO ---- ---- , 200 5% 8.6% 18.8% 200, 140 , MS MS 60 80 X 1999 WHO MS (2004.12) 1. BMI>25 >24 >28 BMI kg / m 2 2. 6.1mmol/L, 2h 7.8mmol/L 3. BP 140/90mmHg ( ) 4. TG 1.7 mmol/l /L HDL-C C

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