农业资源与环境学报 Journal of Agricultural Resourcesand Environment 2013 年 12 月第 30 卷第 6 期 : December2013 Vol.30 No.6: 三种常用氨基甲酸酯类农药人工抗原合成方法的设计与

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婉隼姜
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1 农业资源与环境学报 Journal of Agricultural Resourcesand Environment 2013 年 12 月第 30 卷第 6 期 : December2013 Vol.30 No.6: 三种常用氨基甲酸酯类农药人工抗原合成方法的设计与优选瞿巧钰, 陈珊珊, 刘潇威 * ( 农业部环境保护科研监测所, 天津 ) 摘要 : 农药人工抗原的合成直接影响制备抗体的质量, 是建立农药分子特异性强灵敏度高的免疫分析方法的关键本文综述了国内外对于氨基甲酸酯类广泛使用的 3 种农药甲萘威克百威涕灭威人工抗原合成过程中的农药分子半抗原的设计原则合成方法, 人工抗原的设计优选及影响因素等方面的研究进展关键词 : 氨基甲酸酯类农药 ; 甲萘威 ; 克百威 ; 涕灭威 ; 半抗原 ; 人工抗原 ; 合成方法中图分类号 :X592 文献标志码 :A 文章编号 : (2013) Design and Selection of Synthesis Methods of Artificial Antigens for Three Frequently-used N-methylcarba 原 mate Pesticides QU Qiao-yu, HEN Shan-shan,LIU Xiao-wei * (Agro-EnvironmentalProtection Institute,Ministry ofagriculture, Tianjin , hina) Abstract: Synthesis of artificial antigens of pesticides directly influences the quality of the antibodies, and is critical in the format of particu 原 lar and sensitive immunology assay. The progress of the design principle and synthesis methods of haptens of three kinds of N-methylcarba 原 mate pesticides including carbaryl, carbofuran, aldicarb were introduced in this paper. Furthermore, the design and selection of synthesis methodsforartificialantigensand the influencing factorsofthe synthesiswerealso presented. Keywords:N-methylcarbamatepesticides;carbaryl; carbofuran; aldicarb; hapten; artificialantigen; synthesismethods 氨基甲酸酯类农药是我国当前广泛使用的农药种类之一该类农药具有分解快残留期短高效选择性强等特点, 代表品种有甲萘威克百威涕灭威等 20 世纪 70 年代以来, 氨基甲酸酯类农药的使用量逐年增加, 随之带来的农产品中农药残留量超标问题也日益突出, 直接影响着消费者的身体健康和对外经贸的发展所以建立快速高效经济的检测方法成为亟待解决的问题 [1-2] 目前氨基甲酸酯类农药残留检测常采用高效液相色谱 (HPL) 法 [3], 另外 L-MS/MS 是快速发展的一种分析技术, 具很高的灵敏度和分离能力, 近年来在收稿日期 : 基金项目 : 公益性行业 ( 农业 ) 科研专项经费项目 ( ) 作者简介 : 瞿巧钰 (1988 ), 女, 重庆涪陵人, 硕士研究生, 主要从事农药残留与环境毒理学研究 hsquqiaoyu@163.com * 通信作者 : 刘潇威 xwliu2006@163.com 水果蔬菜等农残分析上已有了一些应用 [4] 但这些方法需要较昂贵的仪器并且样品前处理过程复杂, 因而难以满足样品快速检测的需要免疫分析方法具有快速特异性强灵敏度高等优点, 近年已被广泛应用于农药残留检测 [5] 农药免疫分析是利用抗原抗体的特异性反应来检测农药含量, 此方法的关键是制备高特异性的抗体, 以提高检测特异性和灵敏度根据标记物的不同, 主要农药免疫分析技术分为 : 放射免疫分析 (RIA) 酶免疫分析 (EIA) 荧光免疫分析 (FIA) 化 [6] 学发光免疫分析 (LIA) 等 1993 年 Marco 等最先开始甲萘威免疫技术的研究, 设计并合成总共 8 种半抗原, 分别进行多克隆抗体的制备, 通过效价评定, 筛选出较高免疫性的人工抗原, 为后续甲萘威抗体的制备以及免疫技术的发展提供了重要的参考 1994 年 Antonio 等 [7] 就进行了甲萘威单克隆抗体的制备

2 农业资源与环境学报第 30 卷第 6 期年后, 科研人员对甲萘威的研究逐渐增多, 根据需要开发了免疫技术需求, 设计合成了不同的人工抗原, 得到相应的高特异性抗体克百威免疫技术的研究略 [8] 晚于甲萘威,1999 年 Antonio 等设计合成了 4 种克百威的半抗原, 通过单克隆抗体的制备, 筛选出较高免疫性的人工抗原之后人们不断开发克百威残留的检测免疫技术关于涕灭威半抗原的合成及其免疫技 [9] 术的研究相对较少最早的研究是 1988 年 Brady 等设计合成了一种半抗原, 建立的酶联免疫法对涕灭威的检测具有较高特异性, 但是其最低检出限为 0.3 滋 g ml -1 我国对其的研究始于 2006 年, 张彦峰等 [10] 设计并合成了一种新的涕灭威半抗原, 但是此半抗原还未在免疫技术上进一步应用高质量的抗体是免疫分析方法建立的关键, 而合成高质量的人工抗原又是制备特异性抗体的必备条件本文对国内外关于氨基甲酸酯类广泛使用的 3 种农药甲萘威克百威涕灭威人工抗原合成过程中的农药分子半抗原的设计原则合成方法, 人工抗原的设计优选及影响因素等方面的研究进展作一综述, 并从中总结一些规律, 为促进国内氨基甲酸酯类农药免疫分析技术的发展提供参考 1 半抗原的设计与合成农药小分子半抗原分子的设计及合成是免疫动物制备单克隆抗体 (McAb) 或多克隆抗体 (PcAb) 以及进一步建立免疫分析法快速检测农药残留的前提基础及关键 [11] 选定农药待测物后, 应根据其结构选择合适的半抗原合成方法, 如果农药分子含有活性基团, 可直接与连接剂或载体蛋白连接, 但大多数农药小分子没有现成的活性基团, 需要作适当的衍生化改造, 使农药原药分子内产生活性基团, 即在农药分子末端引入 -H -NHn(n=l 或 2) -SH -H -H 等活性基团后再与连接剂连接 [12] 合成半抗原的路径一般有以下几种方式 : 直接对农药分子的原药进行衍生化, 利用待测物现有结构, 通过氧化还原取代水解等反应产生相应的功能基团 ; 利用农药分子降解产物或中间产物合成半抗原 ; 由原料重新合成半抗原, 在合成过程中选择适当步骤用一个有反应功能团的分子参与反应, 从而合成出有反应功能团的半抗原分子 ; 簇半抗原的制备 ; 半抗原中特征基团的保护等半抗原设计需要遵循总体原则 : 第一, 半抗原中要含有目标物的完整或部分结构特征 ; 第二, 半抗原中需要有 102 一个可以与载体蛋白质发生共价结合反应的活性基团 ; 第三, 半抗原上的空间连接臂长度要适中 ( 通常为 3~6 个碳原子的链长 ) [13] 氨基甲酸酯类农药是指在甲酸酯类化合物中, 连于碳原子上的氢原子被氨基取代的化合物, 通式见图 1; 其中甲萘威克百威涕灭威的结构式分别见图 1 根据图 1 中 3 种农药的结构, 我们可以看出甲萘威和克百威的分子结构式相似, 都属于取代苯基 -N- 甲基氨基甲酸酯类, 具有稠环结构和一个较强的吸电子基团氨基甲酸酯基团, 推测稠环和氨基甲酸酯基团可能为其免疫决定区而涕灭威属于肟基氨基甲酸酯类农药, 推断其肟基可能为其免疫决定区域 1.1 甲萘威半抗原的设计与合成甲萘威 (carbaryl), 化学名称为 1- 萘基甲基氨基甲酸酯 (1-naphthyl methylcarbamate), 分子式 12 H 11 N 2, 相对分子质量为 201, 水解主要产物为 1- 萘酚 [14] 对于甲萘威半抗原的合成与筛选, 最早见 1993 [6] 年 Marco 等的研究, 在稠环上的不同位置引入不同的连接臂, 合成 8 种不同的半抗原也有许多学者 [15-17] 相继根据所要研究和开发的免疫技术, 尝试合成并筛选不同的半抗原, 以达到最好的免疫性和特异性借鉴前期学者的经验, 近年来人们主要选择的半抗原有 3-(1- 萘氧基甲酰胺 )- 丙酸 (( 3-[[(1-naphthyloxy) carbonyl]amino] propionic acid,na) 6-(1- 萘氧基甲酰胺 )- 己酸 (( 6-[[(1-naphthyloxy)carbonyl]amino] hexanoicacid,nh) 4-(1- 萘氧基甲酰胺 )- 丁酸 ((4- [[(1-naphthyloxy)carbonyl]amino] butanoic acid, NB) 1-(1- 萘基 )-3-(5- 羧基戊烷基 ) 尿素 ((l-(lnaphthyl)-3-(5-carboxypentyl)urea,pnu), 制备出 R 1 R 2 N 克百威分子结构式 (c) R 氨基甲酸酯类农药结构通式 (a) NH H 3 H 3 H 3 涕灭威分子结构式 (d) 图 1 氨基甲酸酯类农药通式及甲萘威克百威和涕灭威分子结构式 NH H 3 甲萘威分子结构式 (b) H 3 H 3 S H H 3 NNHH 3

3 瞿巧钰, 等 : 三种常用氨基甲酸酯类农药人工抗原合成方法的设计与优选的抗体, 均得到较高的效价以及特异性 [18-20] 对于甲萘威半抗原的合成方法, 国外采用的合成 [7,21] 方法是 ( 合成途径见图 2(a)): 在酚盐的水溶液中通入过量的光气, 得到中间产物氯甲酸酯, 再用氯甲酸酯和氨基己酸在氢氧化钠溶液中反应生成半抗原实际上用光气合成氨基甲酸酯类农药属于一种传统的方法, 这类方法需要使用大量的光气以及甲苯, 极易造成环境污染, 危害人体健康近几年来, 有研究者不断探究新的合成方法并成功合成了甲萘威半抗 [22-23] 原 ( 合成途径见图 2(b)), 研究采用了对硝基苯氯甲酸酯制成了萘羧酸酯的结构, 避免了直接使用光气, 并获得了较高吸收率 (70%), 避免了光气和甲苯的引入所带来的危害作用为了能够产生适合目标物的抗原, 采用目标化合物的衍生物作为半抗原也是制备抗体的一种有效方法如甲萘威的衍生物 1- 萘基 -N- 氨基甲酸酯,N- (2- 萘甲酰基 )-6- 氨基己酸等也可以作为半抗 [22, 24] 原另外,PNU 的合成可以参照文献 [25] 中的合成路线 ( 见图 3) 1.2 克百威半抗原的设计与合成 2013 年 12 月克百威 (carbofuran), 化学名称为 2,3,- 二氢 -2,2- 二甲基 -7- 苯并呋喃基 -N- 甲基氨基甲酸酯 (2,3- diydro-2,2-dimethyl-7-benzofurany-n-lmethyl carba 原 mate), 分子式为 12 H 15 N 3, 相对分子质量为 221, 水解的主要产物为呋喃酚对于克百威人工抗原的合成, 研究略晚于甲萘威半抗原的研究, 研究者根据克百威与甲萘威水解后断裂部位相同, 参照了甲萘威半抗原合成方法, 从克百威水解产物呋喃酚入手制备半抗原 1999 年 Antonio Abad 等 [8] 选择不同的连接臂, 合成了 4 种克百威的半抗原分别为 3-[[(2,3- 二氢 -2,2- 二甲基 -7- 苯并呋喃基氧 ) 羰基 ] 氨基 ] 丙酸 (3-[[(2,3-Dihydro- 2,2 -dimethyl -7 -benzofuranyloxy)carbonyl] -amino] - propanoic acid,bfnp) 4-[[(2,3- 二氢 -2,2- 二甲基 - 7- 苯并呋喃基氧 ) 羰基 ] 氨基 ] 丁酸 (4-[[(2,3-dihydro- 2,2-dimethyl-7-benzofuranyloxy)carbonyl]-amino] bu 原 tanoic acid,bfnb ) 6-[[(2,3- 二氢 -2,2- 二甲基 -7- 苯并呋喃基氧 ) 羰基 ] 氨基 ] 己酸 (6-[[(2,3-dihydro- H - l NaH/H 2 T=85 益 NH (H 2) nh 三光气 / 甲苯 NaH/H 2 /dioxane H 2N(H 2) nh H (a) I N 2 N 2 pyridine/h 2l 2 NH (H 2) nh NaH 3/H 2/dioxane H 2N(H 2) nh (b) 图 2 (a) 甲萘威半抗原传统合成路线 ;( b ) 甲萘威半抗原新合成路线 N H 2N(H 2) 5H THF HN NH(H 2) 5H 图 3 甲萘威半抗原 PNU 合成路径 103

4 农业资源与环境学报第 30 卷第 6 期 2,2-dimetyl -7 -benzofuranyl -oxy)carbonyl] -amino hexanoic acid,bfnh) 6-[[(2,2- 二甲基 -1,3- 苯丙二烷基 -4- 氧 ) 羰基 ] 氨基 ] 己酸 (6-[[(2,2-dimethyl-1,3- benzodi oxol-4-oxy)carbonyl]-amino] hexanoic acid, BNH) 根据单克隆抗体的制备, 以及酶联免疫方法的建立, 高特异性和亲和性的杂交瘤来自 BFNP BFNB 之后关于克百威免疫技术的研究中, 半抗原的 [26] 合成主要都是参考前 3 种半抗原, 例如 Zhu 等在建立直接酶联免疫吸附技术 (Direct competitive enzymelinked immunoassay,d-elisa) 测定蔬菜中克百威残 [27] 留的方法中, 合成 BFNP 作为半抗原,Gui 等在建立时间分辨荧光免疫技术时, 合成 BFNB 作为半抗原也有研究者以克百威对硝基苯氯甲酸酯和 6- 氨基己酸为反应原料, 避免传统的三光气化学合成工艺, 合成克百威半抗原 BFNH 将半抗原与载体蛋白 (BSA VA) 偶联制备了克百威人工免疫抗原 BFNH-BSA 和包被抗原 BFNH-VA 利用 BFNH- BSA 免疫家兔获得抗克百威多克隆抗体, 并通过间接 ELISA 法测定抗体效价结果表明家兔抗血清效价高达 1.28 伊 10 6[28] 1.3 涕灭威半抗原的设计与合成涕灭威 (Aldicarb), 化学名称为 2- 甲基 -2-( 甲硫基 ) 丙醛 - 氧 -[( 甲胺基 ) 羧基 ] 肟 (2-Methyl-2-(Methylthio) propanal--[(methylamino)carbonyl]oxime), 分子式为 7 H 14 N 2 2 S, 相对分子质量为 190 它是一种高效剧毒广谱, 内吸性的杀虫杀瞒杀线虫剂涕灭威是目前毒性最大的农药之一, 它在环境或生物体内发生氧化反应生成涕灭威亚砜 (Aldicarb sulfoxide) 和涕灭威砜 (Aldicarbsulfone), 都具有较高的水溶性和毒性, 主要水解产物为涕灭威肟由于涕灭威的毒性以及在环境中的不稳定性, 关于涕灭威半抗原的研究相对较少涕灭威的结构不同于甲萘威克百威, 因此半抗原的合成方法不同于前 [9] 者 1988 年 Brady 等最早开始进行涕灭威半抗原的制备并开发了酶联免疫技术, 建立的方法对涕灭威具有高度选择性此半抗原在涕灭威肟分子中引入了反式 -( 氨基甲基 )- 环己烷羧酸, 而甲萘威克百威的半抗原引入的是直链羧酸我国学者张彦峰等 [10,29] 设计并合成了一种新的涕灭威半抗原 : 涕灭威肟琥珀酸单酯 (Aldicarb oxime succinic ester,ase), 并偶联 BSA 制备了多抗关于涕灭威半抗原, 国外最新的研究是 Lai Khai Siew 等 [30] 制备单抗所合成的半抗原 : 涕灭威肟乙酸乙酯 (Aldicarb oxime ethyl acetate), 并分别偶联载体蛋白 BSA KLH 形成 2 种免疫原, 分别得到不同的单抗, 为发展不同的免疫技术提供借鉴 2 人工抗原的合成与筛选分子量小于 300 的半抗原较难获得高亲和力的抗体 [12], 必须设法先将农药小分子与载体蛋白质偶联制备出农药人工完全抗原, 这是农药免疫分析的关键人工抗原的合成需要考虑载体蛋白偶联方法偶联结合比等因素的选择与优化 2.1 载体蛋白的选择常用来作为合成农药人工抗原的载体蛋白质有牛血清蛋白 (BSA) 卵清蛋白 (VA) 钥孔血蓝蛋白 (KLH) 人血清蛋白 (HSA) 及人工合成的多聚赖氨酸 (PLL) 此外, 阳离子牛血清白蛋白 (cbsa) 也逐渐在人工抗原的制备中作为即用型和具有高度免疫原性的载体蛋白 cbsa 通过过量的乙二胺修饰天然 BSA 制备而成, 基本上用带正电的伯胺封闭了所有带负电的羧基基团, 其效果是获得了免疫性明显增强高度带正电的蛋白质 (pi 跃 11) 此外, 伯胺数量的增加为使用典型交联法提供了更大量的可被交联的抗原分子当相对于 BSA 需要更强的免疫原性, 而条件不适合使用钥孔血蓝蛋白 (KLH) 时,cBSA 是用于免疫原制备的优良选择一般采用比较多的制备免疫原用的载体蛋白为 BSA, 制备包被原用的载体蛋白为 VA BSA 具有物化性质稳定不易变性价廉易得, 而且其赖氨酸含量高自由氨基多, 在不同的 ph 值和离子强度下均有较大的溶解度等优点而将 VA 作为包被原的载体蛋白是因为其免疫原性较 BSA KLH 等其他蛋白弱, 可以作为无关的载体蛋白用于抗体的筛选和免疫测定 KLH 因为其与脊椎动物免疫系统具有很好的异源性而被认为是很好的载体, 但是 KLH 价格昂贵, 虽然免疫原性强, 但它激发的 B 淋巴细胞克隆中针对自身的抗原决定簇较多, 相对减少了针对半抗原的 B 淋巴细胞克隆, 增加了阳性克隆筛选的难度和工作量因此一般采用 BSA KLH 作为免疫原的载体蛋白, 而 VA 则作为包被原载体蛋白的首选, 当然也有学者采用其他种类的蛋白作为包被原的载体蛋白, 如刘曙 [16] 照在甲萘威酶联免疫吸附分析技术研究中则采用了 HSA VA 作为包被原的载体蛋白阳离子化的载体蛋白可以增强半抗原分子和蛋白的偶联, 减小蛋白间的交联反应, 提高免疫效应等优点, 现在主要应用于药物的酶联免疫技术中人工抗原的合成 [31], 用此 104

5 瞿巧钰, 等 : 三种常用氨基甲酸酯类农药人工抗原合成方法的设计与优选免疫原制备了高质量的单抗并建立了高灵敏性的酶联免疫技术表 1 列举了部分研究者对 3 种农药免疫原所选取的载体蛋白 2.2 半抗原与载体的偶联在设计好的半抗原的基础上, 半抗原与载体蛋白的偶联, 主要考虑偶联方法和偶联结合比 2 个重要因素偶联方法的选择表 1 免疫原载体蛋白的选择农药半抗原免疫原载体蛋白相关文献甲萘威 NA NB NH BSA [7] [17] [23] [32] PNU KLH [9] [18] [19] [25] 克百威 BFNB BFNP BFBH BSA [33] [34] 涕灭威涕灭威肟琥珀酸单酯 BSA [10] [29] 涕灭威肟乙酸乙酯 BSA KLH [30] 药物或其衍生物分子上的羧基可以通过活化酯法碳二亚胺法混合酸酐法偶氮苯甲酸法等与蛋白上的氨基形成酰胺键, 其中碳二亚胺法在这类化合物的偶联反应中的应用最为广泛但是, 碳二亚胺的缩合反应存在没有选择性易形成蛋白分子间的自身聚合产生非均一性产物等缺点为了减少蛋白分子间的自身聚合, 可以先将药物分子上的羧基转化为 N- 羟基琥珀酰亚胺的活泼酯, 然后再与抗体交联, 即在碳二亚胺法基础上改进活化酯法 [35] 混合酸酐法是指半抗原或药物及其衍生物分子中的羧基可以在三乙胺存在下与氯甲酸异丁酯反应, 生成活泼中间体混合酸酐, 然后与蛋白载体上的伯氨基反应, 形成酰胺交 2013 年 12 月联键本反应过程简单, 毋需制备和分离中间产物偶氮苯甲酸法是对氨基苯甲酸重氮化后, 与带苯环的半抗原偶联引入羧基, 再利用羧基的反应连接于蛋白上目前, 还没有采用此种方法合成氨基甲酸酯类农药的人工抗原其原因可能是采用此方法引入的苯环本身就具有免疫性, 再者引入部分的位置在苯环上, 改变了农药本身的结构, 影响针对农药分子抗体的特异性对于载体偶联方法的选择, 免疫原及包被原的合成路线最好不同, 另外, 用作免疫原的半抗原化学结构连接位置连接臂长及构型应尽量与包被原的半抗原不同 [33], 因此免疫原的制备常采用活化酯法, 而包被原的制备常采用混合酸酐法 4 种偶联方法的反应原理见表偶联结合比的选择人工抗原中半抗原与载体蛋白的摩尔分子比称为偶联结合比除半抗原结构特征外, 偶联率也是影响人工抗原免疫效果的重要因素适宜的偶联结合比有助于提高抗体的亲和力和选择性不同待测物, 不同载体其最佳结合比可能不同现在一般通过调节半抗原与载体的摩尔比反应的 ph 值温度离子强度等来控制结合比半抗原结合比过高或过低均会影响抗体的生成低偶联结合比的人工抗原引起的免疫反应较慢, 过高结合比抗原易导致动物免疫麻 [34] 痹刘成梅等认为, 完全抗原的偶联结合比在 10 颐 1 耀 25 颐 1 之间为宜 Rinehart 等 [36] 认为最佳偶联结合比为 10 颐 1 耀 20 颐 1 不同人工抗原的最佳结合比可能是表 2 羧基活性基团偶联方法及原理偶联方法活性基团反应原理活化酯法混合酸酐法 H H RH+ H N RH + l R (n- 4H 9) 3N H 2H(H 3) 2 N H 2N R H 2H(H 3) 2 RNH H 2N RNH 碳二亚胺法 H H RH+ R N N R R N R N R H 2N RNH 偶氮苯甲酸法 H H NH 2 NaN 2/HI H N + 2lH R H N N R H 2N HN N N R 105

6 农业资源与环境学报第 30 卷第 6 期不一致的, 最好且直接的获取方法是通过免疫实验, 进行最优人工抗原的筛选综合以上人工抗原合成的因素,3 种氨基甲酸酯类农药的部分人工抗原分子的设计合成与优选归纳见表 3 表 3 3 种农药部分人工抗原合成与优选归纳农药偶联蛋白偶联方法连接臂偶联比相关文献甲萘威 BSA 活化酯法 6 个碳原子 26 颐 1 [23] [37] 克百威 BSA 活化酯法 4 个碳原子 13 颐 1 [8] [26] [32] [33] [38] 涕灭威 BSA 活化酯法 [10] 2.3 人工抗原的筛选纯化和鉴定不同种类人工抗原的免疫性, 最终需要进行免疫实验, 才能筛选出适宜的人工抗原, 为后期特异性抗体的制备打好坚实的基础半抗原修饰物与载体偶联后所得的人工抗原必须进行纯化, 以除去未反应的半抗原小分子盐类及其他小分子杂质最常用的方法是透析和层析法透析一般耗时较长 ( 通常需 2d 以上 ), 纯化较为彻底操作相对简单层析法中, 常用的有凝胶层析亲和层析和离子交换层析, 具体采用哪种形式, 需要根据偶联的种类和性质以及对纯化程度的要求来决定但凝胶层析耗时较短, 但操作相对复杂, 需要对流出组分进行跟踪分析, 以确定目标组分对纯化后人工抗原进行鉴定, 一方面是定性判断半抗原与载体是否偶联成功 ; 另一方面是定量测定偶联结合比和蛋白质含量人工抗原的检测方法主要有紫外分光光度法红外吸收光谱法考马斯亮蓝法聚丙烯酰胺凝胶电泳法标记抗原示踪法 SDS-PAGE [32] [37] 法 ESI-MS 法 MALDI-TF-MS 法等鉴定农药人工抗原最常用的方法是紫外光谱扫描法, 如果人工抗原的紫外吸收图谱不同于原载体蛋白和半抗原的紫外扫描图谱, 则证明人工抗原合成成 [39] 功以最后一次的透析外液作空白, 分别将载体蛋白半抗原及偶联在波长 200~400 nm 进行紫外扫描, 得到各物质最大的吸收波长, 如若是在 280 nm 处均有较大吸收, 则选择 280 nm 处波长的 D 280 值以及浓度分别计算摩尔吸光系数, 按下式估算半抗原与载体蛋白结合的分子数之比 ( 结合比 ): 结合比 =(e 280 偶联物 -e 280 载体蛋白 )/ e 280 半抗原若是得到的 3 种物质的最大吸收波长相差较远, 可以分别以半抗原载体蛋白的最大吸收波长扫描得 [23] [40-41] 到的 D, 进行结合比的计算偶联结合比 (n)=(aam.kbbm -Abm.KBam)/ (Abm.KAam-Aam.KAbm) 式中 :A B 分别为半抗原载体蛋白偶联物 ; KAam KAbm KBam KBbm Aam Abm 分别为 3 种物质在 A B 物质最大吸收波长处的吸光值 ; 分子消光系数 K=A/ 但是, 对于最大吸收波长相差不大 [42-43] 的偶联比计算, 也可以采用上述方法紫外分光光度法只能对偶联的结果进行初步判断, 计算中涉及到的偶联物浓度是根据初始加入蛋白质的浓度进行计算的, 且对人工抗原纯化程度以及偶联物体积不十分精确, 因此计算出的结合比也不是精确的 ; 且紫外分光光度法需要一系列浓度的配制烦琐的计算等质谱法具有灵敏度高样品用量少可以提供样品的精确分子量和结构信息, 能与色谱联用用于复杂体系的分析等优点, 是近年来广泛应用于偶联物鉴定的新型鉴定方法之一基质辅助激光解吸 - 电离飞行时间质谱法 (MALDI-TF/MS), 也被称为生物质谱, 可以直接测定偶联物的相对分子质量, 可作为一种直观的检测方法判定小分子是否与载体蛋白结合, 并可精确计算偶联物结合比半抗原与载体蛋白的结合比越 (M-MB)/ MA 式中 :A B 分别为半抗原和蛋白质, 其比值为偶联结合比 ;MA MB 和 M 分别表示半抗原蛋白偶联物的摩尔质量若是实验室具备仪器条件, 生物质谱法无疑是一 [44] 种快捷准确的方法王莹等用质谱法测定了 4 种真菌毒素与载体蛋白偶联物的结合比 3 问题与展望稳定并具有免疫原性的半抗原是农药人工抗原分子合成的前提和关键氨基甲酸酯类农药的结构相对比较简单, 都具有氨基甲酸酯的结构, 半抗原的合成具有一定的规律 (1) 从农药分子的共性结构 ( 氨基甲酸酯末端 ) 设计引入连接臂或活性基团, 为一大类农药分子人工抗原的合成提供了可行性, 如上述 3 种农药均是在氨基甲酸酯末端水解引入连接臂 ;( 2 ) 借鉴已合成的半抗原的方法, 在结构类似的农药分子上引入活性基团, 合成新的半抗原例如, 克百威与甲萘威水解后断裂部位相同, 参照甲萘威半抗原合成方法从克百威水解产物呋喃酚入手制备半抗原异丙威仲丁威等半抗原也可以用此种合成方法虽然氨基甲酸酯农药的人工抗原合成有可参考 106

7 瞿巧钰, 等 : 三种常用氨基甲酸酯类农药人工抗原合成方法的设计与优选 2013 年 12 月的合成路径, 但是方法中也存在一些问题 :(1) 活化酯法合成免疫原时, 水容易被引入而影响实验的成败 ; (2) 传统蛋白的纯化, 透析需要经过较长的时间, 凝胶层析所需时间较短, 但操作相对复杂 ;( 3 ) 偶联物的定性方法较为简单, 但不能准确判断偶联情况以及结合比的计算针对以上问题, 需要我们严格控制实验的操作条件和方法, 避免引入其他物质而对目标物质的形成和保存产生影响 ; 农药人工抗原的合成过程中涉及有机化学知识, 全面系统地掌握化学知识有利于从根本上掌握人工抗原设计与合成的原理 ; 对于人工抗原的定性, 可以采用 ESI-MS,MALDI-TF-MS 等方法进行更加快捷精确的确证成功合成高质量的人工抗原是制备特异性抗体的关键氨基甲酸酯类农药人工抗原的合成已初见成效并有一定规律可循, 因此, 此类农药人工抗原的合成以及免疫技术的开发与建立将有一个较大的发展参考文献 : [1] 武中平, 高巍, 杨红, 等. 氨基甲酸酯类农药残留测定方法的研究进展 [J]. 江苏化工,2004(5):24-27,53. [2] 胡芹芹. 蔬菜中氨基甲酸酯类农药残留快速检测技术研究 [D]. 武汉 : 华中师范大学,2009. [3] aballo-lopez A, MDLD. ontinuous ultrasound-assisted extraction coupled to on line filtration -solid -phase extraction -column liquid chromatography-post column derivatisation-fluorescence detection for thedetermination ofn-methylcarbamatesin soil and food[j]. Journalof hromatographya,2003,998: [4] 郝学飞, 董小海, 钟红舰, 等. 氨基甲酸酯类农药残留检测方法对比研究 [J]. 食品科学,2010(2): [5] Barbora Mickova, Jitka Zrostlikova, Jana Hajslova, et al. orrelation study of enzyme-linked immunosorbent assay and high-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry for the determination of N-methyl carbamate insecticides in baby food [J]. Analyticahimica Acta,2003,495: [6] MarcoMaria-Pilar,GeeJShirley,heng Hong M,et al.development of an enzyme-linked immunosorbent assay for carbaryl[j]. Journalof Agri 原 culturalfood hemistry,1993,41: [7] Antonio Abad, Angel Montoya. Production of monoclonal antibodies for carbaryl fromahapten preserving the carbamate group [J]. Journalof A 原 griculturaland Food hemistry,1994,42(8): [8] Antonio Abad, Mara 覦忆 Jose 忆 Moreno, Angel Montoya. Development of monoclonal antibody-based immunoassays to the N-methyl carbamate pesticide carbofuran[j]. Journal of Agricultural and Food hemistry, 1999,47(6): [9] Brady FJames, Fleeker RJames, Wilson ARichard, et al. Enzyme im 原 munoassay for aldicarb[j]. American hemical Society,1988,doi: : [10] 张彦峰, 戴树桂, 高志贤, 等. 杀虫剂涕灭威的半抗原抗原和抗体及其制备方法与应用 [P]. 中国 : , [11] 贲亚琍, 朱德锐, 刘德立, 等. 农药人工抗原合成方法的设计与优选 [J]. 农药,2008(1): [12] 张文元, 杨亚冬. 农药小分子半抗原合成的研究与应用 [J]. 农药研究与应用,2007(6):7-10. [13] 张奇. 倍硫磷和速灭威半抗原分子设计及其免疫效果研究 [D]. 南京 : 南京农业大学,2007. [14] 罗永宏, 宋超, 陈家长, 等. 氨基甲酸酯类农药甲萘威的毒理学及环境归趋研究进展 [J]. 江苏农业科学,2012(1): ,321. [15] Abad A, Primo JA. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay to carbaryl antibody production from several haptens and charac 原 terization in different immunoassay formats[j]. Journal of Agricultural Food hemistry,1997,45: [16] 刘曙照, 冯大, 钱传范, 等. 甲萘威酶联免疫吸附分析技术研究 [J]. 农药学学报,1999(1): [17] 许艇. 杀虫剂西维因单克隆抗体的研制及鉴定 [J]. 免疫学杂志, 2004(1): [18] WangShuo, Yu hun-di, Wang Jun-ping, et al. Enzyme immunoassay for the determination of carbaryl residues in agricultural products[j]. Food Additives and ontaminants,2005,22(8): [19] Wang Shuo, Robin DAllan, Amanda S, et al. Rapid enzyme immunoas 原 says for the detection of carbaryl and methoprene in grains[j]. Journal of Environmental Science and Health part B:-Pesticides Food on 原 taminants and AgriculturalWastes,2002,37(6): [20] Wang Shuo, Yu hun-di, Zhang Yan, et al. Tube-immunoassay for rapid detection of carbaryl residues in agricultural products [J]. Journal of EnvironmentalScience,2007,41(5): [21] Miguel A, Gonza 忆 lez-mart 覦忆 nez, Sergi Morais, et al. Monoclonal anti 原 body-based flow-through immunosensor for analysis of carbaryl [J]. Analyticalhemistry,1997,69(14): [22] 王硕. 西维因抗体库的构建及特异性克隆的筛选 [J]. 食品研究与开发,2012(7): [23] 杨耀军. 西维因人工抗原的合成新方法 [J]. 过程工程学报,2005 (2): [24] 张灿. 农药西维因快速检测试纸条的研究开发 [D]. 天津 : 天津科技大学,2006. [25] Dong Ting-ting,SunJing-wei, Liu Bing, et al. Development of asensi 原 tivity-improved immunoassay for the determination of carbaryl in food 107

8 农业资源与环境学报第 30 卷第 6 期 samples[j]. Societyof hemicalindustry,2010,90: [26] Zhu Guo-nian, Jin Mao-jun, Gui Wen-jun, et al. Development of a direct competitive enzyme-linked immunoassay for carbofuran in veg 原 etables[j]. Foodhemistry,2008,107(4): [27] Gui Wen-jun, Jin Mao-jun, Sun Li-feng, et al. Residues determina 原 tion of carbofuran in vegetables based on sensitive time-resolved fluo 原 rescenceimmunoassay[j]. Food and AgriculturalImmunology,2009,20 (1): [28] 朱德锐. 呋喃丹半抗原合成与多克隆抗体制备及其检测应用 [D]. 武汉 : 华中师范大学,2011. [29] Zhang Yan-feng, Gao Zhi-xian, Zhang Qing-min, et al. Anew hapten for immunoassay of aldicarb[j]. hinese hemical Letters,2006(8): [30] Lai Khai Siew,Larry AWinger,Julia ASpoors, et al.monoclonal an 原 tibodies useful in sensitive immunoassays for aldicarb in either labora 原 tory or the field[j]. International Journal of Environmental Analytical hemistry,2003,83(5): [31] henjun-jie,jiangjin-qing.monoclonal antibody-based solvent tol 原 erable indirect competitive ELISA for monitoring ciprofloxacin residue inpoultrysamples[j]. Food andagriculturalimmunology,2013,24(3): [32] Yang Jin-yi, Wu Qing, Wang Hong, et al. Production and identifica 原 tion of high affinity monoclonal antibodies against pesticide carbofuran [J]. AgriculturalSciences inhina,2007(9): [33] Yang Jin-yi, Wang Hong, Jiang Yue-ming, et al. Development of an enzyme-linked immuno-sorbent assay(elisa)method for carbofuran residues[j]. Molecules,2008,13(4): [34] 刘成梅, 黄丽, 罗舜菁, 等. 氨苄青霉素人工抗原的制备及鉴定 [J]. 生物工程食品科学,2007,28(9): [35] 龚雄麒, 仲伯华. 蛋白质交联方法及其应用 [J]. 国外医学药学分册,1988(2): [36] Rinehart KL, Namikoshi M, ho BW. Structure and bio-synthesis of toxinsfromblue-greenalage(cyanobacteria)[j]. ApplPhycol,1994(6): [37] 王悦秋, 宋娟, 王榕妹, 等. 半抗原的设计修饰及人工抗原的制备 [J]. 分析化学评述与进展,2010,38(8): [38] 杨金易, 吴青, 王弘, 等. 高亲和力的农药克百威单克隆抗体的制备及鉴定 [J]. 中国农业科学,2007(3): [39] 张丽芳, 李伟岭, 薛飞群. 人工抗原的鉴定 [J]. 畜牧与饲料科学, 2009,30(10): [40] 陈建波, 王云飞, 奚道珍, 等. 克百威及其代谢产物残留分析方法研究进展 [J]. 农药科学与管理,2011(3): [41] 王静, 魏朝俊, 赵建庄, 等. 溴氰菊酯人工抗原的合成及偶联比的测定 [J]. 北京农学院学报,2006(4): [42] 朱国念, 吴银良, 程敬丽, 等. 克百威人工抗原的合成与鉴定 [J]. 浙江大学学报 : 农业与生命科学版,2002(1): [43] 许艇, 李季, 李兴海, 等. 杀虫剂西维因特异性多克隆抗体的制备及鉴定 [J]. 农业环境科学学报,2003(6): [44] 王莹, 王希春, 金福源, 等. 质谱法测定 4 种真菌毒素与载体蛋白偶联物的结合比 [J]. 分析检测,2012,33(2):

第期甘金华等强力霉素人工抗原的合成与抗体制备材料与方法试剂及溶液

第期甘金华等强力霉素人工抗原的合成与抗体制备材料与方法试剂及溶液第卷第期年月食品与生物技术学报强力霉素人工抗原的合成与抗体制备甘金华邓薇李进平艾晓辉中国水产科学研究院长江水产研究所湖北荆州武汉纺织大学环境与城建学院湖北武汉采用改进的碳二亚胺两步法将强力霉素半抗原与载体蛋白连接制备强力霉素牛血清白蛋白人工免疫抗原并用同样方法将强力霉素与载体蛋白连接制备人强力霉素卵清白蛋白人工包被抗原经紫外扫描分析和动物免疫试验证实强力霉素人工抗原合成成功

农业资源与环境学报 Journal of Agricultural Resourcesand Environment 2013 年 12 月 第 30 卷 第 6 期 : December2013 Vol.30 No.6: 三种常用氨基甲酸酯类农药人工抗原合成方法的设计与

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