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衡邑凤
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1 中国组织工程研究与临床康复第 14 卷第 21 期出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research May 21, 2010 Vol.14, No.21 壳聚糖 - 肝素静电自组装多层膜在钛表面进行的生物化修饰 ** 舒瑶 1, 李全利 2, 欧国敏 3, 宫苹 3 1, 邹敬才 Titanium surface modification with chitosan-heparin multilayers using electrostatic self-assebly technique Shu Yao 1, Li Quan-li 2,Ou Guo-min 3, Gong Ping 3, Zou Jing-cai 1 1 Department of Stomatology, Affiliated Hospital of the Academy of Military Medical Sciences of Chinese PLA, Beijing , ; 2 College of Stomatology, Anhui Medical University, Hefei , Anhui Province, ; 3 Department of Prosthodontics, West College of Stomatology, Sichuan University, Chengdu , Sichuan Province, Shu Yao, Master, Physician, Department of Stomatology, Affiliated Hospital of the Academy of Military Medical Sciences of Chinese PLA, Beijing , lanzhushuyu@ yahoo.com.cn Correspondence to: Li Quan-li, Doctor, Associate professor, College of Stomatology, Anhui Medical University, Hefei , Anhui Province, ql-li@126.com Correspondence to: Ou Guo-min, Doctor, Associate professor, College of Stomatology, Anhui Medical University, Hefei , Anhui Province, Supported by: the Natural Science Foundation of Anhui Higher Educootion Institutions, No. KJ2009A169*; Scientific and Technological Program of Anhui Province, No * Received: Accepted: Abstract BACKGROUND: Based on the consecutive adsorption of polyanions and polycations via electrostatic interactions, electrostatic self-assebly (ESA) technique has emerged as a versatile, inexpensive yet efficient technique to build biologically active surfaces for modification of biomaterial surface. OBJECTIVE: Bioactive chitosan and heparin multilayers fixed on titanium surface via ESA technique are expected to be a new biologic surface to improve the cell biocompatibility of titanium. METHODS: The film growth was initialized by depositing one layer of positively charged poly-l-lysine (PLL) on the NaOH-treated titanium substrate (negatively charged surface). Then, the film was formed by the alternate deposition of negatively charged heparin (Hep) and positively charged chitosan (Chi) via electrostatic interactions of polyelectrolytes, and terminated with an outermost layer of Chi. The chemical composition, surface topography as well as roughness were investigated by using diffuse reflectance Fourier transform infrared spectroscopy (DR-FTIR), scanning electric microscope (SEM) and atomic force microscope (AFM), respectively. We cultured osteoblasts on the surface of modified-titanium (Ti/Chi) and pure Ti (cpti) respectively in vitro to observe morphologic change of cell attachment and spreading by SEM, and to estimate cell proliferation and differentiation by MTT test and ALP activity analysis. RESULTS AND CONCLUSION: The analysis of DR-FTIR, SEM, and AFM confirmed that Chi-Hep multilayers formed gradually on the titanium surface. The film could improve the adherence, proliferation and differentiation of osteoblast. These results may provide a basis for the preparation of titanium surface modification for dental implants. Shu Y, Li QL,Ou GM, Gong P, Zou JC. Titanium surface modification with chitosan-heparin multilayers using electrostatic self-assebly technique. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(21): [ 摘要背景 : 基于聚电解质阴阳离子交替组装的静电自组装技术可在温和简单易控的条件下实现多种生物大分子在材料表面的固定, 已成为生物材料表面设计的重要手段目的 : 利用静电自组装技术将具有生物活性的壳聚糖和肝素固定在钛表面, 实现钛表面的氨基多糖生物化修饰, 构建一种钛种植体材料的新型生物化表面, 以改善钛的细胞相容性方法 : 首先采用 NaOH 处理钛基材, 获得多孔负电荷的钛表面 ; 然后吸附一层正电荷的聚赖氨酸 ; 最后, 多次交替吸附负电荷的肝素和正电荷的壳聚糖, 形成以壳聚糖为最外层的多层膜结构通过漫反射红外光谱扫描电镜和原子力显微镜对多层膜进行表征并与成骨细胞共培养, 观察成骨细胞的黏附增殖以及分化情况结果与结论 : 红外光谱原子力显微镜扫描电镜结果表明肝素 - 壳聚糖多层膜逐渐形成此涂层可促进成骨细胞的黏附增殖和分化肝素 - 壳聚糖多层膜有望成为一种新型的生物化钛表面, 从而改善钛表面的生物相容性关键词 : 静电自组装 ; 钛 ; 表面改性 ; 壳聚糖 ; 肝素 doi: /j.issn 舒瑶, 李全利, 欧国敏, 宫苹, 邹敬才. 壳聚糖 - 肝素静电自组装多层膜在钛表面进行的生物化修饰 [J]. 中国组织工程研究与临床康复,2010,14(21): [ 0 引言目前, 口腔种植修复在得到广泛发展和应用的同时, 也存在着植入后愈合时间较长等问题因为种植体材料钛属于生物惰性材料, 植入后只能被动地与骨组织进行整合 [1] 而对种植体进行表面修饰或处理, 增强其生物活性 ( 如诱导骨形成细胞的黏附增殖和分化 ), 是解决上述问题的重要途径 [2] 目前, 利用生物化修饰技术, 将具有骨诱导性的活性分子如多肽 (RGD 序列等 ) 特殊蛋白质氨基多糖等固定于钛材表面, 形成特异性的生物活性膜, 以期主动识别和诱导成骨细胞, 加快骨整合, 是目前研究的热点之一 [3-5] 本实验引入层层自组装 (layer by layer self-assemble), 又叫静电自组装 (electrostatic self-assemble,esa) 技术对钛表面进行生物化修饰 ESA 是在表面荷电的基材表面通过静电相互作用, 交替地吸附上聚电解质阴离子和阳离子它可以实现分子在纳米亚微米尺度的有序结构设计 [6] 所形成的涂层比普通的物 3832

2 理吸附更加稳定 ; 与传统的化学固定法相比, ESA 对所固定分子的化学键要求小, 条件简单温和, 能更好地保持分子的活性 [7] 该技术在生物医用材料领域的研究中已得到了广泛的应用 [8-9] 21 世纪初, 学者开始进行钛表面的 ESA 多层膜的构建研究 [10-12] [7] Cai 等首先利用 ESA, 在钛膜表面构建了明胶和壳聚糖自组装多层膜 ( 最外层为明胶 ), 并发现改性钛有利于成骨细胞黏附生长后续报道发现, 当最外层是壳聚糖时, 亦具有良好的生物相容性, 并且多层膜在室温下的 PBS 溶液中至少可保持 3 周的稳定 [13] ESA 的基础是基材表面荷电钛材表面本身含有少量羟基, 生理 ph 范围内带负电 [14] 有研究表明, 大分子物质的吸附与羟基的数量和表面能的极性组分有关 [15] 同时, 孔隙直径在亚微米 (200~300 nm) 级别的多孔钛表面利于蛋白的吸附, 并能减少大分子的释放 [16] 碱热处理钛材能增加其表面的羟基数量表面能和亲水性, 使钛表面具备多孔亚微米形态 [17], 进而增强钛基材与聚电解质大分子的反应性因此, 本实验采用碱热处理钛材, 获得富含羟基多孔负电荷的表面壳聚糖和肝素可以在一定 ph 范围内形成带相反电荷的聚电解质溶液 ( 即聚阳离子和聚阴离子 ), 为利用 ESA 来构建两者的多层膜结构提供可能壳聚糖因其良好的生物相容性可降解性低毒性和低廉的价格, 被广泛用于生物医学各个领域 [18-19] 在钛表面改性的应用, 多是参与磷酸钙 / 羟基磷灰石复合涂层的研究 [20-21], 或是直接通过有机硅烷化学偶联的方式进行钛表面改性 [22] 壳聚糖在结构上与细胞外基质中重要的氨基多糖糖胺多糖 (GAGs) 相似, 后者可与各种细胞因子如生长因子受体黏附蛋白等相结合来调控细胞的黏附与生长 [23-24], 并且在骨矿化过程中起着重要的调节作用 [25] 肝素是一种聚阴离子氨基多糖, 也是细胞外基质的一种成分, 可以和多种生长因子结合, 从而调控细胞的行为目前尚未见利用壳聚糖和肝素在纯钛片表面进行静电自组装的报道实验拟利用壳聚糖和肝素进行静电自组装, 在钛表面构建生物活性多层膜通过观察改性前后的钛对成骨细胞的影响, 来考察这种生物化修饰方法是否有利于钛表面细胞相容性的改善 1 材料和方法设计 : 随机对照细胞学实验时间及地点 : 材料制备及细胞实验于 / 在四川大学华西口腔医学院, 口腔疾病研究国家重点实验室完成, 部分检测于西南交通大学材料科学与工程学院, 材料先进技术教育部重点实验室完成材料 : 清洁级新生 SD 乳鼠, 体质量 (15± 5) g, 雌雄不拘, 由四川大学华西医学中心实验动物中心提供, 实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部 2006 年颁布的关于善待实验动物的指导性意见标准 [26] 主要试剂及仪器 : 试剂及仪器来源商业纯钛陕西宝鸡有色金属工业公司多聚赖氨酸 (PLL) 美国 Sigma 公司 MTT 壳聚糖 (Chi) 浙江玉环海洋生物有限公司胰蛋白酶 Gibco DMEM 培养液小牛血清四川成都哈里生物工程有限公司肝素钠 (Hep) 上海索莱宝生物科技有限公司原子力显微镜 SPI3800N Seiko,Japan 扫描电镜 N,Hitachi,Japan 多孔板高效分析仪 HTS 7000 plus,perkin ELMER,U.S.A. 实验方法 : 多层膜的制备 : 商业纯钛切割成直径 13 mm, 厚 2 mm 的纯钛片, 抛光至镜面状态依次用丙酮无水乙醇蒸馏水超声清洗, 室温干燥处理至此的未经改性的钛片记作纯钛组 (CpTi) 将部分清洁钛片置于 60 5 mol/l NaOH 溶液中, 浸泡 24 h 接着置于 80 的双蒸水中浸泡 20 h, 进一步反应然后于双蒸水中超声清洗, 反复漂洗, 室温干燥处理至此的记作 Ti-OH 将壳聚糖溶解于体积分数 1% 醋酸中, 制备成 ph=4, 质量浓度 5 g/l 的聚阳离子溶液肝素钠溶解于双蒸水中, 制备成相同 ph 值和浓度的聚阴离子溶液多聚赖氨酸溶解于 PBS 中, 制备成 ph=7.2 质量浓度 2.5 g/l 的聚阳离子溶液 NaOH 处理后的钛片浸泡在 PLL 溶液中 30 min, 表面获得一层稳定的正电荷以引发静电自组装, 记作 Ti/PLL 接下来将钛片依次浸泡在肝素和壳聚糖溶液中, 交替反复进行 1 解放军军事医学科学院附属医院口腔科, 北京市 ; 2 安徽医科大学口腔医学院, 安徽省合肥市 ; 3 四川大学华西口腔医学院, 四川省成都市舒瑶, 女, 1983 年生, 四川省大竹县人, 汉族,2008 年四川大学华西口腔医学院毕业, 硕士, 医师, 主要从事口腔种植材料的相关研究 lanzhushuyu@ yahoo.com.cn 通讯作者 : 李全利, 博士, 副教授, 安徽医科大学口腔医学院 / 安徽口腔疾病研究省级实验室, 安徽省合肥市 ql-li@126.com 通讯作者 : 欧国敏, 博士, 副教授, 四川大学华西口腔医学院, 四川省成都市 guominou66@ yahoo.com 中图分类号 :R318 文献标识码 :B 文章编号 : (2010) 收稿日期 : 修回日期 : ( /WL H) ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH 3833

3 每次浸泡 10 min, 双蒸水漂洗 1 min 这个循环过程重复 10~18 次, 确保最后一层是壳聚糖分子, 室温干燥, 记作 Ti/PLL/(Hep-Chi) n (n= 循环的次数 ) 并将 Ti/PLL/(Hep-Chi) 18 记作改性组 (Ti/chi) 所有钛片均置于干燥箱密封保存, 以备进一步的检测和细胞实验用表面成分分析和形貌观察 : DR-FTIR: 将纯钛片 NaOH 溶液处理后的钛片 PLL 溶液处理后的钛片改性后的涂层钛片分别作漫反射红外光谱 (DMR-FTIR;agna-IR 550,Nicolet, Madison,Am) 分析, 定性分析表面化学组成原子力显微镜 : 用原子力显微镜在轻敲模式下观察 NaOH 溶液处理后的钛片改性后的涂层钛片表面纳米级别的超微形貌扫描探针为标准硅探针, 扫描速度频率为 1 Hz, 选择 5 µm 2 µm 的微区采集图像, 点阵存储, 所有操作均在大气及室温干燥状态下进行扫描电镜 : 用扫描电镜观察 NaOH 溶液处理后的钛片吸附不同层数聚电解质的钛片的表面形貌, 照相记录成骨细胞培养 : 成骨细胞来源于新生 SD 乳鼠的颅顶骨通过连续的胰蛋白酶溶液消化分离得到细胞, 培养于含 5 ml DMEM 培养液体积分数为 10% 小牛血清的 25 ml 培养瓶内, 存放在 37 含体积分数为 5%CO 2 的密封培养箱中培养液每 3 d 更换 1 次传代时, 培养瓶内的细胞层用 PBS 轻洗 2 次后加入 0.25% 胰蛋白酶溶液约 1 ml, 在培养箱中消化 3~5 min 使细胞分离, 室温下加入少许 DMEM 培养液终止消化, 吹打形成单细胞悬液, 转移到 2 或 3 瓶培养瓶中, 加够 5 ml DMEM 培养液继续培养至两三代的成骨细胞经碱性磷酸酶活性检测及矿化检测鉴定后, 在接下来的实验中使用细胞初期黏附的形态学观察 : 将纯钛组 (CpTi) 和改性组 (Ti/chi) 两组钛片分别放入 24 孔板中, 以密度 L -1 接种第 3 代成骨细胞, 分别于接种 4,24 h 后取样每个时间点上将两组样品用 PBS 轻洗 3 遍后, 置于 4 预冷的 2.5% 戊二醛溶液中固定,4 冰箱过夜待样本取全后, 经体积分数为 30% 50% 75% 85% 95% 100% 的梯度乙醇脱水各 15 min, 立即浸泡入醋酸异戊酯中置换, 然后临界点干燥真空喷金, 在扫描电镜 (Philips,FEI inspect F,Holland) 下观察细胞增殖情况检测 : 活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶能使外源性的 MTT 还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞内通过测定结晶物的吸光度 (A) 值来反映活细胞数或细胞活力将两组钛片放入 24 孔板中, 以密度 L -1 接种细胞, 每孔 1 ml 细胞悬液分别于接种的 1,4,7 d, 利用 MTT 法检测细胞增殖情况 PBS 轻洗后, 每孔加 3834 入 40 µl MTT(5 g/l) 和 1 ml 新鲜培养液, 放入培养箱中 4 h 小心吸弃孔中液体, 每孔加入 420 µl 二甲基亚砜再培养 0.5 h 待结晶物充分溶解后, 将孔内液体转移至 96 孔板, 利用多孔板高效分析仪在 570 nm 波长处测其吸光度 (A) 值, 并统计分析细胞分化能力分析 : 在碱性磷酸酶的作用下, 碱性磷酸酶测定工作液中的底物 ( 磷酸对硝基苯酚 ) 被分解为磷酸和黄色的对 - 硝基酚 (PNP) 测定样品的 A 值, 可以反应样品中的碱性磷酸酶活力将两组钛片放入 6 孔板中, 以密度为 L -1 接种细胞, 每孔 2 ml 细胞悬液于培养 7 d 后取样样本表面用胰蛋白酶消化法使细胞脱落形成细胞悬液,1 000 r/min 离心 8 min, 弃上清液, 加入 5 ml PBS 混匀, 再 r/min 离心 8 min, 弃上清液, 加入 120 µl PBS, 混匀后转移至 EP 管中,-20 冻存反复冻融 3 次后在冰浴中超声乳化 30 min 在高效分析仪上设定活力检测程序用 PBS 作为样本空白, 每孔 40 µl, 十二通道加样枪每孔加样本 40 µl, 将 96 孔板置于载板台上, 吸取 230 µl 37 保温的碱性磷酸酶测定工作液加入相应行, 在分析仪中 37 恒温振荡孵育 60 s,405 nm 波长读数分析仪自动显示每隔 60 s 共 4 次的原始吸光度, 减去空白的吸光度及双份样本的吸光度均值将吸光度均值导入 Excel, 计算出每分钟平均吸光度变化 (ΔA/min), 乘以系数 0.443, 求出样本中碱性磷酸酶活力 ( nkat/ml) 2 结果 2.1 材料表面漫反射红外光谱 (DR-FTIR) 分析与纯钛相比, NaOH 处理的钛片的 FTIR 光谱出现了 cm -1 宽峰 ( 见图 1) Figure 1 Diagram of diffuse reflectance Fourier transform infrared spectroscopy of untreated titanium (Ti), NaOH-treated titanium (TiOH), PLL-coated titanium (TiPLL) and multilayer coated titanium (coated Ti) 图 1 FTIR 光谱图图 1 中上方的两线所示, 说明表面富含 -OH 吸附了 PLL 的钛 ( 见图 1 灰线 ) 和 NaOH 处理的钛相比, 在 1 643,1 543 cm -1 出现的峰代表酰氨 Ⅰ 带酰氨 Ⅱ 带, cm -1 为烷基峰, 均符合多肽的特征, 说明 PLL 成

功在钛表面吸附参考文献 [27] 并结合本实验所用壳聚糖的脱乙酰度和结晶度, 总结出单一壳聚糖膜的 FTIR 光谱的两个特征峰值为 1

中最下方黑线所示 ), 发现了这两个特征吸收峰的存在光谱图中同时也出现了很窄的肝素磺酸基团的特征吸收峰, 1 218 cm -1 和 872

2 材料表面扫描电镜观察扫描电镜图像显示 : NaOH 处理的钛片表面形成了均匀的微孔 / 网状结构 ( 见图 2),

images of sample surfaces: Ti/PLL/(Hep-Chi) 16 图 4 扫描电镜图像 : 涂覆 16 层

高倍下基本看不到明显颗粒存在 a: 5 000 b: 10 000 Figure 2 Scanning electron microscope

处理后的钛片表面 Figure 5 Scanning electron microscope images of sample

Hep-Chi 层数的增加, 网状结构逐渐消失, 最终形成了较平滑均匀的表面涂敷 10 层左右时, 还可以看到部分网状结构 ( 见图 3,

3 材料表面原子力显微镜观察 NaOH 处理的钛表面, 在扫描电镜中显示为网状结构, 在原子力显微镜图像 ( 见图 6a,b)

7 相比之下, 改性后的涂层钛表面 ( 见图 6c,d) 要平缓些, 表现为球形颗粒重叠聚集, 颗粒间隔在纳米级别,Ra=49.

Scanning electron microscope images of sample surfaces:

网状结构基本消失 ( 见图 4a), 放大至 30 000 倍可见密集排列的多聚糖颗粒 ( 见图 4b) c:

4 功在钛表面吸附参考文献 [27] 并结合本实验所用壳聚糖的脱乙酰度和结晶度, 总结出单一壳聚糖膜的 FTIR 光谱的两个特征峰值为 cm -1 和 926 cm -1 左右观察改性后的涂层钛 (Ti/PLL/(Hep-Chi) 18 ) 的光谱 ( 图 1 中最下方黑线所示 ), 发现了这两个特征吸收峰的存在光谱图中同时也出现了很窄的肝素磺酸基团的特征吸收峰, cm -1 和 872 cm -1 上述特征说明壳聚糖肝素成功整合到了钛表面 2.2 材料表面扫描电镜观察扫描电镜图像显示 : NaOH 处理的钛片表面形成了均匀的微孔 / 网状结构 ( 见图 2), 空隙大小为微米及亚微米级 a: b: Figure 4 Scanning electron microscope images of sample surfaces: Ti/PLL/(Hep-Chi) 16 图 4 扫描电镜图像 : 涂覆 16 层 Hep-Chi 的钛片表面而吸附至 18 层左右时, 较平滑致密的涂层表面已经形成 ( 见图 5), 在高倍下基本看不到明显颗粒存在 a: b: Figure 2 Scanning electron microscope images of sample surfaces: NaOH-treated surface 图 2 扫描电镜图像 :NaOH 处理后的钛片表面 Figure 5 Scanning electron microscope images of sample surfaces: Ti/PLL/(Hep-Chi) 18 图 5 扫描电镜图像 : 涂覆 18 层 Hep-Chi 的钛片表面随着吸附的 Hep-Chi 层数的增加, 网状结构逐渐消失, 最终形成了较平滑均匀的表面涂敷 10 层左右时, 还可以看到部分网状结构 ( 见图 3, 箭头所标 ) 2.3 材料表面原子力显微镜观察 NaOH 处理的钛表面, 在扫描电镜中显示为网状结构, 在原子力显微镜图像 ( 见图 6a,b) 则表现为密集排列的锥形颗粒, 颗粒大小为亚微米级,Ra 值 =65.7 相比之下, 改性后的涂层钛表面 ( 见图 6c,d) 要平缓些, 表现为球形颗粒重叠聚集, 颗粒间隔在纳米级别,Ra=49.4 a: a: Ti-OH (bar: 5 µm) b: Ti-OH (bar: 2 µm) b: Figure 3 Scanning electron microscope images of sample surfaces: Ti/PLL/(Hep-Chi) 10 图 3 扫描电镜图像 : 涂覆 10 层 Hep-Chi 的钛片表面涂敷 16 层左右, 网状结构基本消失 ( 见图 4a), 放大至倍可见密集排列的多聚糖颗粒 ( 见图 4b) c: Ti/PLL/(Hep-Chi)18 (bar: 5 µm) d: Ti/PLL/(Hep-Chi)18 (bar: 2 µm) Figure 6 Topography atomic force microscope images of sample surfaces: NaOH-treated titanium (Ti-OH) and modified titanium [Ti/PLL/(Hep-Chi) 18] 图 6 原子力显微镜图像 :NaOH 处理后的钛片表面和改性后 ( 涂覆 18 层 Hep-Chi) 的钛片表面 ISSN CN /R CODEN: ZLKHAH 3835

2.4 细胞初期黏附的形态学观察与材料表面接触后, 细胞即发生黏附铺展和迁移一系列最初的反应细胞在材料上的初期黏附是其进一步生长分化的基础, 也是衡量材料生物相容性的重要指标之一接种 4 h 时, 部分细胞已随机贴壁生长 ( 见图 7a) 在纯钛表面, 附着细胞相对少且扁平而在改性钛表面, 附着的细胞多, 体积大且丰满, 并伸出细胞突起贴附于材料表面 ( 见图 7b) 明显差异而到第

4 Pure titanium Modified titanium 1 d 4 d 7 d Figure 9 Proliferation of osteoblasts cultured on pure titanium and modified titanium evaluated by MTT test at 1, 4 and 7 days 图 9 两组钛片表面细胞增殖 MTT 检测的 A

后纯钛及改性钛表面成骨细胞定植的扫描电镜图像 24 h 后, 细胞完全铺展开, 彼此间相互连接与纯钛组 ( 见图 8a) 相比, 改性钛组 ( 见图 8b) 黏附的细胞立体而丰满, 细胞突起多且附着紧密, 表明改性钛与细胞间的结合更强, 更利于细胞早期黏附以及细胞间的相互反应 2.

67 nkat/l) 14 12 10 8 6 4 2 0 7 d Pure titanium Modified titanium Figure 10 Alkaline phosphatase activity of osteoblasts cultured on pure titanium and modified titanium 图 10 两组钛片表面细胞碱性磷酸酶活力值比较 a:

5 2.4 细胞初期黏附的形态学观察与材料表面接触后, 细胞即发生黏附铺展和迁移一系列最初的反应细胞在材料上的初期黏附是其进一步生长分化的基础, 也是衡量材料生物相容性的重要指标之一接种 4 h 时, 部分细胞已随机贴壁生长 ( 见图 7a) 在纯钛表面, 附着细胞相对少且扁平而在改性钛表面, 附着的细胞多, 体积大且丰满, 并伸出细胞突起贴附于材料表面 ( 见图 7b) 明显差异而到第 4,7 天时, 改性钛表面细胞增殖情况明显优于纯钛组, 差异有非常显著性意义 (P < 0.01), 见图 9 A Pure titanium Modified titanium 1 d 4 d 7 d Figure 9 Proliferation of osteoblasts cultured on pure titanium and modified titanium evaluated by MTT test at 1, 4 and 7 days 图 9 两组钛片表面细胞增殖 MTT 检测的 A 值比较 a: CpTi surface b: Ti/chi surface Figure 7 Scanning electron microscope images of osteoblasts adhesion on pure titanium and on modified titanium at 4 hours after seeding 图 7 接种 4 h 后纯钛及改性钛表面成骨细胞定植的扫描电镜图像 24 h 后, 细胞完全铺展开, 彼此间相互连接与纯钛组 ( 见图 8a) 相比, 改性钛组 ( 见图 8b) 黏附的细胞立体而丰满, 细胞突起多且附着紧密, 表明改性钛与细胞间的结合更强, 更利于细胞早期黏附以及细胞间的相互反应 2.6 细胞分化能力分析细胞培养至第 7 天时, 成骨细胞进入分化和功能成熟期, 这时检测两组碱性磷酸酶的活力, 改性钛组的碱性磷酸酶活力明显高于纯钛组, 差异有显著性意义 (P < 0.05), 说明改性钛可促进细胞分化, 见图 10 Activity ( nkat/l) d Pure titanium Modified titanium Figure 10 Alkaline phosphatase activity of osteoblasts cultured on pure titanium and modified titanium 图 10 两组钛片表面细胞碱性磷酸酶活力值比较 a: CpTi surface 3 讨论 b: Ti/chi surface Figure 8 Scanning electron microscope images of osteoblasts adhesion on pure titanium and modified titanium at 24 hours after seeding 图 8 接种 24 h 后纯钛及改性钛表面成骨细胞黏附的扫描电镜图像 2.5 细胞增殖情况检测在实验的第 1 天, 两组间 MTT 结晶物的 A 值差异无显著性意义 (P > 0.05), 细胞增殖无 3.1 多层膜的制备在材料的制备实验中, 钛片经 60 5 mol/l 的 NaOH 溶液处理 24 h 后, 表面获得了更多 -OH, 氧化钛层在生理 ph 范围内带上了较多负电, 实现了基材表面荷电, 这是静电自组装技术的基础, 同时获得了富含大量羟基的亲水性的具有微米亚微米级的多孔表面钛表面的羟基和表面能的极性分量与接下来的蛋白吸附固定有着重要的关系钛表面的羟基越多, 与蛋白的反应活性越高另一方面亲水性的具有微米亚微米级的多孔性质, 增加了钛表面的表面能和比表面积, 暴露更多的反应位点, 加强了钛表面与蛋白分子的反应活性因此, 这种多孔表面将加强钛表面对蛋白的载荷, 延长释放时间 3836

6 通过静电自组装方法来制备聚电解质多层膜, 制备技术简单环境要求低, 但影响膜生长的因素很多, 如基材表面的化学性质, 溶液 ph 值聚电解质大分子浓度等 [28] 本实验先利用碱热处理钛片, 增加了基材表面的亲水性和电荷密度, 为下一步吸附创造了较好的条件 [29] Stockton 等研究发现增加聚合物溶液的离子强度或者降低 ph 值均能降低离子间斥力, 从而使膜厚度增加本实验选择的 ph 值为 4 对于大分子制膜, 如果聚电解质溶液浓度偏大, 则溶液较为黏稠, 不利于制膜 ; 而浓度偏小, 则溶质分子含量少, 膜太薄, 也不易成膜 [30] 在实验中发现当壳聚糖和肝素浓度为 5 g/l 左右时, 两者形成的多层膜较平滑均匀, 厚度适中 3.2 改性材料的生物相容性评价壳聚糖具有明显的成骨样细胞黏附特性, 是因为脱乙酰化程度高的壳聚糖能使改性钛表面带正电荷且电荷密度高, 具备吸引带负电的蛋白和细胞的亲和力, 进而能促进细胞外基质蛋白 [31] 的吸附以及细胞的黏附 Haipeng 等亦有相似的结论当细胞黏附于材料表面后, 只有尽快表达增殖活性, 才能形成大量成骨细胞接种 24 h 后的电镜照片从一个侧面说明, 改性钛表面的成骨细胞更加立体而丰满, 细胞突起多且附着紧密, 具有旺盛的增殖活性 MTT 法是一种常用的定量检测活细胞的方法 MTT 实验结果显示, 虽然第 1 天两组间细胞增殖无明显差异, 待培养 4,7 d 后改性钛组的细胞增殖量却明显高于纯钛组, 表明细胞在改性材料表面生长和增殖更好, 这与 Cai [7,13] 等结果保持一致培养后期细胞增殖的原因可能是生物活性分子膜使细胞更好的贴附, 进而为细胞复层生 [32] 长提供了机会 Bumgardner 等以成骨细胞系 UMR106 为研究对象, 发现有壳聚糖涂层的钛表面, 细胞生长增殖优于未涂层组碱性磷酸酶是成骨细胞分化和功能成熟的早期标志 [33], 能够在碱性环境里催化磷酸酯的水解, 局部形成高浓度的磷离子, 促进骨基质矿化因此, 细胞内碱性磷酸酶活性越高, 表明成骨细胞分化程度越高, 矿化成骨能力越强当培养至 1 周左右, 成骨细胞进入分化和功能成熟期, 碱性磷酸酶活性逐渐增加, 与纯钛组相比, 改性钛组碱性磷酸酶活力显著增高, 表明固定的生物活 [13] 性分子膜促进了细胞的分化,Cai 等也得到了类似的 [34] [35] 结果 Klokkevold 等和 Lahiji 等分别发现壳聚糖处理的材料表面, 成骨细胞和软骨细胞的分化和合成功能增强结论 : 本实验通过对钛材料进行生物化修饰改性, 以期改善其生物相容性首先, 利用 ESA 技术, 肝素和壳聚糖通过静电相互作用, 交替吸附在了钛材料表面, 形成了壳聚糖 - 肝素多层膜, 实现了钛表面氨基多糖的生物化修饰通过 FTIR 扫描电镜原子力显微镜对钛材改性前后的表面特征分别进行检测分析, 表明以壳聚糖 - 肝素为组成的多层膜结构在钛表面成功构建通过体外细胞培养实验可以证实, 改性钛较纯钛更能促进成骨细胞的黏附生长增殖和分化, 说明本实验所使用的生物化改性方法有助于改善钛基种植体的生物相容性 4 参考文献 [1] Albrektsson T, Jacobsson M. 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7 [26] The Ministry of Science and Technology of the People s Republic of. Guidance suggestion of caring laboratory animals 中华人民共和国科学技术部. 关于善待实验动物的指导性意见 [27] Brugnerotto J, Lizardi J, Goycoolea FM, et al. An infrared investigation in relation with chitin and chitosan characterization. Polymer. 2001;42(8): [28] Deng LD, Sun DX, Dong AJ, et al. Huaxue Gongye yu Gongcheng. 2001;18(6): ,410. 邓联东, 孙多先, 董岸杰, 等. 聚电解质自组装复合多层膜的研究进展 [J]. 化学工业与工程,2001,18(6): ,410. [29] Stockton WB, Rubner MF. Molecular-level processing of conjugated polymers.4. Layer-by-layer manipulation of polyaniline via hydrogen-bonding interactions. Macromolecules. 1997;30(9): [30] Ma YF, Cai JY, Xia K. Dianzi Xianwei Xuebao. 2004;23(2): 马豫峰, 蔡继业, 夏科. 硫酸软骨素 / 壳聚糖自组装复合膜的制备和表征 [J]. 电子显微学报,2004,23(2): [31] Haipeng G, Yinghui Z, Jianchun L, et al. Studies on nerve cell affinity of chitosan-derived materials. J Biomed Mater Res. 2000; 52(2): [32] Bumgardner JD, Wiser R, Gerard PD, et al. Chitosan: potential use as a bioactive coating for orthopaedic and craniofacial/dental implants. J Biomater Sci Polym Ed. 2003;14(5): [33] Sibilla P, Sereni A, Aguiari G, et al. Effects of a hydroxyapatite-based biomaterial on gene expression in osteoblast-like cells. J Dent Res. 2006;85(4): [34] Klokkevold PR, Vandemark L, Kenney EB, et al. Osteogenesis enhanced by chitosan (poly-n-acetyl glucosaminoglycan) in vitro. J Periodontol. 1996;67(11): [35] Lahiji A, Sohrabi A, Hungerford DS, et al. Chitosan supports the expression of extracellular matrix proteins in human osteoblasts and chondrocytes. J Biomed Mater Res. 2000;51(4): 来自本文课题的更多信息 -- 基金资助 : 安徽省高等学校自然科学基金重点项目 (KJ2009A169); 安徽省科技攻关项目 ( ) 利益冲突 : 无利益冲突课题的创新点 : 采用静电自组装技术, 在钛表面构建了由壳聚糖和肝素组成的多层膜的氨基多糖生物化表面, 改善了钛种植体材料表面的细胞相容性结构此技术条件温和, 方法简单可控性好, 可以进一步用于转载生物活性因子的研究课题评估的金标准 : 人体硬组织修复材料的细胞学评价目前普遍采用成骨细胞体外培养的方法进行, 考察材料对其增殖和分化的影响课题以未改性钛和改性钛做平行对照研究, 分别从定性定量的两个方面考察它们对成骨细胞增殖和分化的影响设计或课题的偏倚与不足 : 缺乏多层膜的定量表征手段, 另外如果有体内研究结果, 论据就更充分提供临床借鉴的价值 : 实验采用了一种新的钛表面生物化修饰方法, 并对改性材料的生物相容性进行了初步的观察和分析, 多方面证实了改性材料良好的生物相容性, 有望构建一种新型的钛种植体改性材料 ISSN CN /R 2010 年版权归中国组织工程研究与临床康复杂志社所有 / 中国组织工程研究与临床康复 (CRTER) 杂志执行编委名单经过审稿工作的考核及编委会讨论, 聘任下述专家为本刊执行编委或青年审稿人, 聘任时间为 2010 年 5 月至 2011 年 5 月, 任期 1 年感谢这些执行编委和青年审稿人为保证本刊客观公正及时规范的审稿工作所做出的贡献干细胞研究方面 : 孙海英谭玉珍孟建波张文元张定国杨思远生物材料研究方面 : 王静曹阳朱毅敏刘贻尧朱晨辉闫立峰陈长水邓林红何艺生物工程相关研究方面 : 张小军潘海朗朱建炜殷渠东冯建民郑燕平陈统一李彦林周初松陆明戴文达张俐周全詹红生尚鹏神经系统相关研究方面 : 何朝晖师蔚徐俊孙建军刘海生周艳芳柏华五官及整形研究方面 : 余顺停徐凌刘继光吴凤鸣王立军姜笃根万伟东贾晓明内科及麻醉相关研究方面 : 王士雷刘畅外科及器官移植研究方面 : 江春平吴季霖聂峰周天保巫林伟龚瑾 CRTER 杂志执行编委及青年审稿人应具备的条件 : 教学医院科研或临床工作者, 有副高或以上职称者 ; 或主治医师 + 博士 + 海外学习或工作经历 ( 最好 ) 执行编委的工作任务 :1 能提出对文章选题科研设计学术水平创新性严谨性及对文章具体内容修改的质疑和评价 2 对每篇所审文章的研究背景创新要点应用意义不足之处等要给予 150~200 字的综合评价 3 审稿时间为每篇 3~7 天, 对文内修改可在 word 版上直接以批注形式修改 4 聘用时间为 1 年, 能够完成工作者, 将连任下一届, 不能完成相应工作时, 下一届将不再被聘任, 下一届聘任时间为 1 年后的同一月份被聘者将收到聘书和在杂志上发出聘任公告的杂志按照上述条件愿意成为本刊执行编委或青年审稿人的专家可自荐, 可登陆 oa.crter.org/ zglckf/ch/index. aspx 在线申请, 或将信息发至 : crter1200wsb@126.com 咨询电话 : 骨科相关研究方面 : 吴刚张汉庆陈晓明郭传友杨学义张震宇桂鉴超郭艾黄方敏刘刚张春霖徐瑞生吴啸波张永红 3838 中医及影像相关研究方面 : 徐瑞荣黄泳王晓梅许建荣江桂华李智勇李海云

《中国科学》A、E、G与F小开本版式设计

《中国科学》A、E、G与F小开本版式设计 E 2005, 35(3): 225~241 225 * (, 200062;, 200050;, 200062;, 200032).. 200....,..,,, 5~8 a [1].,.,, 30~50 a. 20 70,. 6. 180, 24,.,, 2004-04-17, 2004-12-09 * 973 ( : G2000067207-2) ( : 98Jc14015) 226 E 35,.,..,.,,,