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儒宫
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1 0 年月分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究 Chinese Journal of Analytical Chemistry 第期 ~ DOI:0.374/SP.J 高灵敏纳米金比色芯片检测乙型肝炎病毒 DNA 及其变异邹能利臧玉翠, 毛红菊 * 赵国强金庆辉赵建龙 ( 中科院上海微系统与信息技术研究所传感技术联合国家重点实验室, 上海 00050) ( 郑州大学基础医学院微生物与免疫教研室, 郑州 45000) 摘要构建了新型纳米金比色芯片, 利用 Taq DNA 连接酶的连接特异性, 将其与乙型肝炎病毒 DNA(HBV- DNA) 靶序列完全互补杂交的捕获探针 ( 固定在芯片上 ) 和纳米金修饰的探针连接成一条链, 从而将纳米金颗粒固定到芯片点阵上, 再通过银染反应放大, 形成裸眼可见的显色信息通过点阵的位置及灰度, 即可判断 HBV-DNA 靶序列的单碱基突变, 并得出相对定量信息本实验对不同浓度的 HBV-DNA 靶序列进行了检测结果显示 : 此技术对单碱基突变有很强的特异性识别能力, 并且具有较高的灵敏度 ( 约 0 pmol/l), 在 0~ 00 pmol/l 浓度范围内表现出较好的线性关系该技术检测时间短 (< h) 操作简单不需要特殊的检测设备, 具有很好的临床应用前景关键词 HBV; 纳米金 ; 基因芯片 ;Taq DNA 连接酶引言我国是乙型肝炎高发区, 流行病学调查表明 [], 我国至少有 8 亿人感染过乙型肝炎, 乙肝表面抗原的携带率曾高达 9.75% 在乙肝的治疗方案中, 通过抗 HBV 药物抑制 HBV 复制是最重要和有效的方法之一, 因此 HBV-DNA 的定量检测和耐药性变异检测在 HBV 病理研究与临床诊断中具有重要意义 [,3] HBV-DNA 检测的传统方法有直接测序 S 基因序列测定 ELISA 基因型分型法和 PCṞ RFLP 基因型分型法等 [3] 近年来, 基因芯片技术开始应用于疾病的诊断, 它具有灵敏度高结果准确和操作迅速简便等优势但由于采用示踪探针标记技术 ( 酶放射性同位素荧光化学发光等 ) 比较昂贵, 而且都有较高的仪器设备要求, 限制了基因芯片在临床检测中的应用 [4,5] 以纳米金进行示踪标记, 结合纳米金 - 银染增强技术, 在基因芯片上可实现目标 DNA 的检测 [6,7] 李 [8] 玮等基于纳米金探针开发了可视化乙肝病毒基因芯片但是, 这些方法只能检测 DNA 的浓度, 而且对于杂交和清洗条件都有较高要求本研究引入 Taq DNA 连接酶作为单碱基突变的识别工具, 只需一步杂交和连接反应, 将纳米金颗粒捕获固定在芯片点阵上, 再经过银染放大显色即可判定结果, 不仅可以检测 HBV-DNA 的浓度, 而且可以识别 HBV-DNA 的单碱基突变本方法操作简单, 不需要特殊的检测设备, 而且通过修改探针的设计即可用于其它 DNA 的检测, 具有很好的应用前景实验部分. 仪器与试剂 Prosys550A 芯片点样仪 ( 美国 Cartesian Technology 公司 );V-670 紫外 - 可见分光光度计 ( 美国 Jasco 公司 );BX5 显微镜和 Qimage Retiga 000R 数码相机 ( 日本 Olympus 公司 );JEM-00 透射电子显微镜 (TEM, 日本电子公司 );Centrifuge 5804R 高速离心机 ( 德国 Eppendorf 公司 );DY-50 电泳仪 ( 上海万达科技品格服务部 );Gel Doc TM XR+ 凝胶成像仪 ( 美国 Bio-Rad 公司 ) 纳米金溶液基因芯片由本实验室自行制备 ; 氯金酸 (Acros Organics 公司 );0. mol/l 磷酸盐缓冲液 (PBS,pH 7.);.0 mol/l NaCl;0. SSC 洗液 ( 含 0.% SDS); 银染液 ( 将 % 明胶溶液 5.7% 氢醌溶液 5.5% 柠檬酸 -3.5% 柠檬酸三钠的混合液 0% AgNO 3 溶液顺序以 0:60:0:3 的比例迅速混匀, 配好即收稿 ; 接受本文系上海市科委纳米专项 (Nos.095nm05700, 05nm06000) 资助项目 * hjmao@ mail.sim.ac.cn

2 分析化学用 );NaNO 3 洗液 ; 目标 DNA 和探针由上海生物工程技术有限公司合成 ( 表 ) DNA 连接酶 (Taq DNA Ligase) 及其反应缓冲液由美国 BioLab 公司提供其它试剂为分析纯, 实验用水为超纯水 ( 美国 Millipore 公司 Milli-Q 系统制备 ) 表待测 HBV-DNA 序列及核酸探针 Table Sequence of target DNA and DNA probes 序列名称 Name HBV-DNA 靶序列 Tatget DNA of hepatitis B virus (HBV)-DNA 检测探针 ( 用于制备纳米金探针 ) Oligonucleotide probe for AuNPs labelling(detection probe) 捕获探针 ( 互补探针 )Capture probe (For wildtype) 捕获探针 ( 突变探针 )Capture probe (For mutant ) 序列 Sequence 5 -ATACCACATCATCCATATAACTGAAAGCCA-3 5 -PO 4-TGGATGATGTGGTATTTTTTTTTTṮ (CH )3-SH-3 5 -NH -TTTTTTTTTTTTTTTTTGGCTTTCAGTTATA-3 5 -NH -TTTTTTTTTTTTTTTTTGGCTTTCAGTTATG-3. 实验方法.. 芯片的制备将氨基化捕获探针用点样液稀释至浓度为 75 mmol/l, 点直径 00 mm, 点间距 500 mm, 点样量为 0.7 nl, 通过芯片点样仪修饰到表面醛基化的芯片上, 每种探针点成一行 4 点基因芯片被置于 5 固定 48 h 采用硼氢化钠溶液处理芯片, 干燥后备用.. 纳米金颗粒的制备参照文献 [9] 制备, 将 98.5 mg 氯金酸和 85 mg 柠檬酸三钠分别溶于 50 和 5 ml 的灭菌超纯水中 ; 再将氯金酸溶液倒入三口瓶中, 置于油浴槽中, 并将温度调至 50, 搅拌使温度均匀, 直到反应结束 ; 在冷凝管回流开始滴第一滴水后 0 min, 迅速从侧口加入柠檬酸三钠溶液, 加热 5 min 后, 保持在油浴槽中冷却至室温反应结束后用 0. mm 硝酸纤维尼龙膜过滤, 得到纳米金颗粒原液, 保存于 4 冰箱中备用..3 纳米金探针的制备按照文献 [0] 所述方法以纳米金标记检测探针, 取 ml 纳米金原液, 在 4 以 9000 r/min 离心 50 min, 弃上清液 ; 再加入 97 ml 去离子水和 3 ml 巯基标记的检测探针序列 (00 m mol/l), 混匀, 在 4 冰箱中静置 h; 每隔 h 分 3 次各 3 ml 加入 0. mol/l PBS- mol/l NaCl, 混匀, 在 4 冰箱中静置 48 h; 再加入 88 m L 0 mmol/l PBS-0. mol/l NaCl 混合液, 混匀, 在 4 以 9000 r/min 离心 50 min, 弃上清液, 重复两次 ; 加入 00 ml 0 mmol/l PBS-0. mol/l NaCl 混合液重悬, 在 4 冰箱中储存备用..4 HBV-DNA 检测各取 ml 的纳米金探针,HBV-DNA 靶序列 ( 分别为和 pmol/l), Taq DNA 连接酶及其缓冲液 (0 ), 再加无菌水至 0 ml, 混匀滴到芯片上, 在 45 杂交连接 30 min; 反应完后, 以 0. SSC 洗液清洗玻片, 再用 NaNO 3 洗液漂洗, 氮气吹干滴加 0 ml 新配制银染试剂于芯片上, 在 37 反应 5 min, 用去离子水室温清洗芯片, 吹干后观察结果 3 结果与讨论 3. 实验原理本研究旨在构建一种快速及高灵敏比色芯片, 用于检测 HBV-DNA 及单碱基突变探针设计如表根据检测的 HBV-DNA 序列, 以单碱基突变位点为分界点, 标记在纳米金颗粒上的纳米金探针与其 5 端互补 ; 氨基修饰的捕获探针固定于芯片上, 与其 3 端互补, 检测原理如图所示 HBV-DNA 靶序列与纳米金探针和捕捉探针均完全互补杂交之后,Taq DNA 连接酶可以将捕获探针与纳米金探针连接成一条链, 从而将纳米金颗粒固定到芯片点阵上, 银染后可以观察到清晰的点阵 ( 图 a) 而单碱基突变的 HBV-DNA 靶序列与捕获探针和纳米金探针杂交时, 捕获探针和纳米金探针之间存在缺口,Taq DNA 连接酶不能发挥连接作用, 所以杂交的纳米金探针很容易被洗掉, 银染后没有点阵或点阵不清晰 ( 图 b) 3. 纳米金探针制备及分析采用透射电子显微镜 ( 操作电压为 0 V) 观察按.. 和..3 节所述实验步骤制得的纳米金原液和纳米金探针, 结果如图所示, 所制备的纳米金颗粒直径约 (3±5)nm 由于 ssdna 带负电, 通过电荷的相互排斥增强了纳米金探针的稳定性, 因此纳米金探针的分散性显著好于纳米金原液纳米金与 ssdna 结合导致纳米金颗粒的直径增大, 因此纳米金溶液的紫外 - 可见吸收光谱的最大

第期邹能利等 : 高灵敏纳米金比色芯片检测乙型肝炎病毒 DNA 及其变异图 Fig. HBV 核酸检测示意图 Schematic diagram of HBV DNA detection [] 吸收峰向长波段红移如图 3a 所示, 纳米金原液最大吸收峰在 50 nm 处, 而纳米金探针最大吸收峰在 56 nm 处, 较原液红移了约 6.

.4 节所述方法, 分别对浓度为 00, 50, 5, 0 和 pmol/l 的 HBV-DNA 核酸样品进行检测结果如图 4a 所示, 显示的点阵清晰, 且随着靶 DNA 分子浓度降低, 点阵信图纳米金原液 (a) 和纳米金探针 (b) 的 TEM 图像 Fig.

3 第期邹能利等 : 高灵敏纳米金比色芯片检测乙型肝炎病毒 DNA 及其变异图 Fig. HBV 核酸检测示意图 Schematic diagram of HBV DNA detection [] 吸收峰向长波段红移如图 3a 所示, 纳米金原液最大吸收峰在 50 nm 处, 而纳米金探针最大吸收峰在 56 nm 处, 较原液红移了约 6.0 nm 而且通过琼脂糖电泳可知 ( 图 3b), 纳米金原液聚集在点样孔并且在电泳液中盐离子作用下发生聚集而变黑 ; 纳米金探针有明显条带, 但由于纳米金颗粒的牵制导致其电泳速率比纯核苷酸序列更慢, 而且由于纳米金颗粒大小及其表面吸附的 ssdna 个数并不完全一样因此, 电泳时有拖尾现象综上所述,ssDNA 探针已成功标记在纳米金颗粒上 3.3 HBV-DNA 检测结果分析根据..4 节所述方法, 分别对浓度为 00, 50, 5, 0 和 pmol/l 的 HBV-DNA 核酸样品进行检测结果如图 4a 所示, 显示的点阵清晰, 且随着靶 DNA 分子浓度降低, 点阵信图纳米金原液 (a) 和纳米金探针 (b) 的 TEM 图像 Fig. TEM image of AuNPs (a) and ssdna- AuNPs(b) 图 3 纳米金原液 () 及纳米金探针 () 的紫外 - 可见吸收谱图 (a) 及电泳图 (b) Fig.3 UV-vis absorption spectra(a)and agarose electrophoretogram(b)of AuNPs()and ssdna- AuNPs() 号强度呈现出递减的趋势根据图 4a 作 HBV-DNA 靶核酸浓度与点阵信号强度的对比图 4b, 由于显微镜在每次照相时都要调整焦距光圈等参数, 导致每张图像的背景光强不一样因此, 以标准化灰度值 ΔG( 即点阵灰度与周围灰度的差值 ΔGradation) 作为信号强度的度量由图 4b 可见, 信号强度与完全互补的 HBV-DNA 靶核酸的浓度在 0~ 00 pmol/l 范围内有着较好的线性关系 (ΔG= C, r=0.95); 检出限约为 0 pmol/l 对于单碱基突变 HBV-DNA, 信号强度与其浓度的线性关系方程为 ΔG= C,r=0.99

HBV-DNA 靶核酸检测结果 - 显微镜照片 (a) 和灰度值 (b) Fig.4 Detection Results of target DNA-microscope image(a)and gradation(b). 单碱基突变序列 ;. 完全互补序列. Single-base mutant sequence;. Completely complementary sequence.

4 分析化学 3.4 方法的特异性在图 4a 芯片点阵上, 两排点阵固定的捕获探针在末端有一个碱基的差异, 第排的捕获探针与 HBV-DNA 靶核酸有一个单碱基错配, 而第排的捕获探针与 HBV-DNA 靶核酸则是完全互补的加入 HBV-DNA 靶核酸进行检测时, 第排 ( 互补 ) 的点阵信号强度远大于第排 ( 突变 ) 的信号表明本方法对 HBV-DNA 的单碱基突变识别具有较高的特异性图 4 HBV-DNA 靶核酸检测结果 - 显微镜照片 (a) 和灰度值 (b) Fig.4 Detection Results of target DNA-microscope image(a)and gradation(b). 单碱基突变序列 ;. 完全互补序列. Single-base mutant sequence;. Completely complementary sequence. 近年来, 将 DNA 结合到纳米金颗粒上, 通过与靶 DNA 之间的互补实现纳米颗粒的组装检测 DNA, [] 已成为一种新型的 DNA 检测系统本实验采用纳米金比色芯片检测 HBV-DNA 及其单碱基突变, 利用 HBV-DNA 浓度与点阵信号灰度进行对比结果显示, 点阵信号强度与 HBV-DNA 的浓度在 0~00 pmol/l 的范围内有着较好的线性关系, 检出限可达 0 pmol/l 同时, 通过捕获探针末端的单碱基差异, 利用 Taq DNA 连接酶的连接特异性, 对比两排点阵信号强度判断 HBV-DNA 是否产生了单碱基突变, 具有很好的区分度, 准确性高与传统的基因芯片相比, 本方法灵敏度高, 操作简单, 其技术和设备要求检测成本显著降低, 具有很好的临床应用前景 References MinistryofHealthP.R China,ThecontrolstrategyandworkprogressofhepatitisBpreventioninChina.htp:// 中华人民共和国卫生部, 中国乙肝防控策略和工作进展.htp:// mohbgt/s358/0004/469.htm,00 LEIJun,TANG Hong.ChineseHepatology,009,4(4):34~345 雷君, 唐红. 肝脏,009,4(4):34~345 3 YANG YaṉJie,CHENGJun,CHENDong-Feng,WU Yu,HUANGYaṉPing,ZHONGYaṉ Wei,WANGChuṉ Hua,LIU Min.WorldChin.J.Digestol.,004,(7):670~673 杨艳杰, 成军, 陈东风, 吴煜, 黄燕萍, 钟彦伟, 王春花, 刘敏. 世界华人消化杂志,004,(7):670~673 4 KurianK M,WatsonCJ,WylieA H.TheJournalofPathology,999,87(3):67~7 5 HelerMJ.Annu.Rev.Biomed.Eng.,00,4():9~53 6 TatonT A,MirkinC A,LetsingerRL.Science,000,89(5485):757~760 7 NieL,TangJ,GuoH,ChenH,XiaoP,HeN.Anal.Sci.,004,0(3):46~463 8 LEIWei,PANGDai-Wen,WANG Ye-Fu,YAN Qin,ZHANGZhi-Ling.Chem.J.Chin.Univ.,003,4(): 86~88 李玮, 庞代文, 王业富, 阎琴, 张志凌. 高等学校化学学报,003,4():86~88 9 FrensG.NPhS,973,4 (05):0~ 0 MirkinC A,LotsingerRL,MucicRC,StorhofJJ.Nature,996,38(659):607~609 YanJ,EstévezC,SmithJE,WangK,HeX,WangL,Tan W.NanoToday,007,(3):44~50

5 第期邹能利等 : 高灵敏纳米金比色芯片检测乙型肝炎病毒 DNA 及其变异 WangZ,MaL.Coord.Chem.Rev.,009,53(-):607~68 AVisualDNA MicroarrayforHigh-SensitivityDetectionof HepatitisBVirusDNAandSingleNucleotidePolymorphisms ZOU Neng-Li,ZANG Yu-Cui,,MAO Hong-Ju *,ZHAO Guo-Qiang,JIN Qing-Hui,ZHAOJiaṉLong (StateKeyLabofTransducerTechnology,ShanghaiInstituteof MicrosystemandInformationTechnology, ChineseAcademyofSciences,Shanghai00050) (BasicMedicalColegeofZhengzhouUniversity,Zhengzhou45000) Abstract HepatitisBisa majordisease whichcausesseriouspublichealthproblems worldwide. Herein,avisualDNA microarraywasdevelopedforsensitiveandspecificdetectionofhepatitisbvirus DNA (HBV-DNA)andsinglenucleotidepolymorphisms.5 endamino-modified oligonucleotide, which wasimmobilized on microarraysurfaceacted ascapture probe,and anotherpartofgold nanoparticleḻabeledoligonucleotideweredesignedtobindspecificalytocomplementarytargetshbv- DNAt,andthenlinkedasasingle-strandDNAviaTaqDNAligase.Theblackimageofmicroarray spots,resultingfromsilverstainongoldnanoparticles,wasusedtodetectvisualytargethbv-dna andsinglenucleotidepolymorphisms.captureprobewithsinglebasemismatchwaspreparedtodetect specificityandsensitivityofhybridizationonmicroarray.targethbv-dna withdiferentconcentrationhadbeentested,theresultindicatedthatthismethodhadgoodspecificityinthediscriminationof singlenucleotidepolymorphismsandshowedhighsensitivity (about0pmol/l).thereisalsoa linearrelationshipbetweenthesignalintensityof microarrayspotsandtheconcentrationoftarget DNAattheconcentrationrangeof0-00pmol/L.Foritshighsensitivityandgoodspecificity,this visualdetectingtechniquehaspotentialapplicationsinclinicalfields. Keywords HepatitisBvirus;Golḏnanoparticles;Deoxyribonucleicacidchip;Taqdeoxyribonucleic acidligase (Received6June0;accepted3September0)

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Vol. 33 高等学校化学学报 No. 7 2012 年 7 月摇摇摇摇摇摇 CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES 摇摇摇摇摇摇 1420 ~ 1425 基于双纳米金探针杂交法检测 HBV DNA 邢亚斯 1,2, 邹能利 1, 毛红菊 1, 徐摇霞 2, 葛玉卿 1, 金庆辉 1 1, 赵建龙 (1. 中国科学院上海微系统与信息技术研究所传感技术联合国家重点实验室,