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凌板崧隗
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1 011 年第 69 卷化学学报 Vol. 69, 011 第期, 199~0 ACTA CHIMICA SINICA No., 199~0 研究论文纳米粒子标记激光诱导荧光免疫分析测定癌胚抗原张晓明章竹君 * 薛盼 ( 陕西师范大学化学与材料科学学院陕西省生命分析重点实验室西安 71006) 摘要建立了一种核壳型 SiO 荧光纳米粒子标记的激光诱导荧光免疫测定的新方法. 该方法用 Ru(bpy) + 掺杂的核壳型 SiO 荧光纳米粒子为标记物, 采用双抗体夹心法, 在载玻片上固定鼠抗人癌胚抗原 (CEA) 单克隆抗体, 加入 1~ µl 样品, 再加入纳米粒子标记的另一种鼠抗人癌胚抗原 (CEA) 单克隆抗体. 识别后在光导纤维激光诱导荧光毫米阵列检测平台上测量荧光信号, 进行定量. 在优化条件下, 荧光强度和癌胚抗原的量在 1~80 pg 的范围内具有良好的线性关系, 相关系数 r=0.99, 方法的检出限为 0. pg (0 amol). 对 40 pg 的 CEA 平行测定 5 次, 相对标准偏差为 5.5%. 关键词纳米粒子 ; 激光诱导荧光 ; 阵列传感器 ; 癌胚抗原 Immunoassay for Carcinoembryonic Antigen Based on Fluorescence Induced by Laser and Labeled with Nanoparticles Zhang, Xiaoming Zhang, Zhujun* Xue, Pan (School of Chemistry and Materials Science, Shaanxi Normal University, Key Laboratory of Life Analysis of Shaanxi Province, Xi'an 71006) Abstract A new immunoassay method for Carcinoembryonic Antigen based on fluorescence induced by laser and labeled with nanoparticles is presented. Core-shell SiO fluorescent nanoparticles were used as labels, sandwich model was used. Mouse anti-carcinoembryonic antigen (CEA) monoclonal antibody was immobilized on slides, then 1~ µl CEA was added, and the other mouse anti-cea monoclonal antibody labeled with nanoparticles was added, after CEA and antibody recognized, the fluorescent signal was quantified with an laser-induced fluorescence millimeter array detection platform based on optical fiber. The fluorescence intensity has a linear relationship with the concentration of CEA in the range of 1~80 pg, with the absolute limit detection of CEA being 0. pg. The relative standard deviation (RSD) for 5 parallel measurements of CEA (40 pg) was 5.5%. Keywords nanoparticles; laser induced fluorescence; sensor array; carcinoembryonic antigen 癌胚抗原 (Carcinoembryonic Antigen, CEA) 是一种细胞粘附分子, 执行癌细胞间及癌细胞与基质胶原之间的粘附反应, 在肿瘤生长和转移中起着十分重要的作用. 对血清中或者细胞上 CEA 进行定量检测, 在恶性肿瘤的诊断评估病变范围预测治疗疗效监测复发等方面发挥着重要的作用. 目前 CEA 常用的检测方法有酶联免疫分析法 [1] [], 荧光免疫分析法及化学发光免疫 [] 分析法等. 核壳型荧光纳米粒子是一种新型的荧光标记物. 由于单个纳米粒子中包裹有更多的荧光染料分子, 可以显著地提高荧光分析的灵敏度并改善光稳定性. 将核壳型荧光纳米粒子用做生物标记物, 可进行癌细胞识别荧光成像 [4], 细菌检测 [5] [6], DNA 检测等. 我们也曾将其用于免疫分析, 建立了检测白介素 -6(IL-6) [7] 等的荧光免疫分析方法. 激光诱导荧光比通常的荧光检测技术有更高的灵敏度 [8], 在基因芯片和蛋白质芯片研究中, 已用激光共聚焦扫描显微镜对微阵列进行扫描, 用 * zxm-05@16.com Received June 1, 010; revised August 1, 010; accepted September 0, 010.

2 00 化学学报 Vol. 69, 011 ICCD 检测器成像, 但设备昂贵, 只适于实验室研究. 龙 [9] 峰等曾在光纤头上固定鼠 IgG, 利用激光束在光纤头表面的消失波测定了用 Cy5.5 标记的羊抗鼠 IgG, 方法灵敏度不高, 而且是一次性使用的. 常规的荧光免疫分析大多在 96 孔板上完成, 由于激光斑点的面积很小, 96 孔板反应器又存在边缘效应, 不可能在常规免疫分析中实现激光诱导荧光检测, 又由于 96 孔板反应器需要样品量较大 ( 通常为 100 µl), 也不适宜用于细胞免疫和细胞表面粘附分子的测定. 本文构建了一种新型的光导纤维激光诱导荧光毫米阵列检测平台, 用 Ru(bpy) + 掺杂的 SiO 纳米粒子标记癌胚抗原单克隆抗体, 用双抗体夹心法, 在毫米荧光免疫阵列上, 实现了 1~ µl 样本的激光诱导荧光免疫分析, 对细胞粘附分子 CEA 的测定, 检出限为 0. pg (0 amol). 在相同实验条件下, 同氙灯作为光源的荧光免疫法进行了比较, 灵敏度提高约 500 倍. 1 实验部分 1.1 仪器与试剂示. 光导纤维激光诱导荧光毫米阵列检测平台如图 1 所水 (5%~8% w/w, 国药集团化学试剂有限公司 ); Triton X-100 (Sigma 公司 ); 50% 戊二醛 (Sigma 公司 ); 鼠抗人癌胚抗原单克隆抗体 ( 洛阳市佰泰科生物技术有限公司 ); 癌胚抗原定量检测试剂盒 ( 郑州博赛生物技术有限公司 ), 牛血清白蛋白 (BSA, 国药集团化学试剂有限公司 ). 实验中所用的试剂均为分析纯, 所用的水为二次蒸馏水. 1. 核壳型二氧化硅荧光纳米粒子的合成核壳型二氧化硅荧光纳米粒子参照文献的方法稍有改动合成 [10]. 室温下, 50 ml 的锥形瓶中依次加入 1.77 ml Triton X-100, 1.8 ml 的正己醇, 7.5 ml 的环己烷, 搅拌 0 min 后加入 0.48 ml 0.0 mol/l 的 Ru(bpy) + 的溶液, 继续搅拌 1 h; 加入 100 µl 的 TEOS, 搅拌 0 min, 加入 60 µl 的氨水, 搅拌反应 1 h; 接着加入 100 µl 的 APS 和 60 µl 的氨水, 继续搅拌反应 1 h. 反应结束后, 加入 5 ml 丙酮破乳, 于 8000 r/min 离心 10 min; 用乙醇水超声洗涤, 除去纳米粒子表面吸附的 Ru(bpy) +, 再于 r/min 离心 10 min 分离, 将所得的纳米粒子室温下自然干燥. 核壳型二氧化硅荧光纳米粒子的透射电镜如图, 从图中可以看出, 采用本方法合成的纳米粒子粒径在 (0±5) nm, 且大小均匀. 荧光测量的结果表明, 核壳型二氧化硅荧光纳米粒子与自由 + Ru(bpy) 的最大激发和发射波长基本没有变化, 但其光稳定性要明显优于自由 Ru(bpy) +, 且染料的泄漏率也很低. Ru(bpy) + 掺杂的 SiO 纳米粒子中 Ru(bpy) + 的相对含量为 1%. 图 1 光导纤维激光诱导荧光毫米阵列检测平台示意图 Figure 1 Laser induced fluorescence measurement device (A) 激光光源 ; (B) 暗室 ; (C) 光电倍增管 ; (D) 截止滤光片 ; (E) 石英光纤 ; (F) 玻璃光纤 ; (G) 载玻片 ; (H) 计算机 ; (M) 斑点放大图半导体激光光源 A 发出的激光 (405 nm, 1 mw) 通过石英光纤 E 照射到毫米阵列的斑点上, 产生的荧光用玻璃光纤 F( 直径 mm) 收集, 用截止滤光片 D (450 nm) 过滤掉反射光, 用光电倍增管检测. ACQ-600 超声发生器 ( 西安翔达超声技术工程部 ); HC-018R 高速冷冻离心机 ( 安徽科大创新股份有限公司中佳分公司 ); JEM-100 透射电子显微镜 ( 日本电子公司 ); SHH W1 40 型三用电热恒温水箱 ( 余姚市东方电工仪器厂 ). 联吡啶钌 (Ru(bpy) Cl, Alfa-aesar 公司 ); γ- 氨丙基 -- 乙氧基硅烷 (APS, 济南多维桥化工有限公司 ); 正硅酸乙酯 (TEOS, 西安化学试剂厂 ); 环己烷 ( 天津市富宇精细化工有限公司 ); 正己醇 ( 成都市科龙化工试剂厂 ); 氨图核壳型二氧化硅荧光纳米粒子的透射电镜图 Figure TEM of core-shell fluorescent nanoparticles 1. 鼠抗人癌胚抗原单克隆抗体的标记将 mg 纳米粒子分散在 ml 含 5% 戊二醛的 PBS 中, 室温下搅拌 h. 反应结束后, 离心, 用 PBS 洗涤次. 将所得的戊二醛交联的纳米粒子分散在含有鼠抗人癌胚抗原的 PBS 中, 4 振动孵育 1 h. 最后将所得产物用 PBS 清洗几次后, 重新分散在 PBS 中, 4 保存备用.

3 No. 张晓明等 : 纳米粒子标记激光诱导荧光免疫分析测定癌胚抗原载玻片的处理新购的载玻片用铬酸洗液浸泡 1 h, 用水冲洗干净后, 在 10 mol/l 氢氧化钠溶液浸泡 1 h, 用水冲洗 0 s, 再用水超声洗涤 15 min, 氮气吹干. 将洗干净的载玻片在丙酮中浸泡 min, 氮气吹干, 在含 % APS 的丙酮溶液中浸泡 min, 用水冲洗干净, 110 烘 0 min, 取出冷却后, 将其浸到.5% 戊二醛的水溶液中, 7 反应 1 h, 用水冲洗干净, 氮气吹干. 1.5 免疫反应抗原和抗体的反应采用常规的双抗体夹心法. 在醛基化的载玻片上预先设定好反应区域, 将 1~ µl 的鼠抗人癌胚抗原抗体加到反应区域中, 4 包被过夜. 室温下在每个反应区域中加入 1% 的 BSA, 反应 1 h, 封闭没有与抗体结合的戊二醛, 用 PBS 洗涤次, 然后加入 1~ µl 的 CEA, 7 湿盒中孵育 0 min, 用 PBS 洗涤次, 然后加入 µl 纳米粒子标记的另一种 CEA 抗体, 7 湿盒中孵育 0 min, 用 PBS 彻底洗涤除去没有与抗原结合的标记抗体. 在光导纤维激光诱导荧光毫米阵列检测平台上测量载玻片上各个斑点的荧光, 根据荧光强度进行定量. 结果与讨论.1 自组装激光诱导荧光仪的检测灵敏度分别用激光 (405 nm) 和氙灯 (405 nm, 岛津 RF-540, 150 W, 狭缝宽 0 nm) 作为光源, 在同一个检测平台上, 对不同量 Ru(bpy) + 掺杂的 SiO 纳米粒子的荧光进行测定 ( 图 ), 结果表明, 采用激光作为光源时, Ru(bpy) + 掺杂的 SiO 纳米粒子中 Ru(bpy) + 的检测下限为 0.1 ng; 采用氙灯作为光源时, Ru(bpy) + 掺杂的 SiO 纳米粒子中 Ru(bpy) + 的检测下限为 50 ng, 当采用激光作为光源时测量荧光强度的灵敏度是采用氙灯做光源时的 500 倍以上.. 纳米粒子表面抗体浓度的选择为了研究核壳型荧光纳米粒子表面的抗体密度对测定时荧光强度的影响, 将纳米粒子与不同量的抗体结合, 然后进行免疫反应, 测定荧光信号的强弱 ( 图 4). 实验结果表明, 当鼠抗人抗体用量为 10 µg 时, 荧光信号仅为与 100 µg 抗体结合时的 41%( 癌胚抗原的浓度为 40 ng/ml). 当抗体浓度从 10~100 µg 变化时, 响应值随之增加. 然而, 当抗体浓度变为 00 µg 时, 在抗原浓度为 80 ng/ml 时, 可能由于纳米粒子表面抗体密度达到饱和, 荧光强度反而与抗体浓度为 100 µg 时相当. 因此, 抗体密度的最佳浓度为每毫克核壳型二氧化硅荧光纳米粒子表面标记 100 µg 抗体. 图激光和氙灯光源激发的 Ru(bpy) + 掺杂的 SiO 纳米粒子荧光强度图 Figure Fluorescence intensity of nanoparticles induced by laser lamp and Xenon lamp (A), (B), (C), (D) 和 (E) 分别为不同量 Ru(bpy) + 掺杂的 SiO 纳米粒子激光诱导产生的荧光信号 ; (H) 和 (M) 分别为用激光光源和用氙灯光源激发时斑点中 Ru(bpy) + 量与荧光强度的关系, 曲线 (H) 对应左边坐标, 曲线 (M) 对应右边坐标图 4 纳米粒子表面抗体密度 Figure 4 Density of antibody on the surface of nanoparticles (A) 10 µg/mg ; (B) 50 µg/mg; (C) 100 µg/mg; (D) 00 µg/mg

4 0 化学学报 Vol. 69, 011. 抗体纳米粒子复合物浓度的选择纳米粒子抗体复合物的浓度对荧光强度有显著的影响, 实验考察了纳米粒子抗体复合物浓度从 0~100 µg/ml 增加时荧光强度的变化. 从图 5 中可以看出, 当纳米粒子抗体复合物的浓度增大到 40 µg/ml 后, 由于特异性吸附接近饱和, 随着纳米粒子抗体复合物浓度的增加荧光强度的增加缓慢, 因此选择纳米粒子抗体复合物的浓度为 40 µg/ml..4 标准曲线, 精密度, 检出限在实验选定的较优化的条件下, 荧光强度与癌胚抗原的量在 1~80 pg 的范围内具有良好的线性关系, 线性回归方程为 I=.607c , I 为荧光强度, c 为 CEA 的量 (pg), 相关系数 r=0.99, 对 40 pg 的 CEA 平行测定 5 次, 相对标准偏差为 5.5%. 根据 IUPAC 建议, 方法的检出限 (σ) 为 0. pg (0 amol)..5 样品分析及结果比较对经典酶联免疫法和本文所建立的激光诱导荧光免疫法进行了对比, 结果如表 1. 分别用两种方法对三份血清样品进行了测定, 结果如表. 结论图 5 纳米粒子抗体复合物的浓度 Figure 5 Concentration of antibody-nanoparticles conjugates 用 Ru(bpy) + 掺杂的 SiO 纳米粒子作为标记物, 结合激光诱导荧光技术, 建立了一种光导纤维激光诱导荧光毫米阵列检测平台, 实现了 1~ µl 样本的激光诱导荧光免疫分析. 以癌胚抗原双抗体夹心免疫分析为模型, 实验表明, 测定灵敏度较 ELISA 法和传统的荧光免疫法有很大提高. 回归方程表 1 酶联免疫法和激光诱导荧光免疫法的对比 Table 1 Comparison of ELISA and laser induced fluorescence immunoassay Colorimetric ELISA Laser induced Fluorescence immunoassay I=0.700[CEA]-.841 (n=, R=0.998) I=.607[CEA] (n=4, R=0.99) 线性范围 0.5~1 ng 1~80 pg RSD/% 4.8% (n=5) 5.5% (n=5) 检出限 0.07 ng 0. pg 表血清中 CEA 的测定结果 Table Results from analysis of CEA in human serum samples Sample Colorimetric ELISA/(ng ml -1 ) Laser induced Fluorescence immunoassay/(ng ml -1 ) Difference/% References 1 Zhang, S.; Yang, J.; Lin, J. Bioelectrochemistry 008, 7(1), 47. Fidarova, E. F.; El-Emir, E.; Boxer, G. M.; Qureshi, U.; Dearling, J. L. J.; Robson, M. P.; Begent, R. H. J.; Trott, K. R.; Pedley, R. B. Clin. Cancer Res. 008, 14(9), 69. Sun, Z.; Fu, X.; Zhang, L.; Yang, X.; Liu, F.; Hu, G. Anticancer Res. 004, 4(C), Santra, S.; Zhang, P.; Wang, K. M.; Tapec, R.; Tan, W. H. Anal. Chem. 001, 7, Zhao, X. J.; Hilliard, L. R.; Mechery, S. J.; Wang, Y.; Bagwe, R. P.; Jin, S.; Tan, W. H. P. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 004, 101, Zhao, X. J.; Tapec-Dytioco, R.; Tan, W. H. J. Am. Chem. Soc. 00, 15,

5 No. 张晓明等 : 纳米粒子标记激光诱导荧光免疫分析测定癌胚抗原 0 7 Hun, X.; Zhang, Z. J. Biosens. Bioelectron. 007,, Pfab, J. Anal. Proc. 1991, 8(1), Long, F.; Shi, H. C.; H, M.; Zhu, A. N.; Feng, L. X. Chin. J. Anal. Chem. 007, 5, 919 (in Chinese). ( 龙峰, 施汉昌, 何苗, 朱安娜, 冯丽霞, 分析化学, 007, 5, 919.) 10 Joshua, E. S.; Colin, D. M.; Tang, Z.; Shangguan, D.; Lofton, C.; Tan, W. Anal. Chem. 007, 79(8), 075. (A10061 Cheng, F.; Qin, X.)

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.