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养寺充
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中国科学: 生命科学 SCIENTIA SINICA Vitae 评述中国科学院学部 2013 年第 43 卷 www.scichina.

com 中国科学杂志社 SCIENCE CHINA PRESS 大发现时代的生命组学专刊选择反应监测技术在蛋白质组学研究中的应用张剑, 姜颖, 孙薇* 军事医学科学院放射与辐射医学研究所, 北京蛋白质组研究中心, 蛋白质组学国家重点实验室, 北京 102206 * 联系人, E-mail: sunway21cn@126.

本文对 SRM 技术的特点发展过程在蛋白质组学中的应用现状以及发展前景进行了概述. 蛋白质组学是在大规模水平上研究蛋白质特性的学科, 包括对蛋白质表达水平蛋白质翻译后修饰蛋白质与蛋白质相互作用等的研究, 进而在蛋白质水平上对细胞代谢等生理过程以及疾病的发生发展等病理过程进行整体解析.

1 中国科学: 生命科学 SCIENTIA SINICA Vitae 评述中国科学院学部 2013 年第 43 卷科学与技术前沿论坛第 1 期: 63 ~ 71 life.scichina.com 中国科学杂志社 SCIENCE CHINA PRESS 大发现时代的生命组学专刊选择反应监测技术在蛋白质组学研究中的应用张剑, 姜颖, 孙薇* 军事医学科学院放射与辐射医学研究所, 北京蛋白质组研究中心, 蛋白质组学国家重点实验室, 北京 * 联系人, sunway21cn@126.com 收稿日期: ; 接受日期: doi: / 摘要基于三重四极杆质谱仪的选择反应监测(SRM)技术是一种根据已有信息或理论信息靶向进行质谱信号采集的技术, 具有高选择性高重复性高灵敏度宽动态范围等特点, 已被广泛应用于蛋白质组学研究, 用于生物样本中蛋白质的绝对定量分析. 本文对 SRM 技术的特点发展过程在蛋白质组学中的应用现状以及发展前景进行了概述. 蛋白质组学是在大规模水平上研究蛋白质特性的学科, 包括对蛋白质表达水平蛋白质翻译后修饰蛋白质与蛋白质相互作用等的研究, 进而在蛋白质水平上对细胞代谢等生理过程以及疾病的发生发展等病理过程进行整体解析. 基于质谱的蛋白质组学方法早期研究主要集中在对蛋白质鉴定的定性分析中, 如肽质量指纹图谱法, 可快速灵敏高通量地在简单样本中鉴定蛋白质; 又如肽序列标签法, 可鉴定混合物中的蛋白质. 近年来随着相关技术的发展, 蛋白质组学的研究已越来越关注蛋白质丰度变化. 基于质谱的定量蛋白质组学研究, 主要有二维凝胶电泳结合质谱稳定同位素标记质谱非标记等定量分析方法. 二维凝胶电泳结合质谱的方法是蛋白质组学研究中的经典方法, 经二维凝胶电泳分离的蛋白质通过分析其斑点强度确定相对丰度, 但此方法蛋白质检测的灵敏度低, 而且不适合分析疏水性较强的蛋白质和分子量过大或过小的蛋白质. 稳定同位素标记定量分析法, 如 SILAC(stable isotope labeling with amino acids in cell culture)可同时分析成关键词选择反应监测蛋白质组学绝对定量质谱对样品, 且样本处理相对简单, 但特殊的同位素培养基或饲料成本很高. 同位素亲和标签(isotope coded affinity tags, ICAT)技术或 itraq(isobaric tags for relative and absolute quantitation)技术也存在缺陷, ICAT 需要蛋白质序列必须含有半胱氨酸, itraq 虽可标记所有肽段, 但样品复杂性高, 并且在肽段水平标记, 实验误差较大. 上述方法只能给出蛋白质在不同样本间量的比值(相对定量), 不能给出绝对定量信息. 因此, 蛋白质组学研究迫切需要高通量高灵敏度重复性好的绝对定量方法. 此时质谱选择反应监测(selected reaction monitoring, SRM)技术由于其自身具有通量高选择性高灵敏度高动态范围宽和重复性好等特点, 在蛋白质绝对定量领域中逐渐受到关注. 1 SRM 技术的发展过程 SRM 技术起始于 20 世纪 70 年代末, 最初在质量分析的离子动能(mass-analyzed ion kinetic energe, 引用格式: 张剑, 姜颖, 孙薇. 选择反应监测技术在蛋白质组学研究中的应用. 中国科学: 生命科学, 2013, 43: 63 71, doi: / Zhang J, Jiang Y, Sun W. Application of selected reaction monitoring in proteomics research. SCIENTIA SINICA Vitae, 2013, 43: 63 71, doi: /

2 张剑等 : 选择反应监测技术在蛋白质组学研究中的应用 MIKE) 实验中被用于扇形仪 (sector instruments) [1]. 在 Enk 和 Yost [2] 把 SRM 技术应用于三重四极杆质谱仪后其才成为常规的质谱技术. 在接下来 30 年里作为分析小分子化合物的定量参考, SRM 在临床应用较多. 起初这种工作模式叫做单反应监测 (single reaction monitoring, SRM) 或多反应监测 (multiple reaction monitoring, MRM) 单反应监测指只监测一个母子离子对 (transition), 多反应监测指连续的监测一系列母子离子对. 后来这两个术语都被统一的术语 SRM 取代以避免歧义 [3]. 在蛋白质组学研究中, 鸟枪法曾是主要的策略, 然而因其选择的随机性和较低的灵敏度, 导致了此方法不适合对蛋白质进行系统性的定量, 而 SRM 技术的出现弥补了鸟枪法的不足, 在定量蛋白质组学中的应用越来越广泛. 2 SRM 技术的原理 SRM 技术是一种根据已知实测信息或质谱检测规律的假定信息对样本进行靶向定量的技术, 主要仪器为三重四极杆质谱仪, 其中第一和第三个四极杆作为质量过滤器 ( 图 1), 分别特异性地选择与预先设定质荷比相同的肽段离子 ( 母离子 ) 和碎片离子 ( 子离子 ) 通过, 第二个四极杆作为碰撞池来碎裂母离子, 通常采用碰撞诱导解离方式 (collision-induced dissociation, CID). 两次的质量选择使得 SRM 技术有很高的选择性, 并且降低了背景噪音, 去除了干扰离子, 提高了灵敏度. 在确保数据质量的前提下, 为了使每次运行时执行的检测数最多, 目前常用一种称为预置 MRM TM (scheduled MRM, smrm) 的方法, 这种方法先要知道每个肽段的保留时间, 利用此信息使得每个肽段只在其洗脱时间内进行 SRM 检测, 大 [4] 大提高了检测效率. 在此基础上, Kiyonami 等人对于 SRM 技术提出了新的数据采集方案, 称为智能选择反应监测 (intelligent selected reaction monitoring, isrm), 其通过设定主要 (primary) 和次要 (secondary) 母子离子对, 质谱采集时只采集每个肽段的主要母子离子对, 这样在固定的采集时间内可分析更多的肽段, 当主要母子离子对信号强度达到一定阈值时才触发次要的母子离子对采集, 实现对肽段的定性确认, 进一步提高了 SRM 的选择性和准确性. 3 SRM 技术的特点与优势在蛋白质组学研究中, 与定性分析方法相比, SRM 技术有着高选择性高灵敏度高通量和宽动态范围等特点. 与基于质谱的半定量技术相比, SRM 技术有着可对蛋白质绝对定量的优势. 3.1 高选择性 SRM 技术在第一个四极杆特异性地选择特定母离子通过, 经碰撞池碎裂后第三个四极杆再次选择特定的子离子通过, 这样可排除质荷比不同的干扰母离子和子离子. 两次的质量选择使得 MRM 有较高选择性, 过滤共洗脱背景效果很明显, 对于测定复杂样本中丰度较低的蛋白有很好的效果. 3.2 高灵敏度两次的质量选择过滤同样使 SRM 技术有较高的灵敏度. 经典的基于质谱的蛋白质组学技术在分析复杂生物样本时会有明显的离子抑制效应 [5], 而 SRM 技术为靶向式获取目标离子, 减少了其他离子的干扰, 与经典技术相比灵敏度可提高一个数量级 [6]. [7] Rousu 等人为比较 SRM 和 TOF-MS 的单位分辨率, 在人血浆中定量分析了 11 个固醇类物质, 结果显示, 基于三重四极杆的 SRM 方法检测下限为 0.5~5 ng/ml, 灵敏度高于 TOF-MS( 检测下限 0.5~20 ng/ml). Zhi 等 [8] 人用非同位素标记 SRM 法快速定量蛋白, 测量了 3 个有标准品的血清蛋白, 结果可定量 0.2~2 fmol 的样品. 而一般质谱的理论灵敏度在 pg 级别, 实际应用时还无法达到此灵敏度. 相比之下 SRM 技术的图 1 SRM 技术原理示意图 64

3 中国科学 : 生命科学 2013 年第 43 卷第 1 期灵敏度显著提高, 此外样品分馏技术 ( 包括多维分馏亲和富集高丰度蛋白去除 ) 可进一步提高 SRM 灵敏度 [9]. 3.3 高通量 SRM 在全扫描方式下每次质谱扫描可同时检测近 100 个蛋白. 在预置 MRM 方式下, 因只在目标肽段出现的保留时间窗口内对其进行靶向扫描, 可提高质谱扫描时间的利用率, 此方法每次质谱扫描可同时检测超过 1000 个 transitions, 相当于数百个蛋白质. 此外, isrm 模式可将 transitions 分为主要的和次要的, 分析时只采集主要的 transitions, 只有当主要的 transitions 超过一定阈值时才采集次要的, 这样更进一步节约了扫描时间, 提高了通量. 在生物标志物研究领域中, 与每次只能检测一种蛋白质的传统定量方法如蛋白质印迹 (Western blot) 或酶联免疫 (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 相比, SRM 高通量的特点具有很大优势. 而且, 该定量技术可不依赖抗体, 从而节约了购买大量抗体的成本. 3.4 重现性好 SRM 技术检测特定的离子, 且通过两重选择, 背景复杂度大大降低, 这些都使得 SRM 技术重现性较好. 很多文献表明, SRM 技术的平均 CV 值普遍小于 10% [10~12]. 4 SRM 技术关键及现有软硬件体系 SRM 技术的关键涉及目标肽段的选择标记及 [9] 富集. Lange 等人对肽段的选择做了详细的介绍. 首先, 要选择可被质谱检测到且信号较强的肽段, 这些信息可参照公共数据集中的数据, 如 Peptide- Atlas Human Proteinpedia GPM Proteomics Database 或 PRIDE 等数据库中的数据信息 ( 表 1 对其进行了总结 ). 此外也可参考实验室的自产数据, [18] Ludwig 等人描述了一种在未标记的样品中估计蛋白质绝对丰度的方法, 此方法建立在每个蛋白其质谱信号强度最强的肽段在整个蛋白质组中信号强度几乎不变的假设前提下, 因此在选择肽段时根据一级谱肽段的离子信号强度选择每个蛋白的 SRM 检测肽段. 其次, 选择的肽段要有蛋白质特异性, 甚至这个肽段还要能区分蛋白质的不同剪接体或单核苷酸变异 (single nucleotide polymorphisms, SNP), NCBI 等数据库可查询可变剪接和 SNP 信息. 再次, 蛋白质还存在翻译后修饰情况, 虽然 SRM 可靶向检测蛋白质的翻译后修饰, 但当对蛋白质总量而非某种修饰形式的蛋白质进行定量时, 应避免选择可能发生修饰的肽段, 否则将无法确定丰度的变化是源自总蛋白还是未修饰蛋白的比例. 另外, 肽段的选择还需考虑氨基酸构成, 如甲硫氨酸和色氨酸残基易在样本处理过程中发生氧化, 谷氨酰胺和天冬酰胺可能因化学不稳定转化成谷氨酸或天冬氨酸, 应尽量避免选择包含这种易发生化学修饰氨基酸的肽段. 此外, 还应避免选择 15 个氨基酸以上的长肽段, 以及存在漏切位点的肽段. 在选择好目标蛋白的特异性肽段之后, 还要进一步选择每个肽段的母子离子对. 因为 1 次 SRM 实验可监测的母子离子对总数有限, 所以一般每个肽段会选择 2~4 个信号最强的母子离子对, 其选择可基于之前该蛋白的实测二级谱数据, 也可利用软件对碎裂位点进行预测. SRM 技术关键的第二点是目标肽段的稳定同位素标记, 这些重标的肽段被加入样品中作为内标, 每个肽段根据样本中肽段与其相应重标肽段的信号强度比值来进行定量. 此方法可解决非标记法信号强度波动的问题, 并可在复杂背景峰中找到目标肽段峰. 为不影响肽段的保留时间等属性, 常用 15 N, 13 C 和 18 O 作为重标同位素. 化学合成法是最早使用的肽段标记方法, 以同位素标记的氨基酸为原料进行制备, 但其耗时耗力且价格昂贵. 目前蛋白质组学中常用的同位素标记方法可分为体外标记法和体内标记法, 体外标记法如表 1 蛋白质组串联质谱中鉴定到的肽段数据库信息数据库名称数据库网址来源文献 GPM Proteomics database PeptideAtlas Humanproteinpedia PRIDE ISPIDER central [13] Craig 等人 [14] Desiere 等人 Mathivanan 等人 [16] Jones 等人 [17] Siepen 等人 [15] 65

4 张剑等 : 选择反应监测技术在蛋白质组学研究中的应用 [19] Zhao 等人对 18 O 同位素标记法做了优化并用其验证了肝癌的血清学标记物, 体内标记法常用 SILAC 技术. 此外还出现了一种被称为 QconCAT (quantification concatamer) 的高通量体内标记法 [20], 此方法是构建一个由几十条目标肽段串联表达的载体, 将其在重标培养基培养的大肠杆菌中表达, 纯化蛋白在酶切后可得到重标的目标肽段, 此方法有着高通量的优点并且可重复获得重标 QconCAT 蛋白. SRM 技术虽然有着高灵敏度高特异性的优势, 但仍不足以直接对复杂样本中的低丰度蛋白进行定量, 因此 SRM 技术关键的第三点就是对样本中的目标蛋白进行富集. 包括非特异性的富集, 如对糖蛋白磷酸化蛋白的富集以及基于蛋白或肽段抗体的特异性富集, 该方法可富集目标抗原肽段 100~1000 倍 [21]. 此外, 还可以通过去除高丰度蛋白增加预分离馏分来增强复杂样本中目标蛋白的检测下限等方法实现对感兴趣蛋白质的相对富集. 常见的去除高丰度蛋白的方法有白蛋白沉淀 [22] [23] 尺寸排除分馏和免疫亲和筛选 [24]. 现有的 SRM 技术硬件体系有 Thermo 公司的 TSQ 系列三重四极杆质谱仪 AB SCIEX 公司的 Triple Quad 5500 质谱仪沃特世公司 (Waters) 的 Xevo TQD 质谱仪以及 Agilent6460 三重串联四极杆液质联用仪等, 相应的分析软件有 Thermo 公司的 Pinpoint 软件 AB 公司的 MRMPilot 沃特世公司的 Verify E 以及安捷伦公司的 Optimizer 等. 此外, 还有研究机构自行开发的分析软件, 如 Ruedi Aebersold 实验室研发的 TIQAM(targeted identification for quantitative analysis by multiple reaction monitoring) 能够支持 MRM 实验的工作流程, 又如华盛顿大学开发的软件 Skyline 可用于 SRM 方法的创建和定量数据的分析. 5 现有 SRM 技术能力 SRM 技术指标如质量准确度灵敏度动态范围通量变异系数 (coefficient of variation, CV) 等对复杂样本中蛋白质的可靠定量十分重要. 表 2 总结了已有 SRM 应用的代表性文献中的各项技术指标. [25] Picotti 等人利用 SRM 检测和定量了酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 全动态范围的蛋白质组, 检测范围可到个位数拷贝数每细胞 (copies/cell), 并且检测到了经典方法无法检测到的低丰度蛋白, 说明这个方法可高通量并且精确的定量酵母中几乎所 [26] 有感兴趣的蛋白质. Costenoble 等人利用基于 SRM 的质谱技术定量了组成酿酒酵母中心碳循环和氨基酸代谢网络的 228 个蛋白质, 跨越了 5 个不同的代谢状态, 90% 的目标蛋白质都可被连续的检测和定量. 有很多文献提到 SRM 技术能应用于更复杂的样本, 如真核生物细胞裂解液, 血清血浆滑液尿液以 [27] 及组织间隙液等体液. Ebhardt 等人对未分馏的人上皮骨肉瘤细胞系 U-2 OS 进行全蛋白质分析, 检测动态范围跨越了将近 4 个数量级, 定量下限为 7500 [28] copies/cell. Selevsek 等人利用 SRM 技术结合稳定同位素稀释法检测和定量了 14 个膀胱癌患者尿液中的 16 个与膀胱癌有关的蛋白质, 定量下限达到 ng/ml, 动态范围达到 4 个数量级, 平均 CV 值在 10% 的范围内, 这些结果说明, SRM 技术在复杂样本表 2 SRM 技术指标总结样本定量蛋白数定量蛋白的浓度范围灵敏度平均 CV 通讯作者出版刊物及年份酵母 ~ copies/cell 120 copies/cell <10% Domon B Mol Cell Proteomics, 2011 [7] 酿酒酵母 21 41~ copies/cell < 50 copies/cell 15% Aebersold R Cell, 2009 [25] 酿酒酵母 ~ copies/cell <100 copies/cell / Aebersold R Mol Syst Biol, 2011 [26] 人细胞系 ~ copies/cell 7500 copies/cell / Aebersold R Proteomics, 2012 [27] 尿液 ~46.98 ng/ml 0.02 ng/ml <10% Domon B Proteomics, 2011 [28] FFPE 组织 1 305~12860 amol/μg 31 amol 25% Burrows J Clin Proteomics, 2012 [29] 血浆 ~167 fmol/μl 3 ng/ml <25% Carr SA Mol Cell Proteomics, 2011 [30] 血浆 4 50 pg/ml~100 ng/ml 50 pg/ml 5.5% Qian W J Proc Natl Acad Sci USA, 2012 [31] 钩端螺旋体 19 68~ copies/cell 68 copies/cell <26% Aebersold R Mol Syst Biol, 2011 [32] 人细胞系 E3~ copies/cell 4500 copies/cell / Aebersold R Mol Syst Biol, 2011 [33] 血浆 88 44~ ng/ml 157 ng/ml 5.7% Paulovich A G Nat Biotechnol, 2011 [34] 66

5 中国科学 : 生命科学 2013 年第 43 卷第 1 期中定量少量蛋白有较好的敏感性和重现性. [29] Hembrough 等人将 SRM 技术用于分析福尔马林固定的石蜡包埋 (formalin fixed paraffin embedded, FFPE) 肿瘤组织中的表皮生长因子受体蛋白, 结果表明, 直接在 FFPE 的病人肿瘤组织中测量表皮生长因 [30] 子受体灵敏度可达到 amol 水平. Kuhn 等人在 3 个独立实验室间系统性的评估了用多肽抗体免疫亲和富集方法结合 SRM 技术测定血浆中 6 个蛋白的情况, 检测下限可小于 1 ng/ml, 实验室内的平均 CV 值小于 11%, 实验室间测量的平均 CV 值小于 14%. Shi 等 [31] 人通过 PRISM(high-pressure, high-resolution separations coupled with intelligent selection and multiplexing) 方法结合 SRM 技术, 无需抗体富集蛋白, 直接在复杂样品中定量低丰度蛋白, 在人血浆中可定量 pg/ml 量级的低丰度蛋白. 表 2 总结了目前 SRM 技术所能达到的技术指标, 对于复杂样品中蛋白质的绝对定量, SRM 技术已是性能效果最好的技术之一. 6 SRM 技术在蛋白质组学研究中的应用 SRM 技术的诸多特点, 使其在蛋白质组学以及诸多其他领域的研究中得到广泛应用. 下面对 SRM 技术在蛋白质组学研究中的主要应用做简要介绍. 6.1 SRM 技术在生物标志物验证工作中的应用疾病特异性的生物标志物研究是蛋白质组学研究中的一个重要领域, 对疾病的预防诊断及治疗效果的监控等起到重要作用. 生物标志物的研发可分为 3 个阶段 : 发现阶段确认阶段和临床验证阶段. 蛋白质组学研究已经成功应用于生物标志物的发现阶段, 通过比较正常样品和疾病样本中蛋白质表达的差异, 已经找到很多候选的生物标志物, 但数据的可靠性需要得到最终的临床验证, 比如需要利用具有临床应用价值的 ELISA 方法对候选生物标志物进行大样本量的筛选. 但 ELISA 需要制备抗体, 耗费时间且价格昂贵, 每次只能分析 1 个蛋白. 为了降低验证的成本提高候选蛋白在后续验证中的成功率, 需要高通量的发现后确证技术来填补由发现到验证的鸿沟. 而 SRM 质谱技术正是凭借其高选择性高灵敏度高通量低成本的优势, 在生物标志物的发现后验证过程中发挥了重要作用. [35] Lopez 等人利用蛋白质组学和质谱技术在妊娠期 3 个月的母体血清中发现 21 三体综合征的生物标志物, 并用 SRM 技术定量, 鉴定了 12 个新的候选 [36] 标志物. Cho 等人在羊膜水中检测唐氏综合征的标志物, 利用 SRM 技术验证了 13 个候选蛋白, 并最终确定了 5 个候选蛋白. 这些研究都表明, SRM 技术对于生物标志物的验证工作可提供一个高通量和精确 [34] 的平台. Whiteaker 等人通过多个数据集整合了 1000 多个假定的血浆生物标志物, 这些数据都是从乳腺癌的鼠模型上得到的, 之后对其中的 88 个蛋白质在 80 例血浆样本中进行了 SRM 的定量实验, 确认了 36 个蛋白质的丰度在肿瘤小鼠的血浆中上调. 其中蛋白质的平均检测下限为 68 ng/ml, 平均定量下限为 157 ng/ml, 所有分析物在定量下限的平均变异系数 (CV) 是 5.7%, 可见 SRM 对于复杂样品的分析优势很大, 很适合生物标志物的高通量验证工作. 6.2 SRM 技术在蛋白质翻译后修饰研究中的应用生物体内蛋白质的活性主要由共价修饰来调控, 这些修饰通常发生在蛋白质翻译时和翻译后. 了解一个特定蛋白质的功能和调控, 常常需要鉴定它的修饰类型和位置. 目前基于质谱的蛋白质翻译后修饰研究方法主要是对样品进行富集和预分离. 如当前蛋白质的磷酸化分析主要通过对磷酸化肽段进行富集来提高灵敏度, 但依然难以获得满意的效果. 对 [37] 此 SRM 技术则展示出了其优势, Eissler 等人利用非标记的 SRM 质谱技术研究多位点的蛋白质磷酸化, 其利用合成的肽底物和纯化的酶组成一个已知的系统, 以便检测 SRM 技术对于磷酸酶和激酶活性的测量能力. 在比较 SRM 技术与常规方法对于测量磷酸酶动力学和激酶活性能力的实验中, SRM 动态范围达到 4 个数量级, 并且重复分析单个样品的变异系数始终小于 4%, 通过比较 SRM 技术和常规技术对于去磷酸化效率的测量以及反应速率的测量, 说明 SRM 可用于测量体内磷酸酶和激酶的活性, 其高特异性高通量成为了独特优势. 此外, SRM 技术也可应用于 [38] 糖基化乙酰化泛素化等修饰的研究中. Li 等人通过结合特异糖基化的糖肽提取策略与 SRM 技术测量复杂生物样本中糖蛋白的不同糖基化形式. Zhang [39] 等人利用 SRM 技术在阿尔茨海默病中定量特异的组蛋白乙酰化水平, 与 Western blot 验证结果相符. [40] Mirzaei 等人用 SRM 技术判断单泛素化链相对于全部的泛素化浓度中的不同类型体内泛素化连接频率. 67

张剑等: 选择反应监测技术在蛋白质组学研究中的应用 6.3 SRM 技术在蛋白质-蛋白质相互作用中的应用在细胞内, 蛋白质是通过蛋白质-蛋白质相互作用, 即蛋白质的复合物来发挥功能的. 酵母双杂交系统被广泛用于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用, 但它仅适合研究二元的相互作用, 不适合用于相互作用网络的高通量分析.

6 张剑等: 选择反应监测技术在蛋白质组学研究中的应用 6.3 SRM 技术在蛋白质-蛋白质相互作用中的应用在细胞内, 蛋白质是通过蛋白质-蛋白质相互作用, 即蛋白质的复合物来发挥功能的. 酵母双杂交系统被广泛用于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用, 但它仅适合研究二元的相互作用, 不适合用于相互作用网络的高通量分析. 对信号通路的研究不仅要分析蛋白质蛋白质的相互作用, 还要对相互作用的网络进行定量分析. Bisson 等人[41]利用亲和纯化后的 SRM 技术测定了与 GRB2 相互作用的蛋白质, 并用 SRM 技术定量测量了与 GRB2 相互作用的 90 个蛋白的变化, 该研究显示了 SRM 在研究细胞内动态网络方面的强大能力. 7 SRM 技术最新进展虽然 SRM 技术已经具有高特异度高灵敏度高通量的特点, 但仍有提升的空间, 下面介绍 SRM 技术在特异度灵敏度及分析通量方面的最新进展. 7.1 特异度为进一步提高 SRM 技术的选择性, 一种叫做 MRM3(multiple reaction monitoring cubed)的方法被提出 [42]. 此方法只能应用于混合式的三重四极杆线性离子阱质谱仪. 母离子在三重四极杆中被选出后进图2 行 CID 碎裂, 产生的碎片离子进入线性离子阱后被进一步选择和裂解, 最终检测器检测第二代子离子产物. 此方法被证明可进一步降低检测下限, 适用于对背景复杂的样品进行分析. 7.2 灵敏度 SRM 的灵敏度还不足以测量复杂样品中的低丰度蛋白, 对此一种称为 SISCAPA(stable isotope standards and capture by antipeptide antibodies)的方法被提出. 其利用亲和富集的肽段结合稳定同位素稀释的方法, 并用基于 SRM 技术的质谱检测, 对肽段进行定量测量. Whiteaker 等人[43]用此方法在人血浆中定量了 89 个蛋白中的 403 个胰酶酶切肽段, 结果显示可检测人血浆中浓度小于 0.5 fmol/μl 的靶向肽段. 7.3 通量 SRM 技术与传统定量技术相比有着高通量的特性, 但其每次质谱分析定量的蛋白数还是有限制的, 对此一种被称为 SWATH(sequential window acquisition of all theoretical fragment-ion spectra)的新技术被提出, 其用一个高分辨率的 TOF 质量分析器代替第三个低分辨率的三重四极杆, 并通过连续运行 32 个 25 Da 宽的母离子分离窗来获得全部样本的数据(图 2[44]). Gillet 等人[44]经实验对比证明了此技术与 SRM SWATH 原理图(引自文献[44]) A: 在整个液相分离过程中对连续的 25 Da 的母离子分离窗循环检测; B: 一个分离窗(450~475 m/z)的二级谱实测数据图中 450~475 m/z 水平深色带为此窗口的残留母离子垂直方向的共洗脱信号为同一母离子产生的碎片离子 68

7 中国科学 : 生命科学 2013 年第 43 卷第 1 期技术在检测下限定量下限质量精确度等方面表现能力接近, 而 SWATH 技术则无通量的限制, 可在 1 次分析中同时实现蛋白质的全谱鉴定和定量, 真正实现了高通量. 8 SRM 技术的挑战及展望对复杂样本中低丰度蛋白的大规模定量分析仍是 SRM 技术的研究挑战. 这也是蛋白质组学研究的普遍问题, 是由生物样本蛋白质构成的复杂性决定的. 从表 2 可以看出, 目前对原核生物等复杂度较低的样本可以测出其全动态范围内的蛋白质, 但像血清那样复杂的样本动态范围可达到 10 个数量级以上, 就目前已有研究达到的对 4 个数量级浓度范围的蛋白质进行定量的结果而言, 对血清等复杂样本中的蛋白质进行大规模定量依然是难点. 此外, 对低丰度蛋白进行定量也是包括 SRM 在内的多种质谱技术的瓶颈. 目前主要通过 2 种方式实现低丰度蛋白的定量, 一是对样本进行预处理如免疫去除高丰度蛋白质或亲和富集等方法降低样本复杂度 ; 二是通过改进 SRM 技术本身的灵敏度特异度等方法, 如通过应用混合式质谱仪来提高分辨率, 或 MRM 3 的方式提高特异度. SRM 技术目前国际上最具代表性的是 Ruedi Aebersold 教授的实验室, 他们一直致力于开发定量蛋白质组学的新技术和新方法, 他们研发的 SWATH 技术真正实现了 SRM 的高通量. 我国对 SRM 技术的 [14] 应用也逐渐成熟, Zhao 等人利用 SRM 技术验证了 [45] 肝癌的血清候选标志物, Su 等人用 SRM 技术在人血浆中鉴定和定量了存在单氨基酸多态性 (single amino acid polymorphisms, SAPs) 的肽段. 虽然 SRM 技术目前仍存在诸多挑战, 但随着技术的不断发展, 相信该技术在蛋白质组学研究中会有更为广阔的应用前景. 参考文献 1 Zakett D, Flynn R G A, Cooks R G. Chlorine isotope effects in mass spectrometry by multiple reaction monitoring. J Phys Chem, 1978, 82: Yost R A, Enke C G. Triple quadrupole mass spectrometry for direct mixture analysis and structure elucidation. Anal Chem, 1979, 51: Murray K K, Boyd R K, Eberlin M N, et al. Standard definitions of terms relating to mass spectrometry. IUPAC Recommendations, Public Draft, Kiyonami R, Schoen A, Prakash A, et al. Increased selectivity, analytical precision, and throughput in targeted proteomics. Mol Cell Proteomics, 2011, 10: M doi: /mcp.M Mirzaei H, Regnier F. Enhancing electrospray ionization efficiency of peptides by derivatization. Anal Chem, 2006, 78: Gallien S, Duriez E, Domon B. Selected reaction monitoring applied to proteomics. J Mass Spectrom, 2011, 46: Rousu T, Tolonen A. Comparison of unit resolution SRM and TOF-MS at 12,000 mass resolution for quantitative bioanalysis of 11 steroids from human plasma. Bioanalysis, 2012, 4: Zhi W, Wang M, She J X. Selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry without isotope labeling can be used for rapid protein quantification. Rapid Commun Mass Spectrom, 2011, 25: Lange V, Picotti P, Domon B, et al. Selected reaction monitoring for quantitative proteomics: a tutorial. Mol Syst Biol, 2008, 4: Weijden E T, Broek M P, Ververs F F. Easy and fast LC-MS/MS determination of lidocaine and MEGX in plasma for therapeutic drug monitoring in neonates with seizures. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2012, : Shi J, Liu H F, Wong J M, et al. Development of a robust and sensitive LC-MS/MS method for the determination of adenine in plasma of different species and its application to in vivo studies. J Pharm Biomed Anal, 2011, 56: Makawita S, Diamandis E P. The bottleneck in the cancer biomarker pipeline and protein quantification through mass spectrometry-based approaches: current strategies for candidate verification. Clin Chem, 2010, 56: Craig R, Cortens J P, Beavis R C. Open source system for analyzing, validating, and storing protein identification data. J Proteome Res, 2004, 3: Desiere F, Deutsch E W, King N L, et al. The PeptideAtlas project. Nucleic Acids Res, 2006, 34: D655 D Mathivanan S, Ahmed M, Ahn N G, et al. Human Proteinpedia enables sharing of human protein data. Nat Biotechnol, 2008, 26: Jones P, Cote R G, Cho S Y, et al. PRIDE: new developments and new datasets. Nucleic Acids, 2008, Res36: D878 D Siepen J A, Belhajjame K, Selley J N, et al. ISPIDER Central: an integrated database web-server for proteomics. Nucleic Acids, 2008, Res36: W485 W Ludwig C, Claassen M, Schmidt A, et al. Estimation of absolute protein quantities of unlabeled samples by selected reaction monitoring 69

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中国科学 : 生命科学 2013 年第 43 卷第 1 期 Application of Selected Reaction Monitoring in Proteomics Research ZHANG Jian, JIANG Ying & SUN Wei State Key Laboratory of Proteomics, Beijing Proteome Research Center,

targeted MS signals according to the given or predicted information.

9 中国科学 : 生命科学 2013 年第 43 卷第 1 期 Application of Selected Reaction Monitoring in Proteomics Research ZHANG Jian, JIANG Ying & SUN Wei State Key Laboratory of Proteomics, Beijing Proteome Research Center, Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing , China Selected reaction monitoring (SRM) is a technology performed on triple quadrupole mass spectrometers (MS), which aims to acquire targeted MS signals according to the given or predicted information. With high selectivity, repeatability, sensitivity and wide dynamic range, SRM has been widely applied to proteome research and used for protein absolute quantification in biological samples. This review mainly focuses on characteristics and development of SRM technology, as well as its application and future prospects in proteomics. selected reaction monitoring, proteomics, absolute quantification, mass spectrometry doi: / 张剑, 2011 年毕业于北京大学, 获电子信息科学技术专业理学学士学位 ; 现就读于军事医学科学院放射与辐射医学研究所, 在蛋白质组学国家重点实验室攻读硕士. 研究领域 : 利用基于质谱技术的蛋白质组学方法, 进行肝癌生物标志物的研究. 孙薇, 博士, 副研究员. 长期从事肝病相关蛋白质组学研究, 重点进行 HBV 相关肝炎肝硬化肝癌及肝癌转移的发病机制和生物标记物研究. 在 Molecular & Cellular Proteomics, Proteomics, Journal of Proteome Research 等杂志发表 SCI 论文 14 篇, 单篇 SCI 他引最高 73 次. 主持国家自然科学基金蛋白质组学国家重点实验室自主研究课题 ; 是国家高技术研究发展计划重大专项科技部重大专项研究子课题负责人. 参编专著和译著 2 部 ; 申请中国发明专利 7 项, 获授权 1 项. 被评为北京市科技新星. 71

《中国科学》A、E、G与F小开本版式设计

《中国科学》A、E、G与F小开本版式设计 222 E 2006, 36(2): 222~234 * 1** 1,2 1,2 1,2 1,2 3 3 1 1 1,2 (1., 100080; 2., 100039; 3., 200031),. ;,,.. 20 90 (human genome project, HGP), ; HGP 2003, 21. (proteomics) ; (computational proteomics),,,