肺炎克雷伯菌和假单胞菌耐药机制研究

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1 肺炎克雷伯菌和假单胞菌耐药机制研究 基金项目 : 国家自然科学基金, 广东省自然科学基金 中文摘要 1. 目的 肺炎克雷伯菌和假单胞菌均是临床上常见的院内感染菌, 均为呼吸道感染的主要病原菌 目前这两种菌种的临床分离率不断增加, 耐药情况日趋严重, 临床治疗也十分棘手 本研究的目的在于了解汕头地区肺炎克雷伯菌和假单胞菌的耐药情况及耐药机制, 为临床合理应用抗生素提供理论依据 2. 方法 2.1 收集产超广谱 β- 内酰胺酶肺炎克雷伯菌共 74 株, 药敏试验了解其耐药情况, 设计合成整合酶 I 型整合子可变区的上下游引物, 煮沸法提取细菌总 DNA 作为模板, 整合子可变区 PCR 扩增产物纯化 克隆后测序, 所得序列翻译后在 Genbank 数据库进行比对分析 2.2 收集耐亚胺培南的铜绿假单胞菌, 设计合成铜绿假单胞菌外膜蛋白 OprD 2 IMP VIM 和 SPM 型获得性金属酶 PSE 酶的上下游引物, 煮沸法提取细菌总 DNA 作为模板,PCR 技术筛选 OprD 2 获得性金属酶和 PSE 酶基因阳性菌株 2.3 选取同一病人治疗前后临床分离株, 随即扩增多态性 DNA 对菌株进行基因分型, 选取同源性菌株, 头孢西丁三相试验和头孢西丁诱导试验检测 AmpC 酶产生情况 2.4 对临床上分离的一株对 β- 内酰胺类抗生素高度耐药的荧光假单胞菌, 微量稀释法测定对多种抗生素的 MIC, 碱裂解法提取质粒 DNA, 金属酶及 I 型整合酶引物扩增产物纯化测序 3. 结果 3.1 产超广谱 β- 内酰胺酶肺炎克雷伯菌多为多重耐药株, 其中 69 株 IntI1 基因 1

2 阳性, 未发现 IntI2 和 IntI3 基因 菌株 1 型整合子可变区包含 11 种不同的基因盒组合, 共有 13 种不同的基因盒 Dfr 和 aada 基因盒最多见, DfrA12-orfF-aadA 是最常见的基因盒组合, 未发现编码 ESBLs 的基因盒 3.2 耐亚胺培南铜绿假单胞菌仅对头孢哌酮 / 三唑巴坦有较高敏感率, 未发现产金属酶株 共有 6 株菌株产 PSE 酶 大多数菌株存在 OprD 2 基因突变 3.3 抗生素治疗前菌株多产诱导高产 AmpC 酶, 抗生素治疗后, 头孢他啶对菌株的 MIC 明显上升, 菌株变成持续高产 AmpC 酶株 3.4 菌株对包括碳青霉烯类抗生素在内的 β- 内酰胺类抗生素高度耐药, 对环丙沙星敏感, 金属酶试验阳性, 金属酶编码基因位于 I 型整合子上, 该整合子位于一个大小为 20kb 左右的质粒上, 部分测序结果表明与 IMP-8 的氨基酸序列完全相同 4. 结论 4.1 整合子在产 ESBLs 肺炎克雷伯菌的多重耐药中起重要作用, 但与 ESBLs 的产生和播散无关 4.2 头孢哌酮 / 三唑巴坦可作为耐亚胺培南铜绿假单胞菌感染的经验性首选用药, 铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的原因主要是外膜蛋白表达缺失导致外膜通透性下降 4.3 临床治疗产诱导高产 AmpC 酶铜绿假单胞菌感染要避免使用对酶有诱导作用的 β- 内酰胺类抗生素 4.4 菌株为产 IMP 型金属酶株, 位于 1 型整合子上, 可能引起金属酶播散, 同时, 该菌可能存在其耐药机制 关键词 : 肺炎克雷伯菌 ; 假单胞菌 ; 整合子 ; 金属 β- 内酰胺酶 ;AmpC 酶 2

3 Study on Resistant Mechanism of Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas spp. Fund: National natural science fund; National natural science fund of Guangdong Province ABSTRACT 1. Objective The objective was to study the resistance and its mechanism of Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas spp. isolated in Shanotou.This will contribute to a better control of the strain s prevalence and selection of appreciate antibiotics. 2. Methods 2.1 MIC was detected by E-test. PCR were performed to amplified integrases and the variable region of class 1 integron. The results of sequencing were then compared in GeneBank database. 2.2 PCR was performed with primers for metallo -β-lactamases, oprd 2 and PSE β-lactamase. 2.3 Eight pairs of Pseudomonas aeruginosa isolates before and after treatment with antibiotics were isolated from the same patient. RAPD was performed for genetyping. Cefoxitin induced test and cefoxitin three-dimensional test were performed. 2.4 MIC to antibiotics were detected by micro -dilution broth method. PCR was performed with primers for class 1 integrase and metallo -β-lactamase. PCR product was identified by sequencing and then compared in GeneBank database via internet. 3. Results 3

4 3.1 Most of the Klebsiella pneumoniae isolates were multi-resistant. Sixty-nine isolates were IntI1 gene positive but no IntI2 and IntI3 genes were found. Thirteen different gene cassettes and eleven different cassettes combinations were detected. 3.2 Cefoperazone /tazobactam showed better activity in vitro to imipenem -resistant Pseudomonas aeruginosa isolates than other antibiotics. No isolates produced metallo-β-lactamase were found. Six isolates produced PSE β-lactamase. Most of the isolates failed to produce an amplicon with primers for oprd Before treatment with antibiotic, most of the isolates were hyperinducible strains producing AmpC β-lactamase and after treatment, minimal inhibitory concentration to ceftazidime increased and all the isolates became hyperproducing AmpC β-lactamase strains. 3.4 The isolate were highly resistant to β-lactam antibiotics. IMP metallo-β-lactamase encoding gene was found to be integrated as a gene cassette within a class 1 integron on a plasmid about 20kb. 4. Conclusions 4.1 Integrons were prevalent and played an important role in multidrug resistance in ESBL-producing Klebsiella pneumoniae. The production of ESBLs and integrons will threaten the usefulness of antibiotic. 4.2 Cefoperazone /tazobactam can be used in the infection caused by imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa. The major mechanism of Pseudomonas aeruginosa resistant to imipenem is the loss of OprD 2 expression. 4.3 β-lactam antibiotics should be avoided in the infection caused by Pseudomonas aeruginosa strains producing hyperinducible AmpC β-lactamase. 4.4 IMP metallo-β-lactamase gene was located within a class 1 integron on a plasmid and this will facilitate the spread of resistance gene. 4

5 Key words: Klebsiella pneumoniae; Pseudomonas spp.; integron; metallo- β -lacatmases; AmpC β lacatmases 5

6 符号表 英文缩写英文全称中文译名 Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aerugionosa 肺炎克雷伯菌 铜绿假单胞菌 Amp ampicillin 氨苄西林 bp base pair(s) 碱基对 CaCl 2 calcium chloride 氯化钙 ddh 2 O double distilled water 双蒸水 DTT dithiothreitol 二硫苏糖醇 EDTA ethylenediaminetetraacetic acid 乙二胺四乙酸 ESBLs extended-spectrum β-lactamase 超广谱 β- 内酰胺酶 g gram 克 h hour 小时 IPM imipenem 亚胺培南 IPTG isopropylthio-β-d-galactoside 异丙基硫代 β-d- 半乳糖苷 Kan Kanamycin 卡那霉素 min minute 分钟 ml milliliter 毫升 mm millimol/liter 毫摩尔浓度 nitrocefin 头孢硝噻吩 PCR polymerase chain reaction 聚合酶链式反应 ph potential of hydrogen ph 值 [ 氢离子浓度倒数的对数 ] Taq thermus aquaticus DNA (polymerase) 栖热水生菌 DNA 聚合酶 TE Tris-EDTA 三 ( 羟甲基 ) 氨基甲烷 - 乙二胺四乙酸 Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethane 三 ( 羟甲基 ) 氨基甲烷 EDTA Ethylenediaminetetra acetic acid 乙二胺四乙酸 6

7 Tris Cl Tris hydrochloride Tris 盐酸盐 U Unit 单位 µg Microgram 微克 µl Microliter 微升 AZM aztreonam 氨曲南 CFZ cefazolin 头孢唑啉 CTX cefotaxime 头孢噻肟 FEP cefepime 头孢吡肟 MBL Metallo-β-lactamase 金属 β- 内酰胺酶 MIC Minimal inhibitory concertration 最低抑菌浓度 PG Penicililin G 青霉素钠 TAZ ceftazidime 头孢他啶 7

8 目录 中文摘要 I 英文摘要 III 符号表 ( 缩略语 ) VI 目录 VIII 第 1 章前言 (1) 第 2 章产 ESBLs 肺炎克雷伯菌整合子分析 (3) 1. 材料 (3) 1.1 临床菌株 (3) 1.2 实验仪器及试剂 (3) 实验仪器 (3) 试剂 (4) 引物合成 (4) 2. 实验方法 (5) 2.1 试剂制备 (5) LB 肉汤的制备 (5) MH 平板的制备 (5) TBE 电泳缓冲液的配制 (6) TE 缓冲液的配制 (6) 上样缓冲液的配制 (6) IPTG 母液的配制 (6) 溴化乙锭贮存液的配制 (6) X-gal 的配制 (7) LB 肉汤的制备 (7) 2.2 细菌复苏培养 (7) 2.3 E 试验 (7) 2.4 DNA 提取 (7) 2.5 PCR 扩增 (7) 8

9 2.6 琼脂糖凝胶电泳及限制性酶切 (7) 2.7 感受态细胞的制备 (7) 2.8 PCR 产物纯化 (8) 2.9 PCR 产物与 T 载体的连接 (8) 2.10 转化 (8) 2.11 阳性株筛选及测序 (9) 2.12 测序结果分析 (9) 3. 结果 (9) 3.1 药敏试验 (9) 3.2 IntI1, IntI2 和 IntI3 基因引物扩增结果 (9) 3.3 RB317 和 RB320 引物扩增和限制性酶切结果 (10) 3.4 测序和氨基酸序列比对结果 (10) 3.5 不同耐药谱菌株整合子携带基因盒情况 (24) 4. 讨论 (28) 参考文献 (29) 第三章耐亚胺培南铜绿假单胞菌流行病学分析 (33) 1. 材料 (33) 1.1 临床菌株 (33) 1.2 实验仪器及试剂 (33) 实验仪器 (33) 试剂 (33) 引物合成 (34) 2. 方法 (34) 2.1 药敏实验 (34) 2.2 金属酶表型检测 (34) 2.3 DNA 提取 (35) 2.4 PCR 扩增 (35) 2.5 测序 (35) 3. 结果 (36) 3.1 耐亚胺培南铜绿假单胞菌药敏试验结果 (36) 9

10 3.2 金属酶表型检测结果 (37) 3.3 PCR 扩增结果 (37) 金属酶引物扩增结果 (37) 外膜蛋白扩增结果 (37) PSE 引物扩增结果 (37) 3.4 测序结果 (38) 4. 讨论 (40) 参考文献 (43) 第四章 AmpC 酶介导的铜绿假单胞菌耐药性分析 (46) 1. 材料 (46) 1.1 临床菌株 (46) 1.2 实验仪器及试剂 (46) 实验仪器 (46) 试剂 (46) 2. 方法 (46) 2.1 细菌复苏和培养 (47) 2.2 细菌 DNA 提取 (47) 2.3 细菌随机扩增多态性 DNA 分型 (47) 2.4 琼脂糖电泳 (48) 2.5 药敏试验 (48) 2.6 酶提取 (48) 2.7 头孢西丁三相试验 (49) 2.8 头孢西丁诱导实验 (49) 3. 结果 (49) 3.1 RAPD 分型结果 (49) 3.2 药敏试验结果 (50) 3.3 头孢西丁三相试验 (50) 3.4 头孢西丁诱导实验 (51) 4. 讨论 (52) 参考文献 (54) 10

11 第五章一株产金属酶荧光假单胞菌的耐药性分析 (56) 1. 材料 (56) 1.1 临床菌株 (56) 1.2 实验仪器及试剂 (56) 仪器 (56) 试剂 (56) 引物合成 (57) 2. 实验方法 (57) 2.1 试剂配制 (57) 2.2 细菌复苏和培养 (57) 2.3 MIC 测定 (57) 2.4 金属酶表型检测 (57) 2.5 DNA 提取 (57) 2.6 质粒 DNA 提取 (58) 2.7 PCR 扩增 (58) 2.8 克隆 测序及序列分析 (58) 2.9 酶粗提液的提取 (58) 2.10 确定各底物的最佳测定波长 (59) 2.11 酶稳定性测定 (59) 3. 结果 (59) 3.1 临床资料 (59) 3.2 药敏试验结果 (59) 3.3 金属酶表型检测 (60) 3.4 质粒提取 (60) 3.5 PCR 扩增结果 (61) 3.6 测序结果 (61) 种 β- 内酰胺类抗生素的酶稳定性结果 (62) 4. 讨论 (62 ) 参考文献 (65) 结论 (67) 11

12 综述一 (69) 综述二 (73) 致谢 (82) 攻读博士学位期间发表的论文 (83) 12

13 第一章前言 肺炎克雷伯菌和假单胞菌是临床上常见的院内感染菌, 它们广泛存在于自然界中, 常常感染免疫力低下的人群, 多引起呼吸道感染, 目前这两种细菌的临床分离率不断增加, 耐药情况日趋严重 了解这些细菌的耐药情况及耐药机制, 对有效抑制耐药菌株产生和传播, 提高临床治愈率具有重要意义 β- 内酰胺类抗生素是临床上最常用的一类抗生素, 其抗菌谱广, 抗菌活性强, 副作用少 随着这类抗生素在临床上的广泛使用, 肺炎克雷伯菌和假单胞菌对这类抗生素的耐药率不断升高 β- 内酰胺酶的产生是细菌对这类抗生素耐药的主要原因 其中, 超广谱 β- 内酰胺酶 (ESBLs) 能水解青霉素 第一代到第三代头孢菌素类抗生素, 可介导菌株对广谱 β- 内酰胺类抗生素耐药, 而肺炎克雷伯菌是最常见的产超广谱 β- 内酰胺酶的菌种之一 整合子是一种可移动的基因表达元件, 由两端的保守序列和中间的可变区组成, 可变区可含数量不等 功能不同的基因盒, 目前发现的基因盒多编码耐药基因, 可介导对包括 β- 内酰胺类抗生素在内的多种抗生素耐药 整合酶位于其 5 端保守序列, 能特异性地整合和切除基因盒, 对肺炎克雷伯菌尤其是多重耐药肺炎克雷伯菌而言, 整合子已经成为菌株耐药性产生和传播的重要机制 假单胞菌所产生的 β- 内酰胺酶主要是 PSE 酶和获得性金属 β- 内酰胺酶 临床上治疗多重耐药的假单胞菌感染, 往往以碳青霉烯类抗生素作为首选药物, 而获得性金属 β- 内酰胺酶多位于整合子等可移动基因元件上, 可以在不同的菌株间播散, 能介导菌株对碳青酶烯类抗生素耐药, 因此, 金属酶一旦产生, 治疗十分棘手且危害性很大 铜绿假单胞菌作为假单胞菌的代表菌种, 对碳青酶烯类抗生素耐药的机制除了金属酶的产生外, 还有外膜通透性的降低 AmpC 酶的产生以及外排泵的表达等 OprD 2 通道蛋白的表达减少或不表达是铜绿假单胞菌对 13

14 碳青霉烯类抗生素通透性降低的主要原因 AmpC 酶有很强的可诱导性, 病人接受抗生素治疗后, 由于抗生素的诱导作用, 菌株产酶量大增, 这可能导致原来敏感的菌株变成耐药株, 从而导致治疗失败 国内外对肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌的耐药现状及耐药机制均作了多方面的研究, 而汕头地区除了药敏结果的报道外尚无系统研究 本课题收集了汕头地区分离的肺炎克雷伯菌和假单胞菌, 对其耐药情况和具体耐药机制进行研究, 为指导本地区临床合理用药和研究针对性治疗措施提供必要的理论依据 14

15 第二章 产 ESBLs 肺炎克雷伯菌整合子分析 肺炎克雷伯菌是目前临床上重要的院内感染菌, 常对多种抗生素耐药, 超广谱 β- 内酰胺酶 (ESBLs) 是其对 β- 内酰胺类抗生素耐药的主要原因 整合子作为一种可移动的基因表达元件, 可整合和切除耐药基因, 在肺炎克雷伯菌的多重耐药中起着重要的作用 为了解汕头地区产 ESBLs 肺炎克雷伯菌的耐药情况和整合子在菌株多重耐药中所起的作用, 我们收集了汕头大学医学院第一附属医院 2001 年至 2003 年间临床分离的产 ESBLs 肺炎克雷伯菌, 并对其耐药情况和整合子的产生情况进行了研究 1. 材料 1.1 临床菌株 实验菌株来自汕头大学医学院第一附属医院检验科 2001 年 2 月到 2003 年 6 月间从不同病人感染病灶收集的标本共 74 株, 全部菌株经常规方法和 VITEK-60 ( 法国 )GNI 卡鉴定, 证实为肺炎克雷伯菌 其中,23 株来自神经外科,14 株来自新生儿中心,11 株来自外科 ICU,7 株来自儿科病房,5 株来自神经内科, 另外 14 株来自其他病区 菌株主要分离自痰液 (68 株 ), 其次为分泌物 (3 株 ), 血液 (1 株 ), 尿液 (1 株 ), 粪便 (1 株 ) 所获菌株根据 2006 年美国临床及实验室标准协会 (CLSI) 推荐的标准纸片扩散法, 采用头孢噻肟 / 头孢他啶和克拉维酸进行筛选和确认试验, 证实为产 ESBLs 阳性株 1.2 实验仪器及试剂 15

16 1.2.1 实验仪器 无菌间超净工作台 API 鉴定系统及 VITEK60 全自动鉴定 / 药敏分析仪 ( 法国 biomérieux 公司 ); PCR 仪 (MJ-Research 公司, 型号 PTC-200) 凝胶成像分析仪 (BIO-RAD 公司 ) 电热恒温培养箱 ( 上海跃进医疗器械一厂 ) 5417R 型低温高速离心机 (Eppendorf 公司 ) DYY-III5 型稳压稳流电泳仪 ( 北京六一仪器厂 ) 超净工作台 ( 苏净集团安泰公司 ) 恒温水浴箱 (SHEL LAB) 摇床 ( 德国 Johanna Otto GmbH 公司 ) 试剂 LB 肉汤 / 琼脂和 MH 肉汤 / 琼脂 ( 中国进出口商品检验技术研究所 ) E 实验纸条 (AB BIODISK, Sweden) Taq DNA 聚合酶 ( 华美生物工程公司 ) dntp(a.p ) DNA marker DL2000( 大连宝生物工程有限公司 ) UNIQ-10 柱式 PCR 产物纯化试剂盒 ( 上海生工 ) PCR 产物连接试剂盒 ( 上海生工 ) X-gal( 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚 -β-d 半乳糖苷 ), 异丙基硫代 -β-d- 半乳糖苷 (isopropyl D-thiogalactoside, IPTG), 琼脂糖, 溴酚蓝, Na 2EDTA, Tris 碱, 无水乙醇 ( 上海生工 ) 氨苄西林 ( 山东鲁抗医药有限公司 ) 氯化钙 ( 兰溪市硅胶厂 ) 二甲基甲酰胺 ( 上海生工 ) 引物合成 16

17 由上海生工合成, 具体序列 片段长度及退火温度见表 实验方法 2.1 试剂配制 LB 肉汤的制备 称取 21g LB 肉汤粉, 加蒸馏水至 1000ml 121 高压灭菌 15 min, 分装, 置 4 冰箱保存备用 MH 平板的制备 称取 75g MH 琼脂粉, 加蒸馏水至 1000 ml, 调 ph 值至 7.4,121 高压灭菌 15min, 冷却至 50 倾注平板 (20 毫升 /90mm 平板, 琼脂厚度 4±0.5mm), 置 4 冰箱保存备用 TBE 电泳缓冲液的配制 5 TBE 贮存液 54 g Tris 碱 27.5 ml 硼酸 3.72 g Na 2EDTA.2H 2O 加 H 2O 至 1000 ml 稀释 10 倍为 0.5 工作液电泳备用 TE 缓冲液的配制 10mM Tris-Cl ph

18 1mM EDTA ph 8.0 表 2-1 Table 2-1 PCR 引物序列 预期产物长度及 PCR 反应条件 Primers and conditions of PCR in this study Gene PCR primers Expected PCR conditions PCR Reference size product IntI1F CCTCCCGCACGATGA 281bp 1 cycle of 5min at 94 ;35 cycle of IntI1 1 IntI1R TCCACGCATCGTCAG 45s at 94,45s at 64,1 min at 72 RB201 GCAAACGCAAGCATTCATTA 393bp 1 cycle of 5min at 94 ;35 cycle of IntI2 2 RB202 ACGGATATGCGACAAAAAGG 1min at 94,1min at 40,1 min at 72 RB317 AACCTTGACCGAACGCAG uncertain 35 cycle of 45s at 94,45s at 59,3 Variable 2 RB320 AGCTTAGTAAAGCCCTCGCTAG min at 72 region IntI3F GCAGGGTGTGGACGAATACG 760bp 1 cycle of 5 min at 94 ;35 cycle of IntI3 3 IntI3R ACAGACCGAGAAGGCTTATG 1min at 94,1 min at 40,1 min at 上样缓冲液的配制 溴酚兰 0.025mg 蔗糖 4g TE 缓冲液 (ph 8.0) 6ml 加 H 2O 至 10ml 混匀后使用 IPTG 母液的配制 称取 2 g IPTG(MW 238.3), 加少量蒸馏水, 溶解后定容至 10 ml, 超滤除菌, 分装成 1 ml 小份置 -20 保存 18

19 2.1.7 溴化乙锭 (EB) 贮存液的配制 用超纯水溶解 EB, 配成终浓度 10 mg/ml 的水溶液, 用铝箔包裹容器, 避光 保存于室温 X-gal 的配制 用二甲基甲酰胺溶解 X-gal, 配制成 20 mg/ml 的贮存液 避光贮存于 细菌复苏培养 将保存在甘油肉汤中的细菌接种到 LB 平板,35 过夜培养 [4] 2.3 E 试验 灭菌棉支挑取过夜培养的菌落, 用生理盐水中调制成 0.5 麦氏单位 ( CFU/ml) 的菌悬液, 均匀涂布于 MH 平板上, 然后在每个平皿上以放射状等距离放入 6 个药物试条,35 温孵,18 小时后读取 MIC 值 所测定抗生素包括头孢噻肟 头孢他啶 头孢曲松 头孢吡肟 亚胺培南 庆大霉素 阿米卡星 环丙沙星和四环素 质控菌株为大肠杆菌 ATCC DNA 提取 挑取 6 到 8 个菌落加入 500 µl TE 缓冲液中,100 水浴 10min, 随即冰浴 冷却,70000r/min 离心 (4 ) 10min, 取上清即为提取的 DNA 2.5 PCR 扩增 PCR 扩增引物及扩增条件见表 2-1,IntI1 基因阳性株进一步用 RB317 和 RB320 扩增 I 型整合子可变区 2.6 琼脂糖凝胶电泳及限制性酶切 19

20 制备 1% 琼脂糖凝胶, 每孔加入 PCR 产物 12 µl, 在 0.5 TBE 电泳缓冲液中 100 V 电泳 50min, 溴化乙锭染色成像 RB317 和 RB320 扩增的 PCR 产物分别被限制性内切酶 EcoRⅠ,HindⅢ 和 BspⅠ 酶切后电泳, 溴化乙锭染色成像 2.7 感受态细胞制备 取保存于甘油肉汤 (-30 ) 的大肠杆菌 JM109, 接种至 LB 平板过夜培养, 挑取单菌落转 2ml LB 肉汤过夜培养, 取 50µl 过夜培养肉汤加入 50ml LB 肉汤 300r/min 震荡培养 3 小时,4 离心 10 分钟, 去上清, 细菌沉淀经 0.1M 氯化钙悬浮后放置 10 分钟,4 2000r/min 离心 5 分钟, 加入 100µl 氯化钙重悬, 置冰上备用 2.8 PCR 产物纯化 选取片段大小和酶切图谱不同的 PCR 产物 (RB317 和 RB320 扩增 ) 各一, 加入 3 倍体积 Binding Buffer I, 混匀后转移到 UNIQ-10 柱中, 放置 2min 后离心去滤液, 加 500µl Wash Solution,8000r/min 离心 1min, 弃滤液, 重复一次, 12,000r/min 再离心 15s, 将 UNIQ-10 柱放入一新的 1.5mL 离心管中, 加 40µl 灭菌双蒸水,37 放置 2min;12,000r/min 离心 1min, 收集离心管内的液体, 保存于 -20 备用 2.9 PCR 产物与 T 载体的连接 根据上海生工有限公司 DNA 连接试剂盒进行连接,10 µl 反应体系 : 10 Ligation Buffer 1 µl PEG µl pmd18-t Vector 1 µl 纯化后 PCR 产物 3 µl Sterile ddh 2O 3 µl T4 DNA Ligase 1 µl 20

21 16 连接 2 h 2.10 转化 100 µl 感受态细胞中加入 5 µl 连接液, 轻轻混匀, 冰浴 30 min 42 水浴热激 60 s, 冰浴 2min 加入 400 µl LB 培养基,37,200r/min 振荡培养 1 h 室温下 4000r/min 离心 5 min, 用枪头吸掉 400 µl 上清液, 用剩余的培养基将细胞悬浮 将细菌涂布在预先用 20 µl 100 mmol/l IPTG 和 100 µl 20 mg/ml x-gal 涂布的氨苄西林平板上,37 培养过夜 2.11 阳性株筛选及测序 在平板上挑选白色菌落, 用菌落 PCR 对其进行筛选 ; 阳性菌株提取质粒, Sanger 双脱氧末端终止法进行双向测序, 对较长片断双向测序仍无法拼接出全序列者, 合成中间引物, 采用步移法完成全序列测序, 测序和拼接服务由广州英骏公司提供 2.12 测序结果分析 DNA 序列通过网上翻译工具翻译成氨基酸序列 ( /tools /dna.html), 得到的氨基酸序列与 GenBank 数据库中的氨基酸序列进行比对分析 ( 3. 结果 3.1 药敏实验 74 株肺炎克雷伯菌中, 大部分菌株对庆大霉素和阿米卡星呈高度耐药 (MIC>128µg/ml) 超过半数的菌株对广谱 β 内酰胺类抗生素耐药或敏感性下降 ( 即中介 ) 虽然大部分菌株均为多重耐药株 ( 即对两类或两类以上的抗生素耐 21

22 药 ), 但所有的菌株均对亚胺培南敏感 ( 见表 2-3) 3.2 IntI1,IntI2 和 IntI3 基因引物扩增结果 74 株产 ESBLs 肺炎克雷伯菌中, 69 株 IntI1 基因阳性,IntI2 和 IntI3 均阴性 3.3 RB317 和 RB320 引物扩增和限制性酶切结果 12 株 IntI1 基因阳性株未能扩增出产物, 其他阳性菌株及酶切结果见图 1 表 2-3 产 ESBLs 肺炎克雷伯菌药敏结果 Table 3 Antibiotic susceptibility of ESBLs-producing Klebsiella pneumoniae Antibiotic a S(%) I(%) R(%) Cefotaxime 33(44.6%) 30(40.6%) 11(14.9%) Ceftazidime 13(17.6%) 32(43.2%) 29(39.2%) Ceftriaxone 32(43.2%) 3(4.1%) 39(52.7%) Cefepime 52(70.3%) 10(13.5%) 12(16.2%) Imipenem 74(100%) 0(0%) 0(0%) Gentamicin 12(16.2%) 0(0%) 62(83.8%) Amikacin 19(25.7%) 0(0%) 55(74.3%) Ciprofloxacin 37(50%) 10(13.5%) 27(36.5%) Tetracycline 13(17.6%) 0(0%) 61(82.4%) a 缩写 : S, 敏感 ; I, 中介 ; R, 耐药 3.4 测序和氨基酸序列比对结果 菌株整合子可变区包含 11 种不同的基因盒组合, 共有 13 种不同的基因盒 氨基酸序列比对结果如下 : I aada1 22

23 gb AAA streptomycin/spectinomycin adenyltransferase (aada1) Score = 503 bits (1294), Expect = 5e-141, Method: Composition-based stats. Identities = 259/263 (98%), Positives = 260/263 (98%), Gaps = 0/263 (0%) Query 1 MREAVIAEVSTQLSEVVGVIERHLEPTLLAVHLYGSAVDGGLKPHSDIDLLVTVTVRLDE 60 MREAVIAEVSTQLSEVVGVIERHLEPTLLAVHLYGSAVDGGLKPHSDIDLLVTVTVRLDE Sbjct 74 MREAVIAEVSTQLSEVVGVIERHLEPTLLAVHLYGSAVDGGLKPHSDIDLLVTVTVRLDE 133 Query 61 TTRRALINDLLETSASPGESEILRAVEVTIVVHDDIIPWRYPAKRELQFGEWQRNDILAG 120 TTRRALINDLLETSASPGESEILRAVEVTIVVHDDIIPWRYPAKRELQFGEWQRNDILAG Sbjct 134 TTRRALINDLLETSASPGESEILRAVEVTIVVHDDIIPWRYPAKRELQFGEWQRNDILAG 193 Query 121 VFEPATIDIDLAILLTNAREHSVALVGPAAEELFDPVPEQDLFEALNETLTLWNSPPDWA 180 +FEPATIDIDLAILLT AREHSVALVGPAAEELFDPVPEQDLFEALNETLTLWNSPPDWA Sbjct 194 IFEPATIDIDLAILLTKAREHSVALVGPAAEELFDPVPEQDLFEALNETLTLWNSPPDWA 253 Query 181 GDERNVVLTLSRIWYSAVTGKIAPKDVAADWAMERLPAQYQPVTLEARQAYLGQEEGRLA 240 GDERNVVLTLSRIWYSAVTGKIAPKDVAADWAMERLPAQYQPV LEARQAYLGQEE RLA Sbjct 254 GDERNVVLTLSRIWYSAVTGKIAPKDVAADWAMERLPAQYQPVILEARQAYLGQEEDRLA 313 Query 241 SRADQLEEFVHYVKGEITKVVGK 263 SRADQLEEFVHYVKGEITKVVGK Sbjct 314 SRADQLEEFVHYVKGEITKVVGK 336 II dfra12-aada2 gb AAG AF284063_2 dihydrofolate reductase type XII (dfra12) Score = 325 bits (832), Expect = 7e-88, Method: Composition-based stats. 23

24 Identities = 165/165 (100%), Positives = 165/165 (100%), Gaps = 0/165 (0%) Query 1 MNSESVRIYLVAAMGANRVIGNGPNIPWKIPGEQKIFRRLTEGKVVVMGRKTFESIGKPL 60 MNSESVRIYLVAAMGANRVIGNGPNIPWKIPGEQKIFRRLTEGKVVVMGRKTFESIGKPL Sbjct 1 MNSESVRIYLVAAMGANRVIGNGPNIPWKIPGEQKIFRRLTEGKVVVMGRKTFESIGKPL 60 Query 61 PNRHTLVISRQANYRATGCVVVSTLSHAIALASELGNELYVAGGAEIYTLALPHAHGVFL 120 PNRHTLVISRQANYRATGCVVVSTLSHAIALASELGNELYVAGGAEIYTLALPHAHGVFL Sbjct 61 PNRHTLVISRQANYRATGCVVVSTLSHAIALASELGNELYVAGGAEIYTLALPHAHGVFL 120 Query 121 SEVHQTFEGDAFFPMLNETEFELVSTETIQAVIPYTHSVYARRNG 165 SEVHQTFEGDAFFPMLNETEFELVSTETIQAVIPYTHSVYARRNG Sbjct 121 SEVHQTFEGDAFFPMLNETEFELVSTETIQAVIPYTHSVYARRNG 165 gb ABO aminoglycoside adenylyltransferase (aada2) Score = 509 bits (1312), Expect = 4e-143, Method: Composition-based stats. Identities = 261/263 (99%), Positives = 261/263 (99%), Gaps = 0/263 (0%) Query 1 MREAVTIEISNQLSEVLSVIERHLESTLLAVHLYGSAVDGGLKPYSDIDLLVTVAVKLDE 60 MR AVTIEISNQLSEVLSVIERHLESTLLAVHLYGSAVDGGLKPYSDIDLLVTVAVKLDE Sbjct 74 MRVAVTIEISNQLSEVLSVIERHLESTLLAVHLYGSAVDGGLKPYSDIDLLVTVAVKLDE 133 Query 61 TTRRALLNDLMEASAFPGESETLRAIEVTLVVHDDIIPWRYPAKRELQFGEWQRNDILAG 120 TTRRALLNDLMEASAFPGESETLRAIEVTLVVHDDIIPWRYPAKRELQFGEWQRNDILAG Sbjct 134 TTRRALLNDLMEASAFPGESETLRAIEVTLVVHDDIIPWRYPAKRELQFGEWQRNDILAG 193 Query 121 IFEPAMIDIDLAILLTKAREHSVALVGPAAEESFDPVPEQDLFEALRETLKLWNSQPDWA 180 IFEPAMIDIDLAILLTKAREHSVALVGPAAEE FDPVPEQDLFEALRETLKLWNSQPDWA Sbjct 194 IFEPAMIDIDLAILLTKAREHSVALVGPAAEEFFDPVPEQDLFEALRETLKLWNSQPDWA

25 Query 181 GDERNVVLTLSRIWYSAITGKIAPKDVAADWAIKRLPAQYQPVLLEAKQAYLGQKEDHLA 240 GDERNVVLTLSRIWYSAITGKIAPKDVAADWAIKRLPAQYQPVLLEAKQAYLGQKEDHLA Sbjct 254 GDERNVVLTLSRIWYSAITGKIAPKDVAADWAIKRLPAQYQPVLLEAKQAYLGQKEDHLA 313 Query 241 SRADHLEEFIRFVKGEIIKSVGK 263 SRADHLEEFIRFVKGEIIKSVGK Sbjct 314 SRADHLEEFIRFVKGEIIKSVGK 336 III dfr17-aada4 gb AAF AF220757_1 dihydrofolate reductase 17(dfr17) Score = 303 bits (776), Expect = 2e-81, Method: Composition-based stats. Identities = 157/157 (100%), Positives = 157/157 (100%), Gaps = 0/157 (0%) Query 1 MKISLISAVSENGVIGSGPDIPWSVKGEQLLFKALTYNQWLLVGRKTFDSMGVLPNRKYA 60 MKISLISAVSENGVIGSGPDIPWSVKGEQLLFKALTYNQWLLVGRKTFDSMGVLPNRKYA Sbjct 1 MKISLISAVSENGVIGSGPDIPWSVKGEQLLFKALTYNQWLLVGRKTFDSMGVLPNRKYA 60 Query 61 VVSKNGISSSNENVLVFPSIENALKELSKVTDHVYVSGGGQIYNSLIEKADIIHLSTVHV 120 VVSKNGISSSNENVLVFPSIENALKELSKVTDHVYVSGGGQIYNSLIEKADIIHLSTVHV Sbjct 61 VVSKNGISSSNENVLVFPSIENALKELSKVTDHVYVSGGGQIYNSLIEKADIIHLSTVHV 120 Query 121 EVEGDIKFPIMPENFNLVFEQFFMSNINYTYQIWKKG 157 EVEGDIKFPIMPENFNLVFEQFFMSNINYTYQIWKKG Sbjct 121 EVEGDIKFPIMPENFNLVFEQFFMSNINYTYQIWKKG

26 gb AAF AF220757_2 aminoglycoside-3'-adenylyltransferase (aada4) Score = 502 bits (1293), Expect = 6e-141, Method: Composition-based stats. Identities = 262/262 (100%), Positives = 262/262 (100%), Gaps = 0/262 (0%) Query 1 MGEFFPAQVFKQLSHARAVIERHLAATLDTIHLFGSAIDGGLKPDSDIDLLVTVSAAPND 60 MGEFFPAQVFKQLSHARAVIERHLAATLDTIHLFGSAIDGGLKPDSDIDLLVTVSAAPND Sbjct 1 MGEFFPAQVFKQLSHARAVIERHLAATLDTIHLFGSAIDGGLKPDSDIDLLVTVSAAPND 60 Query 61 SLRQALMLDLLKVSSPPGDGGTWRPLELTVVARSEVVPWRYPARRELQFGEWLRHDILSG 120 SLRQALMLDLLKVSSPPGDGGTWRPLELTVVARSEVVPWRYPARRELQFGEWLRHDILSG Sbjct 61 SLRQALMLDLLKVSSPPGDGGTWRPLELTVVARSEVVPWRYPARRELQFGEWLRHDILSG 120 Query 121 TFEPAVLDHDLAILLTKARQHSLALLGPSAATFFEPVPKEHFSKALFDTIAQWNAESDWK 180 TFEPAVLDHDLAILLTKARQHSLALLGPSAATFFEPVPKEHFSKALFDTIAQWNAESDWK Sbjct 121 TFEPAVLDHDLAILLTKARQHSLALLGPSAATFFEPVPKEHFSKALFDTIAQWNAESDWK 180 Query 181 GDERNVVLALARIWYSASTGLIAPKDVAAAWVSERLPAEHRPLICKARAAYLGSEDDDLA 240 GDERNVVLALARIWYSASTGLIAPKDVAAAWVSERLPAEHRPLICKARAAYLGSEDDDLA Sbjct 181 GDERNVVLALARIWYSASTGLIAPKDVAAAWVSERLPAEHRPLICKARAAYLGSEDDDLA 240 Query 241 MRVEETAAFVRYAKATIERILR 262 MRVEETAAFVRYAKATIERILR Sbjct 241 MRVEETAAFVRYAKATIERILR 262 IV dfr17-aada5 gb AAF AF220757_1 dihydrofolate reductase 17 (dfr17) 26

27 Score = 303 bits (776), Expect = 2e-81, Method: Composition-based stats. Identities = 157/157 (100%), Positives = 157/157 (100%), Gaps = 0/157 (0%) Query 1 MKISLISAVSENGVIGSGPDIPWSVKGEQLLFKALTYNQWLLVGRKTFDSMGVLPNRKYA 60 MKISLISAVSENGVIGSGPDIPWSVKGEQLLFKALTYNQWLLVGRKTFDSMGVLPNRKYA Sbjct 1 MKISLISAVSENGVIGSGPDIPWSVKGEQLLFKALTYNQWLLVGRKTFDSMGVLPNRKYA 60 Query 61 VVSKNGISSSNENVLVFPSIENALKELSKVTDHVYVSGGGQIYNSLIEKADIIHLSTVHV 120 VVSKNGISSSNENVLVFPSIENALKELSKVTDHVYVSGGGQIYNSLIEKADIIHLSTVHV Sbjct 61 VVSKNGISSSNENVLVFPSIENALKELSKVTDHVYVSGGGQIYNSLIEKADIIHLSTVHV 120 Query 121 EVEGDIKFPIMPENFNLVFEQFFMSNINYTYQIWKKG 157 EVEGDIKFPIMPENFNLVFEQFFMSNINYTYQIWKKG Sbjct 121 EVEGDIKFPIMPENFNLVFEQFFMSNINYTYQIWKKG 157 gb ABK aminoglycoside-3'-adenylyltransferase (aada5) Score = 403 bits (1035), Expect = 4e-111, Method: Composition-based stats. Identities = 211/213 (99%), Positives = 212/213 (99%), Gaps = 0/213 (0%) Query 1 MLVTVSAAPNDSLRQALMLDLLKVSSPPGDGGTWRPLELTVVARSEVVPWRYPARRELQF 60 +LVTVSAAPNDSLRQALMLDLLKVSSPPGDGGTWRPLELTVVARSEVVPWRYPARRELQF Sbjct 50 LLVTVSAAPNDSLRQALMLDLLKVSSPPGDGGTWRPLELTVVARSEVVPWRYPARRELQF 109 Query 61 GEWLRHDILSGTFEPAVLDHDLAILLTKARQHSLALLGPSAATFFEPVPKEHFSKAPFDT 120 GEWLRHDILSGTFEPAVLDHDLAILLTKARQHSLALLGPSAATFFEPVPKEHFSKA FDT Sbjct 110 GEWLRHDILSGTFEPAVLDHDLAILLTKARQHSLALLGPSAATFFEPVPKEHFSKALFDT 169 Query 121 IAQWNAESDWKGDERNVVLALARIWYSASTGLIAPKDVAAAWVSERLPAEHRPLICKARA 180 IAQWNAESDWKGDERNVVLALARIWYSASTGLIAPKDVAAAWVSERLPAEHRPLICKARA 27

28 Sbjct 170 IAQWNAESDWKGDERNVVLALARIWYSASTGLIAPKDVAAAWVSERLPAEHRPLICKARA 229 Query 181 AYLGSEDDDLAMRVEETAAFVRYAKATIERILR 213 AYLGSEDDDLAMRVEETAAFVRYAKATIERILR Sbjct 230 AYLGSEDDDLAMRVEETAAFVRYAKATIERILR 262 V orfd-aaca4 gb AAK unknown (orfd) Score = 129 bits (323), Expect = 6e-29, Method: Composition-based stats. Identities = 81/96 (84%), Positives = 85/96 (88%), Gaps = 0/96 (0%) Query 1 MLIQTAFSFSSVVQRLVCRLSGLRLLALHWFLVFLASGPCVANASSYRFCSAVPPRWRRA 60 M IQTAFSFS+ VQR VCR SGLRL+AL WF+VFLASGPCVA+ASSY F SAVPPRW RA Sbjct 9 MFIQTAFSFSNAVQRWVCRFSGLRLVALRWFVVFLASGPCVASASSYFFRSAVPPRWHRA 68 Query 61 FSQLVPVTKSRLSVLASGSNISVKPTRILRSAYLAR 96 FSQL PV K RLSVLASGSNISVKPTRILRSAYLAR Sbjct 69 FSQLAPVAKLRLSVLASGSNISVKPTRILRSAYLAR 104 emb CAL aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase (aaca4) Score = 362 bits (928), Expect = 8e-99, Method: Composition-based stats. Identities = 183/184 (99%), Positives = 184/184 (100%), Gaps = 0/184 (0%) Query 1 MTNSNDSVTLRLMTEHDLAMLYEWLNRSHIVEWWGGEEARPTLADVQEQYLPSVLAQESV 60 MTNSNDSVTLRLMTEHDLAMLYEWLNRSHIVEWWGGEEARPTLADVQEQYLPSVLAQESV Sbjct 1 MTNSNDSVTLRLMTEHDLAMLYEWLNRSHIVEWWGGEEARPTLADVQEQYLPSVLAQESV 60 28

29 Query 61 TPYIAMLNGEPIGYAQSYVALGSGDGWWEEETDPGVRGIDQSLANASQLGKGLGTKLVRA 120 TPYIAMLNGEPIGYAQSYVALGSGDGWWEEETDPGVRGIDQSLANASQLGKGLGTKLVRA Sbjct 61 TPYIAMLNGEPIGYAQSYVALGSGDGWWEEETDPGVRGIDQSLANASQLGKGLGTKLVRA 120 Query 121 LVELLFNDPEVTKIQTDPSPSNLRAIRCYEKAGFEKQGTVTTPDGPAVYMVQTRQAFERT 180 LVELLFNDPEVTKIQTDPSPSNLRAIRCYEKAGFE+QGTVTTPDGPAVYMVQTRQAFERT Sbjct 121 LVELLFNDPEVTKIQTDPSPSNLRAIRCYEKAGFERQGTVTTPDGPAVYMVQTRQAFERT 180 Query 181 RSDA 184 RSDA Sbjct 181 RSDA 184 VI arr3-aaca4 gb AAZ rifampin ADP-ribosylating transferase (arr3) Score = 315 bits (806), Expect = 6e-85, Method: Composition-based stats. Identities = 149/150 (99%), Positives = 150/150 (100%), Gaps = 0/150 (0%) Query 1 MVKDWIPISHDNYKQVQGPFYHGTKANLAIGDLLTTGFISHFEDGRILKHIYFSALMEPA 60 MVKDWIPISHDNYKQVQGPFYHGTKANLAIGDLLTTGFISHFEDGRILKHIYFSALMEPA Sbjct 1 MVKDWIPISHDNYKQVQGPFYHGTKANLAIGDLLTTGFISHFEDGRILKHIYFSALMEPA 60 Query 61 VWGAELAMSLSGLEGRGYIYIVEPTGPFEDDPNLTNKRFPGNPTQSYRTCEPLRIVGVVE 120 VWGAELAMSLSGLEGRGYIYIVEPTGPFEDDPNLTNKRFPGNPTQSYRTCEPLRIVGVVE Sbjct 61 VWGAELAMSLSGLEGRGYIYIVEPTGPFEDDPNLTNKRFPGNPTQSYRTCEPLRIVGVVE 120 Query 121 DWEGHPVELIRGMLDSLEDLKRRGLHVVED 150 DWEGHPVELIRGMLDSLEDLKRRGLHV+ED 29

30 Sbjct 121 DWEGHPVELIRGMLDSLEDLKRRGLHVIED 150 emb CAL aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase (aaca4) Score = 362 bits (929), Expect = 5e-99, Method: Composition-based stats. Identities = 184/184 (100%), Positives = 184/184 (100%), Gaps = 0/184 (0%) Query 1 MTNSNDSVTLRLMTEHDLAMLYEWLNRSHIVEWWGGEEARPTLADVQEQYLPSVLAQESV 60 MTNSNDSVTLRLMTEHDLAMLYEWLNRSHIVEWWGGEEARPTLADVQEQYLPSVLAQESV Sbjct 1 MTNSNDSVTLRLMTEHDLAMLYEWLNRSHIVEWWGGEEARPTLADVQEQYLPSVLAQESV 60 Query 61 TPYIAMLNGEPIGYAQSYVALGSGDGWWEEETDPGVRGIDQSLANASQLGKGLGTKLVRA 120 TPYIAMLNGEPIGYAQSYVALGSGDGWWEEETDPGVRGIDQSLANASQLGKGLGTKLVRA Sbjct 61 TPYIAMLNGEPIGYAQSYVALGSGDGWWEEETDPGVRGIDQSLANASQLGKGLGTKLVRA 120 Query 121 LVELLFNDPEVTKIQTDPSPSNLRAIRCYEKAGFERQGTVTTPDGPAVYMVQTRQAFERT 180 LVELLFNDPEVTKIQTDPSPSNLRAIRCYEKAGFERQGTVTTPDGPAVYMVQTRQAFERT Sbjct 121 LVELLFNDPEVTKIQTDPSPSNLRAIRCYEKAGFERQGTVTTPDGPAVYMVQTRQAFERT 180 Query 181 RSDA 184 RSDA Sbjct 181 RSDA 184 VII dfra12-orff-aada2 dbj BAD dihydrofolate reductase type XII (dfra12) Score = 325 bits (832), Expect = 7e-88, Method: Composition-based stats. Identities = 165/165 (100%), Positives = 165/165 (100%), Gaps = 0/165 (0%) 30

31 Query 1 MNSESVRIYLVAAMGANRVIGNGPNIPWKIPGEQKIFRRLTEGKVVVMGRKTFESIGKPL 60 MNSESVRIYLVAAMGANRVIGNGPNIPWKIPGEQKIFRRLTEGKVVVMGRKTFESIGKPL Sbjct 1 MNSESVRIYLVAAMGANRVIGNGPNIPWKIPGEQKIFRRLTEGKVVVMGRKTFESIGKPL 60 Query 61 PNRHTLVISRQANYRATGCVVVSTLSHAIALASELGNELYVAGGAEIYTLALPHAHGVFL 120 PNRHTLVISRQANYRATGCVVVSTLSHAIALASELGNELYVAGGAEIYTLALPHAHGVFL Sbjct 61 PNRHTLVISRQANYRATGCVVVSTLSHAIALASELGNELYVAGGAEIYTLALPHAHGVFL 120 Query 121 SEVHQTFEGDAFFPMLNETEFELVSTETIQAVIPYTHSVYARRNG 165 SEVHQTFEGDAFFPMLNETEFELVSTETIQAVIPYTHSVYARRNG Sbjct 121 SEVHQTFEGDAFFPMLNETEFELVSTETIQAVIPYTHSVYARRNG 165 emb CAA unknown (orff) Score = 153 bits (386), Expect = 3e-36, Method: Composition-based stats. Identities = 90/90 (100%), Positives = 90/90 (100%), Gaps = 0/90 (0%) Query 1 MFIQTAFSFSGVIQCLFCLFSGLRLHGLRRFSVFLASSPCVASASSYRFCSAVPPRWRSV 60 MFIQTAFSFSGVIQCLFCLFSGLRLHGLRRFSVFLASSPCVASASSYRFCSAVPPRWRSV Sbjct 1 MFIQTAFSFSGVIQCLFCLFSGLRLHGLRRFSVFLASSPCVASASSYRFCSAVPPRWRSV 60 Query 61 FSRLAPVAKFKLSVLASGSNISVKPTRILR 90 FSRLAPVAKFKLSVLASGSNISVKPTRILR Sbjct 61 FSRLAPVAKFKLSVLASGSNISVKPTRILR 90 ref YP_ streptomycin/spectinomycin 3' adenyl transferase (aada2) Score = 503 bits (1294), Expect = 6e-141, Method: Composition-based stats. Identities = 263/263 (100%), Positives = 263/263 (100%), Gaps = 0/263 (0%) 31

32 Query 1 MREAVTIEISNQLSEVLSVIERHLESTLLAVHLYGSAVDGGLKPYSDIDLLVTVAVKLDE 60 MREAVTIEISNQLSEVLSVIERHLESTLLAVHLYGSAVDGGLKPYSDIDLLVTVAVKLDE Sbjct 1 MREAVTIEISNQLSEVLSVIERHLESTLLAVHLYGSAVDGGLKPYSDIDLLVTVAVKLDE 60 Query 61 TTRRALLNDLMEASAFPGESETLRAIEVTLVVHDDIIPWRYPAKRELQFGEWQRNDILAG 120 TTRRALLNDLMEASAFPGESETLRAIEVTLVVHDDIIPWRYPAKRELQFGEWQRNDILAG Sbjct 61 TTRRALLNDLMEASAFPGESETLRAIEVTLVVHDDIIPWRYPAKRELQFGEWQRNDILAG 120 Query 121 IFEPAMIDIDLAILLTKAREHSVALVGPAAEEFFDPVPEQDLFEALRETLKLWNSQPDWA 180 IFEPAMIDIDLAILLTKAREHSVALVGPAAEEFFDPVPEQDLFEALRETLKLWNSQPDWA Sbjct 121 IFEPAMIDIDLAILLTKAREHSVALVGPAAEEFFDPVPEQDLFEALRETLKLWNSQPDWA 180 Query 181 GDERNVVLTLSRIWYSAITGKIAPKDVAADWAIKRLPAQYQPVLLEAKQAYLGQKEDHLA 240 GDERNVVLTLSRIWYSAITGKIAPKDVAADWAIKRLPAQYQPVLLEAKQAYLGQKEDHLA Sbjct 181 GDERNVVLTLSRIWYSAITGKIAPKDVAADWAIKRLPAQYQPVLLEAKQAYLGQKEDHLA 240 Query 241 SRADHLEEFIRFVKGEIIKSVGK 263 SRADHLEEFIRFVKGEIIKSVGK Sbjct 241 SRADHLEEFIRFVKGEIIKSVGK 263 VIII drfa25 gb ABB dihydrofolate reductase drfa25 Score = 320 bits (820), Expect = 2e-86, Method: Composition-based stats. Identities = 152/152 (100%), Positives = 152/152 (100%), Gaps = 0/152 (0%) Query 6 MAARAKNGVIGCGPDIPWSAKGEQLLFKALTYNQWLLVGRKTFESMGPLPNRKYAVVTRS 65 MAARAKNGVIGCGPDIPWSAKGEQLLFKALTYNQWLLVGRKTFESMGPLPNRKYAVVTRS 32

33 Sbjct 1 MAARAKNGVIGCGPDIPWSAKGEQLLFKALTYNQWLLVGRKTFESMGPLPNRKYAVVTRS 60 Query 66 NWTAANENVVVFPSIDEAMGRLGEITDHVIVAGGGEIYHETIPMASTLHVSTIDVEPEGD 125 NWTAANENVVVFPSIDEAMGRLGEITDHVIVAGGGEIYHETIPMASTLHVSTIDVEPEGD Sbjct 61 NWTAANENVVVFPSIDEAMGRLGEITDHVIVAGGGEIYHETIPMASTLHVSTIDVEPEGD 120 Query 126 VFFPNIPGKFDVVFEQQFTSNINYCYQIWQKG 157 VFFPNIPGKFDVVFEQQFTSNINYCYQIWQKG Sbjct 121 VFFPNIPGKFDVVFEQQFTSNINYCYQIWQKG 152 IX aada2 ref YP_ streptomycin/spectinomycin 3' adenyl transferase (aada2) Score = 503 bits (1294), Expect = 6e-141, Method: Composition-based stats. Identities = 263/263 (100%), Positives = 263/263 (100%), Gaps = 0/263 (0%) Query 1 MREAVTIEISNQLSEVLSVIERHLESTLLAVHLYGSAVDGGLKPYSDIDLLVTVAVKLDE 60 MREAVTIEISNQLSEVLSVIERHLESTLLAVHLYGSAVDGGLKPYSDIDLLVTVAVKLDE Sbjct 1 MREAVTIEISNQLSEVLSVIERHLESTLLAVHLYGSAVDGGLKPYSDIDLLVTVAVKLDE 60 Query 61 TTRRALLNDLMEASAFPGESETLRAIEVTLVVHDDIIPWRYPAKRELQFGEWQRNDILAG 120 TTRRALLNDLMEASAFPGESETLRAIEVTLVVHDDIIPWRYPAKRELQFGEWQRNDILAG Sbjct 61 TTRRALLNDLMEASAFPGESETLRAIEVTLVVHDDIIPWRYPAKRELQFGEWQRNDILAG 120 Query 121 IFEPAMIDIDLAILLTKAREHSVALVGPAAEEFFDPVPEQDLFEALRETLKLWNSQPDWA 180 IFEPAMIDIDLAILLTKAREHSVALVGPAAEEFFDPVPEQDLFEALRETLKLWNSQPDWA Sbjct 121 IFEPAMIDIDLAILLTKAREHSVALVGPAAEEFFDPVPEQDLFEALRETLKLWNSQPDWA

34 Query 181 GDERNVVLTLSRIWYSAITGKIAPKDVAADWAIKRLPAQYQPVLLEAKQAYLGQKEDHLA 240 GDERNVVLTLSRIWYSAITGKIAPKDVAADWAIKRLPAQYQPVLLEAKQAYLGQKEDHLA Sbjct 181 GDERNVVLTLSRIWYSAITGKIAPKDVAADWAIKRLPAQYQPVLLEAKQAYLGQKEDHLA 240 Query 241 SRADHLEEFIRFVKGEIIKSVGK 263 SRADHLEEFIRFVKGEIIKSVGK Sbjct 241 SRADHLEEFIRFVKGEIIKSVGK 263 X aaca4-cmla variant gb AAR aminoglycoside 6-N-acetyltransferase (aaca4) Score = 367 bits (943), Expect = 1e-100, Method: Composition-based stats. Identities = 182/184 (98%), Positives = 184/184 (100%), Gaps = 0/184 (0%) Query 1 MTNSNDSVTLRLMTEHDLAMLYEWLNRSHIVEWWGGEEARPTLADVQEQYLPSVLAQESV 60 +TNSNDSVTLRLMTEHDLAMLYEWLNRSHIVEWWGGEEARPTLADVQEQYLPSVLAQESV Sbjct 92 VTNSNDSVTLRLMTEHDLAMLYEWLNRSHIVEWWGGEEARPTLADVQEQYLPSVLAQESV 151 Query 61 TPYIAMLNGEPIGYAQSHVALGSGDGWWEEETDPGVRGIDQLLANASQLGKGLGTKLVRA 120 TPYIAMLNGEPIGYAQS+VALGSGDGWWEEETDPGVRGIDQLLANASQLGKGLGTKLVRA Sbjct 152 TPYIAMLNGEPIGYAQSYVALGSGDGWWEEETDPGVRGIDQLLANASQLGKGLGTKLVRA 211 Query 121 LVELLFNDPEVTKIQTDPSPSNLRAIRCYEKAGFERQGTVTTPDGPAVYMVQTRQAFERT 180 LVELLFNDPEVTKIQTDPSPSNLRAIRCYEKAGFERQGTVTTPDGPAVYMVQTRQAFERT Sbjct 212 LVELLFNDPEVTKIQTDPSPSNLRAIRCYEKAGFERQGTVTTPDGPAVYMVQTRQAFERT 271 Query 181 RSDA 184 RSDA Sbjct 272 RSDA

35 gb AAO AF458080_3 chloramphenicol resistance protein (cmla variant) Score = 457 bits (1175), Expect = 3e-127, Method: Composition-based stats. Identities = 261/265 (98%), Positives = 262/265 (98%), Gaps = 2/265 (0%) Query 1 MLGALVDMWLGWRAIFAFLGLGMIAASAAAWRFWPETRVQRVAGLQWSQLLLPVKCLNFW 60 +LGALVDMWLGWRAIFAFLGLGMIAASAAAWRFWPETRVQRVAGLQWSQLLLPVKCLNFW Sbjct 157 LLGALVDMWLGWRAIFAFLGLGMIAASAAAWRFWPETRVQRVAGLQWSQLLLPVKCLNFW 216 Query 61 LYTLCYAAGMGSFFVFFSIAPGLMMGRQGVSQLGFSLLFATVAIAMVFTARFMGRVIPKW 120 LYTLCYAAGMGSFFVFFSIAPGLMMGRQGVSQLGFSLLFATVAIAMVFTARFMGRVIPKW Sbjct 217 LYTLCYAAGMGSFFVFFSIAPGLMMGRQGVSQLGFSLLFATVAIAMVFTARFMGRVIPKW 276 Query 121 GSPSVLRMETGMGCLIAGAVLLAITEIWASQSVLGFISPMWLVGIGVATAVSVAPNGALR 180 GSPSVLRM GMGCLIAGAVLLAITEIWASQSVLGFISPMWLVGIGVATAVSVAPNGALR Sbjct 277 GSPSVLRM--GMGCLIAGAVLLAITEIWASQSVLGFISPMWLVGIGVATAVSVAPNGALR 334 Query 181 GFDHVAGTVTAVYFCLGGVLLGSIGTLIISPLPRNTAWPVVVYCLTLATVVLGLSCVSRA 240 GFDHVAGTVTAVYFCLGGVLLGSIGTLIIS LPRNTAWPVVVYCLTLATVVLGLSCVSRA Sbjct 335 GFDHVAGTVTAVYFCLGGVLLGSIGTLIISLLPRNTAWPVVVYCLTLATVVLGLSCVSRA 394 Query 241 EGSRGQGEHDVVALQSAESTSNPNR 265 EGSRGQGEHDVVALQSAESTSNPNR Sbjct 395 EGSRGQGEHDVVALQSAESTSNPNR 419 XI dhfrv sp P11731 DYR5_ECOLI Dihydrofolate reductase type V (dhfrv) 35

36 Score = 320 bits (820), Expect = 1e-86, Method: Composition-based stats. Identities = 152/152 (100%), Positives = 152/152 (100%), Gaps = 0/152 (0%) Query 1 MAAKAKNGVIGCGPHIPWSAKGEQLLFKALTYNQWLLVGRKTFESMGALPNRKYAVVTRS 60 MAAKAKNGVIGCGPHIPWSAKGEQLLFKALTYNQWLLVGRKTFESMGALPNRKYAVVTRS Sbjct 6 MAAKAKNGVIGCGPHIPWSAKGEQLLFKALTYNQWLLVGRKTFESMGALPNRKYAVVTRS 65 Query 61 AWTADNDNVIVFPSIEEAMYGLAELTDHVIVSGGGEIYRETLPMASTLHISTIDIEPEGD 120 AWTADNDNVIVFPSIEEAMYGLAELTDHVIVSGGGEIYRETLPMASTLHISTIDIEPEGD Sbjct 66 AWTADNDNVIVFPSIEEAMYGLAELTDHVIVSGGGEIYRETLPMASTLHISTIDIEPEGD 125 Query 121 VFFPNIPNTFEVVFEQHFSSNINYCYQIWQKG 152 VFFPNIPNTFEVVFEQHFSSNINYCYQIWQKG Sbjct 126 VFFPNIPNTFEVVFEQHFSSNINYCYQIWQKG 不同耐药谱菌株整合子携带基因盒情况 根据菌株的耐药谱的不同可以将 74 株产 ESBLs 肺炎克雷伯分为 18 组, 不同 组菌株所携带基因盒情况见表 2-4 表 2-4 不同耐药谱菌株整合子所包含基因盒 Table 4 ESBLs and various cassettes arrays in isolates of different resistance phenotypes Resistance Resistance profile a Number of Gene cassettes phenotypes isolates I CTX/CAZ/CRO, CFP, GEN/AMK, CIP, TTC 5 dfra12-orff-aada2 1 orfd-aaca4 1 orfd-aaca4 36

37 1 dfr17- aada5 2 dfr17- aada4 1 drfa25 1 dfra12-aada2 1 none II CTX/CAZ/CRO,GEN/AMK, TTC 5 dfra12-orff-aada2 1 drfa25 1 aada1 1 orfd-aaca4 1 none 1 dfr17- aada4 2 none 1 none 1 dfr17- aada5 1 aada2 III CTX/CAZ/CRO, CFP, TTC 1 none IV CTX/CAZ/CRO,CIP 1 none V CTX/CAZ/CRO 1 arr3-aaca4 VI CTX/CAZ/CRO,GEN/AMK 2 dfra12-orff-aada2 1 none 1 drfa25 VII CTX/CAZ/CRO, CIP,TTC 1 arr3-aaca4 1 none VIII CTX/CAZ/CRO, CFP 1 dfra12-orff-aada2 IX CTX/CAZ/CRO,CEP,GEN/AMK 2 dfra12-orff-aada2 X CTX/CAZ/CRO, TTC 2 none 1 none 1 aada1 1 aaca4-cmla variant 37

38 XI CIP 1 dfr17- aada4/aada5 XII GEN/AMK, TTC 1 dfra12-orff-aada2 XIII CTX/CAZ/CRO,CFP, GEN/AMK, CIP 1 dfra12-orff-aada2 XIV TTC 1 dfra12-orff-aada2 XV CTX/CAZ/CRO, GEN/AMK, CIP,TTC 3 dfr17- aada4/aada5 8 dfra12-orff-aada2 1 aada2 1 orfd-aaca4 1 dhfrv 2 none 1 none 1 dfra12-aada2 XVI GEN/AMK, CIP,TTC 2 dfra12-orff-aada2 XVII GEN/AMK 1 dfra12-orff-aada2 XVIII CTX/CAZ/CRO, CFP, GEN/AMK, TTC 1 dfra12-aada2 2 none 1 aada1 a CTX,cefotaxime; CAZ,ceftazidime; CRO,ceftriaxone; CFP,cefepime; GEN, gentamicin;amk,amikacin;cip, ciprofloxacin;ttc,tetracycline 38

39 A 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp B I II III IV V VI VII VIII IX X XI M 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp I II III IV V VI VII VIII IX X XI M C 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp I II I II IV V VI VII VIII IX X XI M D 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp I II III IV V VI VII VIII IX X XI M 图 2-1 PCR 扩增结果及酶切图谱 (A) 整合子可变区 PCR 扩增结果 (B) 整合子可变区 EcoRⅠ 酶切图谱 (C) 整合子可变区 HindⅢ 酶切图谱 (D) 整合子可变区 BspⅠ 酶切图谱 Figure 2-1 PCR and restriction profiles of variable region of integron (A) PCR results of eleven groups of variable segments of integron (B) EcoRⅠ restriction profiles of variable region of integron (C) HindⅢ restriction profiles of variable region of integron (D) BspⅠrestriction profiles of variable region of integron 39

40 4. 讨论 β- 内酰胺类抗生素是目前临床上使用频率最高的一类抗生素, 它具有抗菌 作用强 耐青霉素酶 临床疗效高 毒性低等优点, 然而, 这类抗生素的大规模 使用甚至滥用导致细菌对这类抗生素耐药性的大量产生 [5] 临床常见致病菌, 尤 其是革兰阴性杆菌, 对 β- 内酰胺类抗生素耐药的主要原因是 β- 内酰胺酶尤其 是超广谱 β- 内酰胺酶 (ESBLs) 的产生 肺炎克雷伯菌是目前主要的院内感染 菌之一, 目前国内许多地区均存在产 ESBLs 肺炎克雷伯菌的感染流行 [6-7] 从药 敏结果可以看出, 对产 ESBLs 的肺炎克雷伯菌, 相对于第三代头孢菌素类抗生素 如头孢噻肟 头孢曲松 头孢他啶而言, 亚胺培南和第四代头孢菌素头孢吡肟仍 然保持了较强的体外抗菌活性 耐药基因在细菌间的传播是治疗感染性疾病的一个棘手问题, 其传播方式包 括垂直传播和水平传播 耐药基因的水平传播主要由可接合质粒 转座子 整合 子等可移动的基因元件介导 整合子是一种天然的克隆和表达元件, 并已成为耐 药基因水平传播的重要方式 [8] 目前至少已经发现 32 种不同的整合酶基因 [9], 其 中与细菌耐药性密切相关的主要是 1 型 II 型和 III 型整合子, 在临床分离菌株 中最常见的是 I 型整合子 [10] I 型整合子由 5 保守末端和 3 保守末端及两者 之间的可变区组成 5 保守末端包括整合酶 (IntI1) 及两个重组位点 atti 和 attc,3 保守末端多含有 qace 1 和 suli 基因 可变区可含一个或多个基因 盒, 也可不含任何基因盒 已经明确, 基因盒主要编码耐药基因及一些功能不明 的蛋白质 [11-13] 因此, 临床菌株中, 整合子阳性株较阴性株更容易产生多重耐药 [14] [15-16] 多重耐药整合子被认为是革兰阴性菌产生多重耐药的重要原因 本实 验中,74 株产 ESBLs 肺炎克雷伯菌中 69 株 (93.24%) IntI1 基因阳性, 表明 I 型整合子发生率在产 ESBLs 肺炎克雷伯菌中是很高的, 而这些菌株也多为多重 耐药菌, 这也表明整合子的发生率与细菌的多重耐药密切相关 对 IntI1 基因阳 性株用 RB317 和 RB320 引物进行扩增, 其中 12 株未扩增出产物, 这可能是由于 这些菌株的整合子中缺乏 3 保守末端, 或整合子可变区片段过大, 导致常规 PCR 无法扩增出产物 [2] 测序结果表明 : 在产 ESBLs 肺炎克雷伯菌整合子中所携 带的基因盒编码了对氨基苷类 氯霉素 trimethoprim 及利福平等抗生素的耐 40

41 药基因, 其中 dfr( 对 trimethoprim 耐药 ) 和 aada( 对氨基苷类抗生素耐药 ) 基因盒是最常见的基因盒 整合子中 aada 和 aaca 基因盒 ( 对氨基苷类抗生素耐药 ) 的高携带率可能是导致菌株对庆大霉素和阿米卡星高耐药率的重要原因 本实验中,29 株菌株的整合子含 dfra12-orff-aada2 基因盒, 该基因盒组合在其他地区和其它菌种的整合子中也非常常见, 但原因不明 [17-18] 本实验结果显示, 在产 ESBLs 的肺炎克雷伯菌中, 整合子的阳性率非常高, 并在细菌的多重耐药中起重要作用 至今整合子中所发现的基因盒已经超过 75 种, 所介导的耐药性几乎涵盖了现在所使用的所有种类的抗生素, 而 ESBLs 编码基因如 bla CTX-M, bla GES, bla OXA or bla VEB 均可整合于整合子中, 但尚无 bla SHV and bla TEM 整合于整合子中的报道 [19-23] 尽管本实验中所有肺炎克雷伯菌均产 ESBLs, 但并未发现编码 ESBLs 的基因盒, 表明目前整合子并非 ESBLs 的主要传播方式 在之前的实验中, 我们对本实验中 37 株菌株进行脉冲场电泳分型也发现, 大部分菌株属于不同的基因型, 而同一基因型的菌株其耐药谱和整合子中所含的基因盒均不同 [24] 这表明, 克隆传播并非目前该医院细菌耐药性传播的主要方式 而目前报道的整合子大部分位于可接合质粒上, 这表明, 接合可能是细菌耐药基因水平传播的主要方式 肺炎克雷伯菌中 ESBLs 和整合子的产生必然会威胁抗生素治疗的有效性 参考文献 [1] Zhao S, White DG, Ge B, Ayers S, Friedman S, English L, Wagner D et al. Identification and characterization of integron-mediated antibiotic resistance among Shiga toxin-producing Escherichia coli isolates. Appl Environ Microbiol 2001, 67: [2] Barlow RS, Pemberton JM, Desmarchelier PM, Gobius KS. Isolation and characterization of integron-containing bacteria without antibiotic selection. Antimicrob Agents Chemother 2004, 48: [3] Senda KY, Arakawa YC, Ichiyama SS, Nakashima KM, Ito HD, Ohsuka SJ, Shimokata KR et al. PCR detection of metallo- β- lactamase gene(blaimp) 41

42 in gram-negative rods resistant to broad-spectrum β-lactamas. J Clin Microbiol 1996, 34: [4] Cormican MG, Marshall SA, Jone RN. Detection of extended-spectrum β-lactamase (ESBL)-producing strains by the E test ESBL screen. Journal of clinical microbiology 1996, 34: [5] Muller A, Lopez-Lozano JM, Bertrand X, and Talon D. Relationship between ceftriaxone use and resistance to third-generation cephalos -porins among clinical strains of Enterobacter cloacae. J Antimicrob Chemother 2004, 54: [6]Y. Yu, W. Zhou, Y. Chen, Y. Ding, et al, Epidemiological and antibiotic resistant study on extended-spectrum beta-lactamase-producing Escheri -chia coli and Klebsiella pneumoniae in Zhejiang province, Chin Med J (Engl) 115 (2002) [7]Z. Xiong, D. Zhu, Y. Zhang, et al, Extended-spectrum beta-lactamase in Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli isolates, 82 (2002) [8] Stokes HW, and Hall RM. A novel family of potentially mobile DNA elements encoding site-specific gene-integration functions: integrons. Mol Microbiol 1989, 3: [9] Emergut DR, Martin AP, Schmidt SK. Integron diversity in heavy-meatalcontaminated mine tailings and inferences about integron evolution. Applied and environmental microbiology, 2004, 70(2): [10] Jones ME, Peters E, Weersink A M, Fluit A, and Verhoef J. Widespread occurrence of integrons causing multiple antibiotic resistance in bacteria. Lancet 1997, 349: [11] Hall RM, and Stokes HW. Integrons: novel DNA elements which capture genes by site-specific recombination. Genetica 1993, 90: [12] Paulsen IT, Littlejohn TG, Radstrom P, Sundstrom L, Skold O, Swedberg G, and Skurray RA. The 3 conserved segments of integrons contains a gene 42

43 associated with multidrug resistance to antiseptics and disinfectants. Antimicrob Agents Chemother 1993,37: [13] Rechis GD, and Hall RM. Gene cassettes: a new class of mobile element. Microbiology 1995, 141: [14] Freijo PM, Fluit AC, and Schmitz FJ, Grek VS, Verhoef J, Jones ME. Class I integrons in Gram-negative isolates from different European hospitals and association with decreased susceptibility to multiple antibiotic compounds. J Antimicrob Chemother 1998, 42: [15]Carattoli A. Importance of integrons in the diffusion of resistance. Vet Res 2001, 32: [16]Fluit AC, Schmitz FJ. Class 1 integrons, gene cassettes, mobility, and epidemiology. Eur-J-Clin-Microbiol-Infect-Dis 1999, 18: [17]Lee JC, Oh JY, Cho JW, Park JC, Kim JM, Seol SY, Cho DT. The prevalence of trimethoprim-resistance -conferring dihydrofolate reductase genes in urinary isolates of Escherichia coli in Korea. J Antimicrob Chemother 2001, 47: [18]Sunde M. Prevalence and characterization of class 1 and class 2 integrons in Escherichia coli isolated from meat and meat products of Norwegian origin. J Antimicrob Chemother 2005, 56: [19] Bonnet R. Growing group of extended-spectrum beta-lactamases: the CTX-M enzymes. Antimicrob Agents Chemother 2004, 48:1-4 [20] Giuliani F, Docquier JD, Riccio ML, Pagani L, and Rossolini GM. OXA-46, a new class D ß-Lactamase of narrow substrate specificity encoded by a bla VIM-1-containing integron from a Pseudomonas aeruginosa clinical isolate. Antimicrob Agents Chemother : [21] Poirel L, Brinas L, Fortineau N, and Nordmann P. Integron-encoded GES-type extended-spectrum ß-lactamase with increased activity toward aztreonam in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother 2005, 49:

44 [22] Naas T, Aubert D, Lambert T, and Nordmann P. Complex Genetic Structures with Repeated Elements, a sul-type Class 1 Integron, and the bla VEB Extended-Spectrum ß-Lactamase Gene. Antimicrob Agents Chemother 2006, 50: [23] Machado E, Canton R, Baquero F, Galan JC, Rollan A, Peixe L, and Coque TM. Integron Content of Extended-Spectrum-ß-Lactamase-Producing Escheri -chia coli Strains over 12 Years in a Single Hospital in Madrid, Spain. Antimicrob Agents Chemother 2005, 49: [24] Yao F, Chen SZ, Cai YM, Qian YS. Antimicrobial resistance of extended-spectrum β-lactamases-producing Klebsiella pneumoniae and their genotyping by pulsed-field gel electrophoresis, Chin J Antibio 2004, 29:

45 第三章耐亚胺培南铜绿假单胞菌流行病学分析 铜绿假单胞菌是引起医院获得性感染最常见的致病菌之一, 对多种抗生素天然耐药, 因此其治疗十分棘手 亚胺培南等碳青酶烯类抗生素自问世以来, 由于其抗菌谱广 抗菌活性强, 一直是治疗多重耐药铜绿假单胞菌最有效的抗生素 但目前随着亚胺培南在临床应用的日益增多, 铜绿假单胞菌对其耐药情况也日益严重 为了解汕头地区铜绿假单胞菌的耐药情况和耐药机制, 我们收集了汕头大学第一附属医院 2005 年 4 月到 2006 年 4 月间临床分离的对亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌, 并对其耐药情况和耐药机制进行了研究 1. 材料 1.1 临床菌株 收集汕头大学医学院第一附属医院检验科 2005 年 4 月到 2006 年 4 月间分离的对亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌共 141 株, 其中来自痰液的标本最多, 共 139 份, 其他两份来自分泌物 从科室来源看, 来自神经外科的标本最多 (64 份 ), 外科 ICU 次之 (40 份 ), 其它依次为呼吸内科 (20 份 ), 神经内科 (7 份 ),CCU(4 份 ) 和其他科室 (6 份 ) 全部菌株均经常规方法和 VITEK-60( 法国 )GNI 卡鉴定 药敏卡 GNS143 GNS142 鉴定菌株均对亚胺培南耐药 1.2 实验仪器及试剂 实验仪器 同第二章 试剂 45

46 药敏卡 GNS143 GNS142( 法国 biomérieux 公司 ); 亚胺培南纸片 (IPM, 英国 Oxoid 公司产品 ) 抑制剂纸片 : 取直径 6mm, 厚 1mm 的滤纸片 ( 杭州新华纸厂产品 ), 高压蒸汽灭菌 烘干后密封保存 2- 巯基丙酸 (2-MPA,Aldrich chemical 公司产品 ) 其他试剂同第二章 引物合成 引物由上海英骏广州公司合成,IMP VIM 和 SPM 金属酶 PSE 酶 外膜蛋白 OprD 2 引物 (pdf/pdr) 序列及预期产物长度和 PCR 反应条件和参考文献具体见表 方法 2.1 药敏试验 对分离的菌株采用药敏卡 GNS143 GNS142 测定菌株对 8 种抗生素头孢唑啉 头孢他啶 头孢曲松 头孢吡肟 环丙沙星 左氧氟沙星 庆大霉素 妥布霉素和两种 β- 内酰胺类抗生素 / 酶抑制剂的复方制剂哌拉西林 / 他唑巴坦 头孢哌酮 / 舒巴坦和复方磺胺甲恶唑的敏感性 质控株采用铜绿假单胞菌标准株 ATCC 金属酶表型检测 对头孢他啶和亚胺培南均耐药株进行金属酶表型检测 利用纸片协同法检测产金属酶细菌 细菌 LB 平板过夜培养, 挑取数个菌落, 生理盐水制成 0.5 麦氏单位菌液, 均匀涂布于 MH 平板上, 贴上两张亚胺培南纸片 (30μg/ 片 ), 两纸片相距 4~5 cm, 在其中 1 张亚胺培南纸片的旁边贴上 1 张空白灭菌纸片, 使两纸片相距 1.0~1.5 cm, 在空白纸片上滴加 2- 巯基丙酸 (2-MPA) 原液 2μl 经 h 46

47 孵育, 若 2- 巯基丙酸旁边的亚胺培南纸片近亚胺培南一侧出现抑菌效果增强或两纸片之间出现协同敏感区, 则判定受试菌产金属酶 对部分菌株将 2-MPA 改为 0.5M EDTA 3μl 进行检测 另外, 部分菌株采用纸片增效法, 即在涂满细菌的平板上贴上两片亚胺培南纸片, 两纸片相距 4~5 cm, 在其中一片亚胺培南纸片上滴加浓度为 2-MPA 原液 2μl 或 0.5M EDTA 3μl, 如滴加 2-MPA 或 EDTA 的抗生素纸片的抑菌圈较未滴加抑制剂纸片扩大 5mm 以上, 即判别为金属酶阳性 阳性对照株为产 IMP-1 酶的铜绿假单胞菌 表 3-1 Table 3-1 PCR 引物序列 预期产物长度及 PCR 反应条件 Primers and conditions of PCR in this study 引物 引物序列 产物长度 PCR 反应条件 参考文献 PSE1 TTATTGGCATTTTCGCTTTTA 803bp 1 cycle of 5min at 94 ;35 cycle of 45s 1 PSE2 CGCATCATTTCGCTCTG at 94,45s at 56,1 min at 72 IMP1F CTACCGCAGCAGAGTCTTTG 586bp 1 cycle of 5min at 94 ;35 cycle of 45s 2 IMP1R AACCAGTTTTGCCTTACCAT at 94,45s at 55,1 min at 72 IMP2F GTGTATGCTTCCTTTGTAGC 173bp 1 cycle of 5min at 94 ;35 cycle of 45s 2 IMP2R CAATCAGATAGGCGTCAGTGT at 94,45s at 40,1 min at 72 VIMF ATGGTGTTTGGTCGCATATC 509 bp 1 cycle of 5min at 94 ;35 cycle of 45s 2 VIMR TGGGCCATTCAGCCAGATC at 94,45s at 55,1 min at 72 SPMF CCTACAATCTAACGGCGACC 648 bp 1 cycle of 5min at 94 ;35 cycle of 45s 3 SPMR TCGCCGTGTCCAGGTATAAC at 94,45s at 40,1 min at 72 pdf pdr ATGAAAGTGATGAAGTGGAGC CAGGATCGACAGCGGATAGT 1328 bp 1 cycle of 5min at 94 ;35 cycle of 1min at 94,1min at 55,1.5 min at DNA 提取 煮裂法提取细菌 DNA, 方法同第二章 2.4 PCR 扩增 PCR 扩增引物及条件见表 测序 PCR 扩增产物送上海博亚公司直接测序 47

48 3. 结果 3.1 耐亚胺培南铜绿假单胞菌药敏试验结果 141 株耐亚胺培南铜绿假单胞菌对喹诺酮类 氨基苷类 磺胺类和大多数头孢菌素类抗生素的耐药率平均高达 95~100%, 即使对于可用作铜绿假单胞菌感染首选药物的头孢他啶和第四代头孢类抗生素头孢吡肟的敏感率也只有 27.66% 和 24.17%, 甚至对含酶抑制剂的哌拉西林 / 三唑巴坦的敏感率也只有 36.17%, 只有头孢哌酮 / 舒巴坦的敏感率最高, 达到 66.67% 表 3-2 耐亚胺培南铜绿假单胞菌药敏试验结果 Table 3-2 Antibiotic Antibiotic susceptibility of imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa a S(%) I(%) R(%) 头孢唑啉 头孢他啶 头孢曲松 头孢吡肟 环丙沙星 左氧氟沙星 庆大霉素 妥布霉素 哌拉西林 / 三唑巴坦 头孢哌酮 / 舒巴坦 复方磺胺甲恶唑 a 缩写 : S, 敏感 ; I, 中介 ; R, 耐药 48

49 3.2 金属酶表型检测结果 以双纸片协同试验为准, 结果均阴性 3.3 PCR 扩增结果 金属酶引物 (IMP1,IMP2,VIM,SPM) 扩增结果 四对金属酶引物扩增均未见目的条带 外膜蛋白扩增结果 段 pdf pdr 引物扩增结果表明,141 株菌株中, 共有 22 株菌株扩增出目的片 2000bp 1000bp 750bp 500bp 图 3-1 oprd 基因扩增结果 Figure 3-1 PCR results of oprd 2 gene PSE 引物扩增结果 141 株耐亚胺培南铜绿假单胞菌中, 共有 6 株 PSE 酶阳性, 见图 bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 图 3-2 PSE 引物扩增结果 Figure 3-2 PCR results with PSE primer 49

50 3.3.4 测序结果 测序结果显示, 6 株 PSE 酶阳性株中, 有 5 株的核苷酸序列与 pse-1 完全 相同, 另有 1 株的核苷酸序列与 pse-1 的同源性为 99% emb AJ Pseudomonas aeruginosa partial Tn5051-like transposon and class 1 integron In85, strain 85MG Score = 1397 bits (756), Expect = 0.0 Identities = 756/756 (100%), Gaps = 0/756 (0%) Strand=Plus/Plus Query 2 TCCGTGGTTTTTGCAAGTAGTTCAAAGTTTCAGCAAGTTGAACAAGACGTTAAGGCAATT 61 Sbjct 4005 TCCGTGGTTTTTGCAAGTAGTTCAAAGTTTCAGCAAGTTGAACAAGACGTTAAGGCAATT 4064 Query 62 GAAGTTTCTCTTTCTGCTCGTATAGGTGTTTCCGTTCTTGATACTCAAAATGGAGAATAT 121 Sbjct 4065 GAAGTTTCTCTTTCTGCTCGTATAGGTGTTTCCGTTCTTGATACTCAAAATGGAGAATAT 4124 Query 122 TGGGATTACAATGGCAATCAGCGCTTCCCGTTAACAAGTACTTTTAAAACAATAGCTTGC 181 Sbjct 4125 TGGGATTACAATGGCAATCAGCGCTTCCCGTTAACAAGTACTTTTAAAACAATAGCTTGC 4184 Query 182 GCTAAATTACTATATGATGCTGAGCAAGGAAAAGTTAATCCCAATAGTACAGTCGAGATT 241 Sbjct 4185 GCTAAATTACTATATGATGCTGAGCAAGGAAAAGTTAATCCCAATAGTACAGTCGAGATT 4244 Query 242 AAGAAAGCAGATCTTGTGACCTATTCCCCTGTAATAGAAAAGCAAGTAGGGCAGGCAATC 301 Sbjct 4245 AAGAAAGCAGATCTTGTGACCTATTCCCCTGTAATAGAAAAGCAAGTAGGGCAGGCAATC 4304 Query 302 ACACTCGATGATGCGTGCTTCGCAACTATGACTACAAGTGATAATACTGCGGCAAATATC 361 Sbjct 4305 ACACTCGATGATGCGTGCTTCGCAACTATGACTACAAGTGATAATACTGCGGCAAATATC 4364 Query 362 ATCCTAAGTGCTGTAGGTGGCCCCAAAGGCGTTACTGATTTTTTAAGACAAATTGGGGAC 421 Sbjct 4365 ATCCTAAGTGCTGTAGGTGGCCCCAAAGGCGTTACTGATTTTTTAAGACAAATTGGGGAC 4424 Query 422 AAAGAGACTCGTCTAGACCGTATTGAGCCTGATTTAAATGAAGGTAAGCTCGGTGATTTG 481 Sbjct 4425 AAAGAGACTCGTCTAGACCGTATTGAGCCTGATTTAAATGAAGGTAAGCTCGGTGATTTG

51 Query 482 AGGGATACGACAACTCCTAAGGCAATAGCCAGTACTTTGAATAAATTTTTATTTGGTTCC 541 Sbjct 4485 AGGGATACGACAACTCCTAAGGCAATAGCCAGTACTTTGAATAAATTTTTATTTGGTTCC 4544 Query 542 GCGCTATCTGAAATGAACCAGAAAAAATTAGAGTCTTGGATGGTGAACAATCAAGTCACT 601 Sbjct 4545 GCGCTATCTGAAATGAACCAGAAAAAATTAGAGTCTTGGATGGTGAACAATCAAGTCACT 4604 Query 602 GGTAATTTACTACGTTCAGTATTGCCGGCGGGATGGAACATTGCGGATCGCTCAGGTGCT 661 Sbjct 4605 GGTAATTTACTACGTTCAGTATTGCCGGCGGGATGGAACATTGCGGATCGCTCAGGTGCT 4664 Query 662 GGCGGATTTGGTGCTCGGAGTATTACAGCAGTTGTGTGGAGTGAGCATCAAGCCCCAATT 721 Sbjct 4665 GGCGGATTTGGTGCTCGGAGTATTACAGCAGTTGTGTGGAGTGAGCATCAAGCCCCAATT 4724 Query 722 ATTGTGAGCATCTATCTAGCTCAAACACAGGCTTCA 757 Sbjct 4725 ATTGTGAGCATCTATCTAGCTCAAACACAGGCTTCA 4760 emb AJ Pseudomonas aeruginosa partial Tn5051-like transposon and class 1 integron In85, strain 85MG Score = 1151 bits (623), Expect = 0.0 Identities = 628/630 (99%), Gaps = 1/630 (0%) Strand=Plus/Plus Query 4 TCCGTGGTTTTTGCAAGTAGTTCAAAGTTTCAGCAAGTTGAACAAGACGTTAAGGCAATT 63 Sbjct 4005 TCCGTGGTTTTTGCAAGTAGTTCAAAGTTTCAGCAAGTTGAACAAGACGTTAAGGCAATT 4064 Query 64 GAAGTTTCTCTTTCTGCTCGTATAGGTGTTTCCGTTCTTGATACTCAAAATGGAGAATAT 123 Sbjct 4065 GAAGTTTCTCTTTCTGCTCGTATAGGTGTTTCCGTTCTTGATACTCAAAATGGAGAATAT 4124 Query 124 TGGGATTACAATGGCAATCAGCGCTTCCCGTTAACAAGTACTTTTAAAACAATAGCTTGC 183 Sbjct 4125 TGGGATTACAATGGCAATCAGCGCTTCCCGTTAACAAGTACTTTTAAAACAATAGCTTGC 4184 Query 184 GCTAAATTACTATATGATGCTGAGCAAGGAAAAGTTAATCCCAATAGTACAGTCGAGATT 243 Sbjct 4185 GCTAAATTACTATATGATGCTGAGCAAGGAAAAGTTAATCCCAATAGTACAGTCGAGATT 4244 Query 244 AAGAAAGCAGATCTTGTGACCTATTCCCCTGTAATAGAAAAGCAAGTAGGGCAGGCAATC 303 Sbjct 4245 AAGAAAGCAGATCTTGTGACCTATTCCCCTGTAATAGAAAAGCAAGTAGGGCAGGCAATC 4304 Query 304 ACACTCGATGATGCGTGCTTCGCAACTATGACTACAAGTGATAATACTGCGGCAAATATC

52 Sbjct 4305 ACACTCGATGATGCGTGCTTCGCAACTATGACTACAAGTGATAATACTGCGGCAAATATC 4364 Query 364 ATCCTAAGTGCTGTAGGTGGCCCCAAAGGCGTTACTGATTTTTTAAGACAAATTGGGGAC 423 Sbjct 4365 ATCCTAAGTGCTGTAGGTGGCCCCAAAGGCGTTACTGATTTTTTAAGACAAATTGGGGAC 4424 Query 424 AAAGAGACTCGTCTAGACCGTATTGAGCCTGATTTAAATGAAGGTAAGCTCGGTGATTTG 483 Sbjct 4425 AAAGAGACTCGTCTAGACCGTATTGAGCCTGATTTAAATGAAGGTAAGCTCGGTGATTTG 4484 Query 484 AGGGATACGACAACTCCTAAGGCAATAGCCAGTACTTTGAATAAATTTTTATTTGGTTCC 543 Sbjct 4485 AGGGATACGACAACTCCTAAGGCAATAGCCAGTACTTTGAATAAATTTTTATTTGGTTCC 4544 Query 544 GCGCTATCTGAAAATGAACCAGAAAAAATTAGAGTCTTGGATGGTGAACAATCAAGTCAC 603 Sbjct 4545 GCGCTATCTGAAA-TGAACCAGAAAAAATTAGAGTCTTGGATGGTGAACAATCAAGTCAC 4603 Query 604 TGGTAATTTACTACGTTCAGTTTTGCCGGC 633 Sbjct 4604 TGGTAATTTACTACGTTCAGTATTGCCGGC 讨论 近年来, 由于抗生素 化疗 放疗 免疫抑制剂及侵入性诊疗项目的广泛开展, 非发酵菌引起的院内感染逐渐增多 而引起院内感染的非发酵菌中最常见的就是铜绿假单胞菌 [5-6] 铜绿假单胞菌是革兰阴性杆菌, 是假单胞菌属的代表菌种, 广泛分布于自然界及健康人的皮肤 肠道和呼吸道, 是一种条件致病菌 随着抗菌药物的不断更新及广泛使用, 铜绿假单胞菌的耐药情况越发严重, 临床治疗十分困难 碳青霉烯类抗生素 ( 亚胺培南 美罗培南等 ) 抗菌谱广, 抗菌活性强, 对 β- 内酰胺酶稳定性高, 且能快速通过细菌细胞膜的优点, 已成为目前治疗包括铜绿假单胞菌在内的多重耐药菌感染最有效的抗生素 [7-8] 但是, 近年来随着碳青霉烯类抗生素的广泛应用, 铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药率呈不断上升的趋势, 如波兰 1986 年临床分离的铜绿假单胞菌中, 耐亚胺培南株仅为 1.8%,1994 年至 1996 年上升至 2.6%,2001 年上升至 19.3% [9] 我国也有类似 52

53 的情况, 据我国医院内病原菌耐药性监测网报道,1994 年至 2001 年七年中, 铜绿假单胞菌对亚胺培南的敏感性由 1994 年的 91.5% 下降至 2001 年的 75.4% [10] 根据美国全国性医院感染监测网所监测到的结果显示, 铜绿假单胞菌是医院获得性, 特别是呼吸机相关性肺炎的首位病因 [11] 从本实验分离的菌株来源看, 耐亚胺培南的铜绿假单胞菌绝大部分均由痰标本分离得到, 表明耐亚胺培南的铜绿假单胞菌多引起呼吸道感染 从科室来源看, 耐亚胺培南的铜绿假单胞菌多来自神经外科和外科 ICU, 这可能与这些病区的病人免疫力低 病程和住院时间长 有手术史以及较频繁大量使用抗生素有关 从药敏结果看, 耐亚胺培南的铜绿假单胞菌均为多重耐药菌, 对氨基苷类和喹诺酮类抗生素的耐药率均达到 95% 以上, 提示铜绿假单胞菌临床分离株一旦对亚胺培南耐药, 氨基苷类和喹诺酮类抗生素亦不宜选用 第四代头孢菌素头孢吡肟的中介率很高, 可能与该抗生素近年来在临床上应用增多有关 相比之下, 头孢哌酮 - 舒巴坦复合制剂对耐亚胺培南的铜绿假单胞菌有较好的抗菌活性, 舒巴坦为半合成的 β- 内酰胺酶抑制剂, 头孢哌酮一舒巴坦的复合剂使头孢哌酮对 β- 内酰胺酶稳定性明显增强, 可作为本地区临床治疗耐亚胺培南铜绿假单胞菌所致感染的首选经验用药, 这也与文献报道一致 [12] 铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制包括 β- 内酰胺酶的产生 外膜通透性的降低和主动外排系统的表达 在铜绿假单胞菌中, 能水解碳青霉烯类抗生素的 β- 内酰胺酶主要是金属酶 (metallo-β-lactamases, MBL), 可分为四种类型 :IMP 型,VIM 型,SPM 型和 GIM 型 [13] 由于对金属酶表型的检测目前 CLSI 尚无推荐的方法, 且争议较多, 因此我们进一步采用 PCR 方法检测菌株中的金属酶编码基因的方法加以验证 金属酶表型的检测一般利用金属酶的活性需要锌等二价离子, 故应用金属离子螯合剂如 EDTA 2-MPA 去除锌离子以灭活酶的活性, 即抑制法检测菌株是否产金属酶 目前多数采用双纸片协同或纸片增效法, 但在实际应用中都存在一定的局限性 有文献指出, 对金属酶阴性株,EDTA 同样可以降低其对亚胺培南的 MIC 从而产生假阳性结果 [14-15] 就纸片增效法而言, 由于菌株对滴加 EDTA 2-MPA 的纸片均能产生抑菌圈, 且虽然菌株均为铜绿假单胞菌, 但对 EDTA 2-MPA, 不同的菌株产生的抑菌圈大小不一, 部分菌株甚至相差很大, 因此, 纸片增效法并不十分合理, 会导致假阳性或假阴性结果的产生, 我们还发 53

54 现, 纸片增效法判别为金属酶阳性株的菌株, 用双纸片协同法以及 PCR 扩增结果进行验证均为阴性 部分文献甚至采用滴加 2-MPA 或 EDTA 的抗生素纸片的抑菌圈较未滴加抗生素纸片抑菌圈扩大即判别为金属酶阳性的标准, 这势必会将大量金属酶阴性株误判为阳性株 就双纸片协同法而言, 由于菌株对滴加 EDTA 2-MPA 的纸片均能产生抑菌圈, 特别是 2-MPA 还有一定的毒性, 所产生的抑菌圈较大, 干扰了结果的判读 另外, 抗生素纸片和含 EDTA 或 2-MPA 纸片间的距离也很关键, 距离过大无协同效果, 距离过小则一旦 EDTA 或 2-MPA 纸片本身的抑菌圈较大, 结果就难以判读 目前大多数文献多保持纸片距离为 1.0~1.5 cm, 本实验中, 除少数菌株由于 EDTA 或 2-MPA 纸片的抑菌圈过大导致结果难以判读之外, 大多数菌株采用该距离是较为合理的 从实验结果看,2005 年 4 月至 2006 年 4 月一年间收集的耐亚胺培南的铜绿假单胞菌中并未发现产金属酶菌株, 表明金属酶并非该院铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的原因 铜绿假单胞菌中质粒介导的 β- 内酰胺酶较肠杆菌少见, 通常称为假单胞菌特异性酶 (Pseudomonas specific enzyme, PSE), 目前主要有四种 :PSE-1 (CARB-2), PSE-4 (CARB-1), CARB-3 and CARB-4,PSE-1 PSE-4 和 CARB-3 的同源性较高, 仅相差 1~2 个氨基酸序列, 而与 CARB-4 同源较低, 约为 86.3% PSE 酶能水解替卡西林和哌拉西林等青霉素类抗生素, 但头孢他啶 头孢吡肟 氨曲南和碳青霉烯类抗生素的活性仍不受影响 [16-17] 本实验 141 株耐亚胺培南铜绿假单胞菌中, 仅 6 株 PSE 酶阳性, 与文献报道相比阳性率偏低 产 PSE 酶铜绿假单胞菌对青霉素类抗生素高度耐药, 加用三唑巴坦后,6 株 PSE 酶阳性株对哌拉西林仍然耐药, 提示加用酶抑制剂后不能使菌株对哌拉西林的 MIC 值下降到敏感范围, 这与文献报道一致 [18] β- 内酰胺类抗生素对铜绿假单胞菌的作用靶位是细菌内膜上的青霉素结合蛋白 (PBP S), 这类药物必须首先穿透外膜进入周浆间隙才能起作用 铜绿假单胞菌的外膜蛋白是半渗透性的, 不具有其他多数革兰阴性细菌的 典型 高通透性孔蛋白, 而仅存在低效率的微孔蛋白 C(OprC) D(OprD) 和 E1(Opr E1),OprD 又可以分为 OprD 1 和 OprD 2 微孔蛋白所形成的小孔道仅允许小分子物质通透 碳青霉烯类抗生素是一类分子量较小的亲水性 β- 内酰胺类抗生素, 可以通过这类微孔蛋白扩散, 其中, OprD 2 是亚胺培南选择性进入菌体的特异性通道, 因此, 54

55 OprD 2 孔蛋白的缺失或表达减少将导致铜绿假单胞菌对亚胺培南的通透性降低, 从而对亚胺培南呈现耐药 [19-21] 本实验中仅 22 株菌株扩增出 OprD 2 基因, 表明大多数菌株存在 OprD 2 基因突变导致 OprD 2 表达减少或不表达, 这可能是该院铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要机制 参考文献 [1]Pai H, Kim JW, Kim J, Lee JH, Choe KW, and Gotoh N, Carbapenem resistance mechanisms in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates[j]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2001, 45(2): [2]Hisaaki N, Masaru K, Naohiro S, Kouichi S, Noriyuki S, Toshiro U, Kaori S, et al. Metallo- β -lactamase-producing gram-negative bacilli: laboratory-based surveillance in cocoperative with 13 clinical laboratories in the Kinki region of Japan[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2004, 42(11): [3]Gales AC, Menezes LC, Silbert S, et al. Dissemination in distinct Brazilian regions of an epidemic carbapenem-resistance Pseudomonas aeruginosa producing SPM metallo- β -lactamases[j]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2003, 52:699 [4]Pirnay JP, De VD, Mossialos D, et al. Analysis of the Pseudomonas aeruginosa oprd gene from clinical and environmental isolates[j].environ Microbiol, 2002, 4: [5] 安群, 高岩 非发酵菌耐药性分析及抗菌药物治疗对策 [J] 中华医院感染学杂志,2005,15(5): [6] 许小敏, 邓丹飞, 傅维静 非发酵菌的抗菌药物敏感性分析 [J] 现代实用医学,2005,17(10): [7] 张书话, 肖怡 碳青霉烯类抗生素的药理学特性及研究进展 [J] 四川生理科学杂志,2005,27(4): [8]Poirel L, Naas T,Nicolas D, et al. Characterization of VIM-2,a 55

56 carbapenem-hydrolyzing metallo- β -lactamase and its plasmid and integron-borne gene from a Pseudomonas aeruginosa clinical isolate in France[J].Antimicrob Agents Chemother, 2000, 44: [9]Patzer J, Toleman M, Deshpande L, et al. Pseudomonas aeruginosa strains barbouring an unusual blavim-4 cassette isolated from hospitalized children in Poland( )[J]. J Antimicrob Chemother, 2004, 53(3):451 [10] 王辉, 陈民钧 年中国重症监护病房非发酵糖细菌的耐药变迁 [J] 中华医学杂志,2003,83(5): [11]Jarvis WR, Martone WJ. Predominant pathogens in hospital infections[j]. J Antimicrob Chemother, 1992, 29(suppl A):19-24 [12] 肖庆忠, 苏丹虹, 江洁华, 陈冬梅, 叶惠芬, 等 广州地区非发酵革兰阴性杆菌的耐药性监测 [J] 中国抗感染化疗杂志,2004,4(4): [13] Timothy RW, Mark AT, Laurent P, and Patrice N, Metallo-β-lactamases: the quiet before the storm? Clinical Microbiology Reviews, 2005, 18(2): [14]Perron K, Caille O, Rossier C, Van Delden C, Dumas JL, Kohler T.. CZCR-CZCS: A two component system involved in heavy metal and carbapenem resistance in pseudomonas aeruginosa[j]. J Biol Chem, 279: [15] Conejo MC, Isabel G, Luis MM, Leandro P, and Alvaro P. Zinc Eluted from Siliconized Latex Urinary Catheters Decreases OprD Expression, Causing Carbapenem Resistance in Pseudomonas aeruginosa[j]. Antimicrob Agents Chemother, 47: [16] Frederic B, Catherine B and Nicole LZ. Identification of PSE and OXA β-lactamase genes in Pseudomonas aeruginosa using PCR restriction fragment length polymorphism[j]. J Antimicrob Chemother, 2002, 50:11-18 [17] Sanschagrin F, Bejaoui N and Levesque RC. Structure of CARB-4 and AER-1 carbenicillin-hydrolyzing β-lactamases[j]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1998,42:

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58 第四章 AmpC 酶介导的铜绿假单胞菌耐药性分析 AmpC 酶又称头孢菌素酶, 其特点是具有很强的可诱导性, 在抗生素的诱导下其产酶量显著上升 研究表明,AmpC 酶的产生是铜绿假单胞菌对 β- 内酰胺类抗生素耐药的重要机制 为了解 AmpC 酶在本地区铜绿假单胞菌对 β- 内酰胺类抗生素耐药中所起的作用, 我们对同一病人抗生素治疗前后同源性分离株 AmpC 酶的产生情况进行分析 1. 材料 1.1 临床菌株 标本来自汕头大学医学院第一附属医院检验科 2005 年 7 月到 2007 年 3 月 间分离的铜绿假单胞菌 选取同一病人抗生素治疗前和治疗后分离株进行研究 1.2 实验仪器及试剂 实验仪器 实验仪器同前 试剂 头孢西丁纸片 (FOX, 英国 Oxoid 公司产品 ) 头孢他啶纸片 (CAZ, 英国 Oxoid 公司产品 ) 随机引物 208 由英骏公司广州分公司合成, 序列如下 : ACGGCCGACC[1] 2. 方法 58

59 2.1 试剂配制 nitrocefin 的配制 :10.8mgnitrocefin 溶解于 lml 的二甲基亚砜中, 然后用 0.1mol/L PBS(pH7.0) 再稀释 1:20, 最后浓度为 10-4 mol/l, 溶液呈黄或淡橙色, 4 避光保存 2.2 细菌复苏和培养 方法同前 2.3 细菌 DNA 提取 采用煮沸法提取细菌 DNA, 方法同前 2.4 细菌随机扩增多态性 DNA(Random amplified polymorphic DNA, RAPD) 分型 [1] 按 25µl 的反应体系依次加入 : 10 PCR Buffer 2.5µl MgCl 2(25mM) 3µl dntp( 各 10mM) µl 引物 (20pmol) 1 µl DNA 模板 0.8 µl Taq 酶 (5U/µl) 0.2 µl 加 dd H 2O 至 25 µl RAPD 分型条件如下 变性 94 5 min 退火 36 5 min 4 个循环 延伸 72 5 min 59

60 变性 94 1 min 退火 36 1 min 30 个循环 延伸 72 2 min 再延伸 min 2.5 琼脂糖电泳 制备 1.5% 琼脂糖凝胶, 每孔加入 PCR 产物 20µl, 在 1 TBE 电泳缓冲液中 100V 电泳 2.5h, 溴化乙锭染色成像 2.6 药敏试验 治疗前与治疗后菌株属于同一基因型者 ( 即 RAPD 分型完全一致者 ) 进一步进行药敏测定 采用微量稀释法测定头孢他啶对细菌的细菌最低抑菌浓度 (MIC) 值 用灭菌生理盐水配制浓度为 5120µg/ml 的头孢他啶溶液, 然后用 MH 肉汤稀释 40 倍, 使头孢他啶终浓度为 128µg/ml 取 50µl 头孢他啶溶液加入 96 孔板的第一列, 采用对倍稀释法设置 6 个浓度梯度 挑取经 LB 平板过夜培养菌落, 用生理盐水调制成 0.5 麦氏单位, 用 MH 肉汤稀释 100 倍, 取 50µl 菌悬液加入已加好抗生素的 96 孔板中, 使抗生素的终浓度分别为 :32µg/ml,16µg/ml,8µg/ml, 4µg/ml,2µg/ml 和 1µg/ml 将 96 孔板盖好后放入湿盒中,35 过夜培养 20h 在衬有黑底的光线下观察结果, 以弥漫混浊 单一的大圆点或丝网状为细菌生长指标, 无菌生长的最低浓度即为头孢他啶的 MIC 以治疗后分离菌株对头孢他啶的 MIC 较治疗前增加 8 倍为阳性 2.7 酶提取 过夜培养的菌落接种 LB 肉汤中再度过夜培养, 以 比例转种于 25 ml LB 液体培养基中 35 震摇 5h, r/ min 离心 15min, 去上清液, 沉淀用 1 ml 0.05 mmol/ L PBS 缓冲液 (ph 7.0) 混匀, r/ min 离心 10min 沉淀用 1 ml 0.01 mmol/ L PBS 缓冲液 (ph 7.0) 混匀 冰水浴中超声破碎仪破 60

61 碎, 参数为 :200 W, 每次超声 2s, 间隔 2s, 共超声 5 min 结束后 r/min 离心 60 min, 取上清液即为此粗酶提取物, 取 10µl 粗酶提取物与 10µl nitrocefin 溶液混匀, 若 nitrocefin 由黄色变成红色则表示提取成功, -20 保存备用 2.5 头孢西丁三相试验 大肠埃希菌 ATCC25922 转种 LB 平板过夜培养, 用灭菌棉支挑取菌落, 生理盐水制成 0.5 麦氏单位的菌液, 均匀涂布在 MH 平皿上, 平皿中心贴头孢西丁纸片 (30 μg), 距纸片边缘 5mm 处向外切出 2 个不同方向的狭缝, 钩出其中琼脂, 每缝中加入待测菌的 40μl 粗酶提取物,35 孵育过夜, 观察结果 [2] 2.6 头孢西丁诱导实验 将待测菌株用生理盐水调整为 0.5 麦氏单位的菌悬液, 用无菌棉拭子划线接种在 MH 平板上, 分别贴上头孢西丁 (FOX) 纸片和头孢他啶 (CAZ) 纸片, 纸片与纸片边距为 15mm 35 过夜培养 16-18h 若 CAZ 纸片的抑菌圈呈圆形, 表明无诱导酶产生 诱导酶阳性株由于 FOX 诱导剂的影响, 导致细菌产生大量 AmpC 酶, 因此,CAZ 纸片在靠近 FOX 纸片的一侧形成的抑菌圈较平坦, 形态似 D 字形, 表明诱导型 AmpC 酶为阳性 [3] 以大肠埃希菌标准菌株 ATCC25922 菌悬液替代待检菌作为对照 3. 结果 3.1 RAPD 分型结果 分离菌株中筛选出 8 组符合条件的菌株, 其 RAPD 分型图谱完全一致, 具体见图

62 I II III IV V VI VII VIII 图 组铜绿假单胞菌的 RAPD 分型 Figure 4-1 RAPD typing of 8 pairs of Pseudomonas aeruginosa 3.2 药敏结果 8 组铜绿假单胞菌中, 抗生素治疗后分离株对头孢他啶的 MIC 值较治疗前增 加 8 倍 见表 头孢西丁三相试验 8 组铜绿假单胞菌中, 抗生素治疗前分离株头孢西丁三相试验均为阴性, 而 治疗后分离株头孢西丁三相试验均呈阳性 见表 4-1, 图 头孢西丁诱导试验 对头孢西丁三相试验阴性菌株进行头孢西丁诱导试验, 其中 6 株菌株阳性 见表 4-1, 图

63 图 4-1A: 头孢西丁三相试验阳性 图 4-1: 头孢西丁三相试验阴性 Figure 4-1 The result of cefoxitin 3-dimensional test 图 4-2A: 头孢西丁诱导试验阴性 图 4-2B: 头孢西丁诱导试验阳性 Figure 4-2 The result of cefoxitin induced test 63

64 表 组铜绿假单胞菌的分离时间 头孢他啶 MIC 及 AmpC 酶产生情况 Table 4-1 of 8 pairs strains Collection date, ceftazidime MICs,characterization of AmpC production 组别 治疗前 治疗后 分离时间 CAZ 的 头孢西丁 头孢西丁 分离时间 CAZ 的 头孢西丁 MIC 诱导试验 三相试验 MIC 三相试验 I II III IV V VI VII VIII 讨论 传统的细菌分型方法主要根据细菌的表型特征进行分型, 往往不够敏感, 加之容易受到外界因素的影响, 结果不够稳定, 也无法辨别细菌的克隆来源 分子生物学技术的飞速发展使得我们对细菌进行基因分型成为可能, 并因此发展出许多细菌基因分型的方法, 如 RAPD 脉冲场电泳 多位点序列分型 核糖体分型等多种方法 [4-6] 其中, 脉冲场电泳被视为细菌基因分型的金标准, 但该方法样本制备繁琐, 且需要特殊的电泳仪器, 电泳时间长, 耗时耗力 与之相比,RAPD 分型法的过程与普通 PCR 琼脂糖电泳无异, 无需特殊仪器, 耗时也较短 对铜绿假单胞菌而言,RAPD 分型结果与脉冲场电泳分型分型结果基本一致, 可作为铜绿假单胞菌分型的可靠方法 [1,7] 在本实验中, 所有菌株的 RAPD 分型实验均重复两次以上, 同一菌株 RAPD 图谱均一致, 说明该方法重复性好 AmpC 酶又称作头孢菌素酶, 能水解三代头孢菌素 头霉素 单环类等 β- 内酰胺类抗生素, 它与超广谱 β- 内酰胺酶 (ESBLs) 最主要的差别在于抗生素底物谱不断扩大且不能被克拉维酸等酶抑制剂所抑制, 导致临床可选用的抗生素范围变小 [8] AmpC 酶可由染色体和质粒介导 染色体 AmpC 酶的合成与 ampc ampr ampd 64

65 ampe ampg 5 种基因有关 其中,ampC 为结构基因, 其余 4 种为调节基因 AmpC 酶的基因突变一般发生在调节基因上, 通过对产酶量的调控引起细菌耐药 染色体 AmpC 酶按其产生的方式分为三类 : 诱导高产酶 持续高产酶和持续低产酶 [9] 诱导高产酶株主要是在无 β- 内酰胺类抗菌素存在的条件下只产生少量的 AmpC 酶, 而当有诱导作用的 β 内酰胺类抗生素存在时 AmpC 酶的产量明显增加, 对某些细菌诱导前和诱导后其产酶量可相差 倍, 头孢西丁 亚胺培南等 β- 内酰胺类抗生素均是其强诱导剂 [10] ; 而持续高产酶株不论有无 β- 内酰胺类抗生素存在条件下均可持续高水平产生 AmpC 酶, 其原因主要是调控基因之一的 AmpD 基因发生突变, 产生有缺陷的 AmpD 蛋白, 不能与 AmpR 蛋白结合形成复合物,AmpR 蛋白发挥激活作用, 引起 AmpC 酶的大量表达 极少部分产 AmpC 酶的菌株, 不论有无 β- 内酰胺类抗生素存在条件下均持续低水平的产生 AmpC 酶, 其原因可能是 ampr 基因发生突变, 产生有缺陷的 AmpR 蛋白, 不能在无 β 内酰胺类抗菌素存在条件下起到抑制子作用, 也不能在有 β- 内酰胺类抗生素存在条件下起到激活子的作用,AmpC 酶持续低水平表达 因此,AmpD 和 AmpR 蛋白直接影响了 AmpC 酶的表达水平, 从而导致菌株对 β- 内酰胺类抗生素产生不同程度的耐药 另外,AmpE 可能在 AmpC 酶的高表达中起间接作用, 但其作用还并不十分清楚 [11] ampg 编码膜结合转运蛋白, 其表达缺失可导致诱导物无法进入胞浆发挥诱导产酶作用 与染色体介导的 AmpC 酶不同, 目前发现的质粒介导的 AmpC 酶均为持续高产酶 一般而言, 不同类型的 AmpC 酶其水解特性不同, 但只有持续高产酶才能介导对第三代头孢类抗生素耐药 [12] 头孢西丁三维试验是目前公认的比较经典检测持续高产 AmpC 酶的方法, 也是目前检测质粒 AmpC 酶最好的方法 [13] 该方法采用酶提取物而不是活菌作检测, 避免了抗生素的诱导作用, 准确率高, 结果也容易判读 而头孢西丁诱导实验则用 FOX 药敏纸片作为诱导剂, 以 CAZ 药敏纸片作为指示剂, 对诱导高产酶阳性株, 头孢西丁能诱导菌株产生大量 AmpC 酶, 从而导致头孢他啶的抑菌圈缩小 从本实验可以看出, 抗生素治疗前分离株多数头孢西丁诱导实验阳性, 对头孢他啶保持敏感, 但抗生素治疗后, 所有菌株均变成 AmpC 持续高产株, 对头孢他啶的 MIC 明显增高, 临床上各种 β- 内酰胺类抗生素治疗失败与此相关 这也提示在临床治疗过程中, 对诱导高产酶阳性株引起的感染, 即使是体外实验敏感, 也 65

66 要避免使用头酶素类和氨基青霉素类等 AmpC 酶的强诱导剂, 而三代头孢菌素虽是弱的诱导剂, 但大量长时间的应用也可导致染色体突变产生并筛选持续高产 AmpC 酶株, 因此也宜慎用 亚胺培南虽然为强诱导剂, 但由于 AmpC 酶对亚安培南无水解作用, 虽能诱导菌株产生持续高产酶但无抗生素筛选作用, 可予以选用 在本实验中,8 组同源的铜绿假单胞菌在抗生素治疗后均产持续高产 AmpC 酶, 因此, 有必要对治疗前后菌株 AmpC 酶的调控基因进行研究 另外, 铜绿假单胞菌对 β- 内酰胺类抗生素的耐药机制尚涉及外膜蛋白 主动外排等机制, 抗生素治疗后菌株对头孢他啶 MIC 的明显增高是否与这些机制相关也需要进一步地研究 参考文献 [1]Eshwar Mahenthiralingam, Maureen E. Campbell, Jennifer Foster, Joseph S.Lam, and David P. Speert, Random amplied polyporphic DNA typing of Pseudomonas aerugionosa isolates recovered from patients with cystic fibrosis[j]. Journal of Clinical Microbiology, 1996, 34(5): [2] 王扬, 夏丽萍, 康健, 李艳玲, 王琨, 阎雪 β- 内酰胺类抗菌药物对阴沟肠杆菌 AmpC 酶的诱导性研究 [J] 中华医院感染学杂志,2007,17(2): [3] 沈定树, 周雪艳, 袁远, 徐玖飞, 陈慧红, 夏东, 齐娟飞, 陈东 肠杆菌诱导型 AmpC 酶对第三代和第四代头孢菌素的影响 [J] 中国微生态学杂志,2006, 18(5): [4]Platonov AE, Shipulin GA, Platonov OV. Multiocus sequencing-a new method of genotyping bacteria and first results of its use[j].genetika, 2000, 36(5):597 [5]Tang Y, Von-Graevenitz A, Waddingtong MG,et al. Identification of coryneform bacterial isolates by ribosomal DNA sequence analysis[j]. J Clin Microbiol, 2000, 38(4): [6]Zhang L, Li P. Applying PFGE to the investigation of molecular epidemiology of Enterobacter cloacae in nocosomal infections[j]. Clin J 66

67 Microbiol Immunol, 2001, 21(2):171 [7] 陈瑞, 唐英春, 朱家馨, 李建国 耐亚安培南铜绿假单胞菌外膜蛋白 D 基因突变检测 [J] 中华传染病杂志,2006,24(4): [8] Xu YC, Chen MJ, Douglas J,et al.evaluation ofthe in anti-microbial activity of cepepime compared to other broad-spectrum-β-lactams tested against recent clinical isolates from 10 Chinese hospital[j].diagn Microbial Infect Dis,1999,35:13 [9] 赵虎, 孔宪涛 AmpC β 内酰胺酶的检测 [J] 中华检验医学杂志, 2003, 26(6): [10]Jones RN. Important and emerging β-lactamase-mediated resistances in hospital based pathogens: the AmpC enzymes[j]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 1998, 31: [11]Carlos J, Maria DM, Olivia G, et al. Molecular mechanisms ofβ-lactam resistance mediated by AmpC hyperproduction of Pseudomonas aerugionosa clinical strains[j]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2005, 49(11): [12] Sanders CC. Chromosomal cephalosporinases responsible for multiple resistance to newer β-lactam antbibitics[j]. Annual Review of Microbiology, 1987,41: [13]Coudron PE, Moland ES, Thomson KS. Occurrence anddetection of AmpC beta -lactamase among Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, and Proteus mirabilis isolataes at a veterans medical center[j]. J Clin Microbiol, 2000, 38(6):

68 第五章一株产金属酶荧光假单胞菌的耐药性分析 荧光假单胞菌属于非发酵菌, 是一种环境污染菌, 对人类而言是一种较为罕见的机会致病菌 我们发现了一株对头孢菌素类和碳青霉烯类抗生素高度耐药的荧光假单胞菌, 并对其耐药机制进行了初步研究 1. 材料 1.1 临床菌株 实验菌株为汕头大学医学院第一附属医院检验科 2006 年 8 月份由痰标本中分离的一株菌株, 编号为 08044, 经常规方法和 VITEK-60( 法国 )GNI 卡鉴定为荧光假单胞菌 1.2 实验仪器及试剂 实验仪器 超声细胞破碎仪 ( 宁波新芝仪器厂 ) 分光光度计 ( 芬兰 Labsystems 公司 ) 其他仪器同第二章 试剂 青霉素钠盐 (penicillin G,PG, 华北制药集团 ); 亚胺培南 / 西司他丁 (imipenem/claiastatin, IMP, 美国默沙东药厂 ); 美罗培南 (meropenem, MEPM, 深圳市海滨制药有限公司 ); 氨曲南 (aztreonam, ATM, 山东威奇达药业有限公司 ); 头孢噻肟 (cetotaxime, CTX, 上海新亚药业有限公司 ); 68

69 头孢他啶 (ceftazidime, CAZ, 葛兰素公司 ) 四环素 (tetracycline, 中国药品生物制品检定所 ) 阿莫西林 (amoxicillin, 山东鲁抗医药有限公司 ) 环丙沙星 (ciprofloxacin, 广州白云山侨光制药有限公司 ) Nitrocefin ( 英国 Glaxo 研究所 ) HEPES(Sigma 公司 ) RNase A( 上海生工 ) 引物合成 VIMF/VIMR,IMP1F/ IMP1R,IMP2F/ IMP2R, Int1F/IMP2R 引物序列及扩增条 件同第三章 2. 实验方法 2.1 细菌复苏和培养 同第三章 2.2 MIC 测定 采用微量稀释法测定对青霉素 G 氨苄西林 阿莫西林 头孢呋辛 头孢他啶 头孢拉啶 头孢噻肟 头孢唑啉 亚胺培南 美罗培南 氨曲南 四环素和环丙沙星的 MIC 值 2.3 金属酶表型检测 方法同第三章 2.4 DNA 提取 煮裂法提取细菌 DNA, 方法同第一部分 69

70 2.5 质粒 DNA 提取 采用碱裂解法提取 : 取过夜培养的菌液 1.5ml,12000r/min 离心 1 分钟, 去上清 ; 加入 solution I 100µl, 剧烈震荡使沉淀充分悬浮, 随即加入 solution II 100µl, 轻轻混匀, 冰上静置 2 分钟 ; 加入 solution III 100µl, 盖紧管盖后上下颠倒混匀 5 次, 冰上静置 3 分钟,12000r/min 离心 5 分钟 ; 取上清, 加入 2 倍体积 95% 乙醇, 室温静置 2 分钟,12000r/min 离心 5 分钟 ; 去上清, 沉淀用 70% 乙醇 (4 预冷 )1ml 洗涤,12000r/min 离心 2 分钟 ; 去上清, 用灭菌滤纸条吸干管壁上的水滴, 敞开管盖, 室温放置 15min 以蒸发痕量乙醇, 加入含 RNase A (20μg/ml) 水溶解即为提取的质粒 DNA 2.6 PCR 扩增 VIMF/VIMR,IMP1F/ IMP1R, IntI1F / IntI1R IMP2F/ IMP2R, Int1F/IMP2R 引物扩增, 模板为细菌总 DNA 和质粒 DNA, 条件同前 2.7 克隆 测序及序列分析 方法同第二章, 阳性克隆株送广州英骏公司测序 将测序结果与 GenBank 数 据库中的核苷酸序列进行比对分析 ( 2.8 酶粗提液的提取 过夜培养的菌落接种 LB 肉汤再度过夜培养, 以 比例转种于 50 ml LB 液体培养基中,35 震摇 5h, r/ min, 离心 10min, 去上清液, 沉淀用 1 ml 50mM HEPES 缓冲液 (ph 7.0) 洗涤后, r/ min 离心 10min 去上清, 沉淀用 1 ml 50mM HEPES 缓冲液 (ph 7.0) 混匀 冰水浴中超声破碎仪破碎, 参数为 :200 W, 每次超声 2s, 间隔 2s, 共超声 5 min 结束后 4,12 000r/min 离心 60min, 取上清液,-20 保存备用 2.9 确定各底物的最佳测定波长 70

71 以 50mM HEPES 缓冲液 (ph 7.0) 配制 6 种 β- 内酰胺类抗生素溶液, 使药物终浓度为 10-4 M 参照文献 [1-3], 确定各底物的最佳测定波长分别为 : 青霉素钠盐 235nm, 头孢噻肟 257nm, 头孢他啶 255nm, 亚胺培南 299nm, 美罗培南 299nm, 氨曲南 295nm 2.10 酶稳定性测定 取 2ml 50mM HEPES 缓冲液 (ph 7.0) 加入粗提酶液 20µl 作为空白对照管, 取 50mM HEPES 缓冲液 (ph 7.0) 配制的浓度为 10-4 M 的抗生素底物 2ml, 加入粗提酶液 20µl 作为反应管, 快速混匀后测定酶与底物作用 0 时间的 OD 值 ( OD 1), 置 37 恒温水浴反应 2h 后, 再次测定酶与底物作用 2h 的 OD 值 (OD 2), 根据反应前后 OD 值的变化计算酶对各种底物的水解率 酶对抗生素的水解率 =(OD 1-OD 2)/OD 1 100%, 以青霉素的水解率为 100%, 分别计算其他抗生素的相对水解率, 酶稳定性试验重复 3 次, 以其 OD 值之均数计算相对水解率 3. 结果 3.1 临床资料 患者,71 岁, 男性, 临床诊断 : 脑梗塞,II 型糖尿病并高渗昏迷并发肺部感染 该菌系入院第二天从病人痰液中分离得到 入院后所用抗生素为 : 哌拉西林钠 / 舒巴坦钠, 头孢哌酮钠 / 舒巴坦钠及莫西沙星治疗 治疗后病人肺部感染控制, 症状明显好转 3.2 药敏结果 药敏结果显示, 铜绿假单胞菌 对多种抗生素耐药, 其中对 β- 内酰胺 类抗生素包括碳青霉烯类抗生素均高度耐药, 仅对环丙沙星敏感 具体结果见表 71

72 5-1 表 菌株对抗生素的耐药性 Table 5-1 Susceptibilities of Pseudomonas aeruginisa 抗生素 MIC(μg/ml) 抗生素 MIC(μg/ml) 青霉素 G >512 头孢唑啉 >512 氨苄西林 >512 亚胺培南 64 阿莫西林 512 美罗培南 256 头孢呋辛 >512 氨曲南 64 头孢他啶 >512 四环素 32 头孢拉啶 >512 环丙沙星 4 头孢噻肟 金属酶表型检测 从图可以看出, 单用 IMP 纸片的抑菌圈为 6mm, 而在距 IMP 纸片 13mm 处加 一含 2-MPA 纸片后, 抑菌圈明显扩大, 达 11mm 2-MPA IMP 纸片 IMP 纸片 图 5-1 金属酶检测阳性结果 Figure 5-1 The results of 2-MPA disk synergy test 3.4 质粒提取 电泳结果显示铜绿假单胞菌 存在一个大小约为 20kb 左右的质粒 ( 见 图 5-2) 72

73 15000bp 图 5-2 铜绿假单胞菌 质粒电泳图 Figure 5-2 Agarose gel electrophoresis of plasmid 3.5 PCR 扩增结果 VIMF/VIMR 和 IMP1F/ IMP1R 扩增结果均为阴性, IntI1F / IntI1R,IMP2F/ IMP2R, Int1F/IMP2R 引物扩增细菌总 DNA 和质粒 DNA, 扩增结果均阳性, 见图 bp 1000bp 750bp 500bp 250bp M 图 5-3 PCR 产物电泳图 Figure 5-3 Agarose gel electrophoresis of PCR product M,DNA marker DL2000;Lane1, PCR product with primer IntI1F and IntI1R; Lane2, PCR product with primer IMP2F and IMP2R;Lane3,PCR product with primer Int1F and IMP2R 3.5 测序结果 Int1F/IMP2R 引物扩增产物阳性克隆株测序比对结果如下 : gb AF AF Klebsiella pneumoniae plasmid pekp integron In73 DNA integrase form delta 1 (inti1delta1), metallo-beta -lactamase IMP-8 (blaimp-8), aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase (aac6'-ib), chloramphenicol acetyltransferase (catb4), and ethidium 73