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中南大学学报 ( 医学版 ) J Cent South Univ (Med Sci) 217, 42(6) http://www.csumed.org 65 ARTICLES 论著 DOI:1.11817/j.issn.1672-7347.217.6.1 www.csumed.org/xbwk/fileup/pdf/217665.

1 中南大学学报 ( 医学版 ) J Cent South Univ (Med Sci) 217, 42(6) 65 ARTICLES 论著 DOI: /j.issn MiR-53 靶向 bcl-2 增强细胞对顺铂的敏感性 1, 杨晓燕 2, 殷杰 1, 向琼 3, 谢红艳 1, 虞佳 3 2,, 甘润良 4 2, 3, 雷小勇 ( 南华大学 1. 生物研究所 ;2. 湖南省分子靶标新药研究协同创新中心 ;3. 药物药理研究所 ; 4. 肿瘤研究所, 湖南衡阳 4211 ) [ 摘要 ] 目的 : 探讨 mir-53 是否能通过调控 bcl-2 的表达增强细胞对顺铂的敏感性方法 : 采用实时荧光定量 PCR 检测肝癌细胞中 mir-53 和 bcl-2 mrna 的表达水平 ;Western 印迹观察肝癌细胞中 Bcl-2 蛋白的表达水平 ; 脂质体转染法将 mir-53 模拟物瞬时转染至细胞 ; 生物信息学软件预测 mir-53 潜在靶基因 ; 双荧光素酶活性验证 mir-53 潜在的靶位点 ;MTT 法检测细胞药物敏感性的改变结果 : 相比于 HL-772 细胞,miR-53 在细胞中表达水平下调,Bcl-2 蛋白的表达水平上调 ;mir-53 能够与 bcl-2 靶向结合, 下调 bcl-2 的表达 ;mir-53 转染组的细胞活力较 mirna 阴性对照组显著降低结论 :MiR-53 可能通过靶向 bcl-2 增强细胞对顺铂的药物敏感性, 抑制肝癌细胞增殖 [ 关键词 ] MiR-53;bcl-2; 细胞 ; 顺铂 MiR-53 sensitizes human hepatocellular carcinoma cells to cisplatin by targeting bcl-2 YANG Xiaoyan 1, 2, YIN Jie 1, XIANG Qiong 3, XIE Hongyan 1, YU Jia 3, GAN Runliang 2, 4, LEI Xiaoyong 2, 3 ( 1. Institute of Biologic Research; 2. Hunan Province Cooperative Innovation Center for Molecular Target New Drug Study; 3. Institute of Pharmacy and Pharmacology; 4. Cancer Research Institute, University of South China, Hengyang Hunan 4211, China ) ABSTRACT Objective: To investigate effects of mir-53 on cisplatin sensitivity in cells by targeting of bcl-2. Methods: MiR-53 and bcl-2 mrna expression levels in hepatocellular carcinoma cells were measured by real-time quantitative (qrt)-pcr; Bcl-protein level was detected by Western blot; mir-53 mimics were transiently transfected to the cells by liposome transfection; potential target genes of mir-53 were predicted by Bioinformatics software; mir-53 potential 收稿日期 (Date of reception): 第一作者 (First author): 杨晓燕, yyangxiaoyan@163.com 通信作者 (Corresponding author): 甘润良, ganrunliang@163.com; 雷小勇, @qq.com 基金项目 (Foundation item): 国家自然科学基金 ( ); 湖南省教育厅科学研究项目 (17C142,14C998); 湖南省研究生创新项目 (CX215B386) This work was supported by the National Natural Science Foundation ( ), the Scientific Research Fund of Hunan Provincial Education Department (17C142, 14C998), and Hunan Provincial Graduate Innovative Foundation (CX215B386), China.

2 66 中南大学学报 ( 医学版 ), 217, 42(6) targets were validated by dual luciferase activity; and the cell viability was measured by MTT assay. Results: MiR-53 level was down-regulated and Bcl-2 protein expression level was up-regulated in cells compared with HL-772 cells. MiR-53 could interact with bcl-2 and inhibit its expression. Cell vitality with mir-53 transfection was significantly reduced compared to that in the negative control. Conclusion: MiR-53 may enhance the sensitivity of cells to cisplatin and inhibit the cell proliferation by targeting bcl-2. KEY WORDS mir-53; bcl-2; cells; cisplatin 原发性肝癌是全球范围内发病率高且最为常见的恶性肿瘤之一, 其病死率居全球恶性肿瘤的第 2 位 [1] 顺铂是临床上治疗原发性肝癌的一线化学治疗 ( 化疗 ) 药物, 但是耐药是化疗失败的主要原因之一 [2] 因此, 在肝癌的化疗方面如何提高肿瘤对化疗药物的敏感性及增强药物疗效, 具有重要意义 MiRNA 是一类小的非编码单链 RNA 分子, 长度为 21~25 个核苷酸, 通过碱基互补配对的方式识别靶 mrna, 并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶 mrna 或者阻遏靶 mrna 的翻译 [3-4] MiRNA 参与作用肿瘤细胞增殖和耐药的过程 [5] MiRNA- 53(miR-53) 通过调控胰岛素样生长因子 -1 受体 (insulin-like growth factor 1 receptor,igf-1r) 的表达进而抑制肝癌细胞增殖, 促进凋亡 [6] ;MiR-53 亦可通过靶向作用人蛋白精氨酸甲基转移酶 -1(human protein arginine methyltransferase 1,PRMT1) 进而抑制肝癌细胞的转移 [7] ; 此外,MiR-53 通过靶向纤维生长因子 -2(fibroblast growth factor 2,FGF2) 和血管内皮生长因子 A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA) 基因抑制肿瘤血管生成和生长 [8] : 因此,MiR-53 作为抑癌基因在肿瘤发生发展中起重要作用, 它可能是肿瘤治疗的潜在靶点本研究拟探讨 mir-53 是否能够通过靶向作用 bcl-2, 增强肝癌细胞对顺铂的敏感性, 进而抑制肝癌细胞增殖, 从而为临床的靶向治疗提供理论依据和新思路 1 材料与方法 1.1 材料人正常肝细胞 HL-772 与人肝癌细胞株细胞分别购自上海盈公实业有限公司和中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库 ;RPMI 164 粉末培养基购自美国 Gibco 公司 ; 胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品 ; 脂质体 Lipofectamine TM 2 为美国 Invitrogen 产品 ; 实时荧光定量 PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR) 试剂盒双荧光素酶报告基因检测试剂盒和双荧光报告载体 psichecktm-2 购自美国 Promega 公司 ;PCR 扩增体系购于上海博瑟生物科技有限公司 ;MiR-53 模拟物及阴性对照购于上海吉玛制药技术有限公司 ; 顺铂购于上海研生生化试剂有限公司 ;MTT 为美国 Sigma 公司产品 ;β-actin 和 Bcl-2 抗体购自美国 Cell Signaling Technology(CST) 公司 ; Millipore-Immobilon ECL 发光液购于上海优宁维生物科技股份有限公司 1.2 方法细胞培养将人正常肝细胞 (HL-772) 与人肝癌细胞 (BEL- 742) 分别培养于含 1% 胎牛血清的 RPMI 164 溶液中, 置于 37,5% 二氧化碳培养箱中, 细胞经传代和收集, 取对数生长期细胞进行实验 MiR-53 模拟物转染细胞细胞转染 : 根据脂质体 Lipofectamine TM 2 产品说明书进行取对数期细胞接种于 6 孔板, 个 / 孔, 待细胞生长至占孔面积约为 8% 时进行转染弃去旧培养基, 用 PBS 缓冲液洗涤细胞 3 次制备 mir-53 模拟物 ( 或阴性对照 )/ 脂质体复合物,6 孔板每孔试剂用量如下 : 取 1 µl 脂质体至 1 µl 优化培养基 (OPTI_MEM) 中充分混匀, 于室温静置 5 min; 同时取 4 µl mir-53 模拟物 ( 或阴性对照 ) 至 1 µl 优化培养基 (OPTI_MEM) 中混匀, 于室温静置 5 min; 用移液枪将两种混合物轻轻混合至均匀, 于室温静置 2 min, 此即为 mir-53 模拟物 ( 或阴性对照 )/ 脂质体复合物用移液枪将 mir-53 模拟物 ( 或阴性对照 )/ 脂质体复合物轻滴入到孔中, 于 37 培养箱培育 6 h 后, 每孔补加 1 µl 完全培养基 ( 含 1% 胎牛血清的 RPMI 164 培养液 ) 培养细胞转染 48 h 后检测 bcl-2 mrna 与蛋白及 mir-53 的表达 qrt-pcr 检测肝癌细胞中 mir-53 表达水平采用 qrt-pcr 检测 HL-772 与细胞中 mir-53 及细胞转染后 bcl-2 mrna 表达水平采用 RNA 提取试剂盒提取细胞总 RNA, 反转录实验流程参照 RT-PCR 试剂盒的说明书进行,PCR 反应体系按照说明书要求分别加入引物 U6 和 hsa-

MiR-53 靶向 bcl-2 增强细胞对顺铂的敏感性杨晓燕, 等 67 mir-53, 反应条件均为 :95,1 min;4 个 PCR 循环 (95,15 s;6,6 s, 收集荧光 ) 为了建立 PCR 产物的熔解曲线, 扩增反应结束后 95, 2 min;6,2 s;99,1 s, 并从 6 缓慢加热到 99 (8 min) HL-772 细胞与细胞样品中的 mir-53 和内参

3 MiR-53 靶向 bcl-2 增强细胞对顺铂的敏感性杨晓燕, 等 67 mir-53, 反应条件均为 :95,1 min;4 个 PCR 循环 (95,15 s;6,6 s, 收集荧光 ) 为了建立 PCR 产物的熔解曲线, 扩增反应结束后 95, 2 min;6,2 s;99,1 s, 并从 6 缓慢加热到 99 (8 min) HL-772 细胞与细胞样品中的 mir-53 和内参 (U6) 分别进行 qrt-pcr 反应采用 2 ΔΔCt 法对数据进行统计分析 Western 印迹检测肝癌细胞中 Bcl-2 蛋白表达水平瞬时转染细胞 48 h 后, 弃去培养液, 收集细胞, 加入细胞裂解液, 离心后取上清采用 BCA 蛋白定量试剂盒进行定量然后, 进行 1% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,sds-page), 待溴酚蓝至分离胶下缘时停止电泳, 随后将样品蛋白湿转至.22 µm 聚偏二氟乙烯膜 (polyvinylidene fluoride,pvdf) 上, 加脱脂牛奶置室温封闭 1 h, 加入 1:1 稀释一抗, 于 4 孵育过夜, 以洗膜缓冲液 (Tris buffered saline tween, TBST) 清洗 1 min, 共 3 遍, 于 37 稀释孵育二抗 1 h (1:4 ); 以 TBST 清洗 15 min, 共 3 遍采用 Millipore- Immobilon ECL 发光液进行显色, 采用 Kodak IS2R 图像检测系统进行化学发光检测并保存数据 MTT 检测细胞对顺铂药物敏感性变化待细胞呈指数式生长, 取细胞接种于 96 孔板, 个 / 孔, 接种 12 h 后, 进行质粒转染,96 孔板每孔试剂加入量如下 : 取 1 µl 脂质体至 1 µl 优化培养基 (OPTI_MEM) 中, 混匀充分, 于室温静置 5 min; 同时取.4 µl mir-53 模拟物 ( 或阴性对照 ) 至 1 µl 优化培养基 (OPTI_MEM), 混匀充分, 于室温放置 5 min; 然后, 将两种混合物均匀混合, 于室温静置 2 min 即得到 mir-53 模拟物 ( 或阴性对照 )/ 脂质体复合物置 37 培养箱培育 24 h 后, 每孔分别加入浓度为,.2,2,2,2 mg/l 顺铂的完全培养基 15 µl, 再培养 24 h 后加 MTT(5 g/l)2 µl/ 孔, 又培养 4 h, 弃去上清液, 加 DMSO 15 µl/ 孔, 用微量振荡器振摇 1 min 后, 在酶标仪 49 nm 波长下测光密度 (OD) 值根据公式计算细胞活力 =( 试验孔 OD 值空白孔 OD 值 )/( 对照孔 OD 值空白孔 OD 值 ) MiR-53 靶基因的预测采用 PicTar( [9], Targetscan( [1] 和 microrna.org( 等生物信息学软件预测 mir-53 的靶基因双荧光素酶活性检测将含有 mir-53 靶位点的 bcl-2 3'-UTR 插入荧光素酶基因编码区下游的报告基因载体 psi-check2, 构成 psi-check2-bcl-2-3'-utr(3'-utr bcl-2), 其与 mir- 53 模拟物或与阴性对照分别共转染细胞, 将突变型报告基因载体 psi-check2-bcl-2-3'-utr(3'- UTR mutbcl-2) 与 mir-53 模拟物或与阴性对照分别共转染入细胞采用双荧光素酶活性报告系统检测瞬时转染细胞的荧光素酶活性, 结果以萤火虫荧光素酶活性相对于海肾荧光素酶活性的比值表示 : 荧光素酶活性值 =[ 萤火虫荧光素酶活性 (F)/ 海肾荧光素酶活性 (R)] 样品 /[ 萤火虫荧光素酶活性 (F)/ 海肾荧光素酶活性 (R)] 对照 1.3 统计学处理所有实验数据采用均数 ± 标准差 ( x ± s ) 表示, SPSS 18. 软件进行统计, 组间比较采用单因素方差分析方差齐性检验, 并经 LSD-t 检验,P<.5 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 肝癌细胞中 mir-53 表达及 bcl-2 的表达水平 qrt-pcr 结果分析显示 : 细胞中 mir- 53 的表达比 HL-772 细胞显著下调 ( 图 1A) Western 印迹检测肝癌细胞中 Bcl-2 蛋白表达显示 : 与对照组相比, 肝癌细胞中 Bcl-2 蛋白表达明显增高 ( 图 1B) Relative expression of mir-53 (U6 as internal normalizers) 1..5 HL-772 A Bcl-2 β-actin HL-772 B 图 1 细胞与 HL-772 细胞中 mir-53(a) 和 Bcl-2 蛋白 (B) 表达水平 Figure 1 Expression of mir-53 (A) and Bcl-2 protein (B) in and HL-772 cells P<.5 vs HL-772 cells (n=3, x±s)

68 中南大学学报 ( 医学版 ), 217, 42(6) http://www.csumed.org 2.2 细胞转染 mir-53 后对 bcl-2 表达的影响与阴性对照组比较, 细胞转染 mir- 53 后表达量明显增加, 约为阴性对照组的 2.

4 68 中南大学学报 ( 医学版 ), 217, 42(6) 细胞转染 mir-53 后对 bcl-2 表达的影响与阴性对照组比较, 细胞转染 mir- 53 后表达量明显增加, 约为阴性对照组的 2.4 倍 ( 图 2A); 但 bcl-2 mrna 及蛋白表达降低 ( 图 2B,2C) Relative expression of mir-53 (U6 as internal normalizers) 1..5 Negative control MiR-53 mimic Negative control MiR-53 mimic 1. Bcl-2.5 β-actin A Negative control MiR-53 mimic B C Bcl-2/GAPD 图 2 细胞转染 mir-53 后对 Bcl-2 表达的影响 Figure 2 Effect of mir-53 overexpression on the Bcl-2 protein level in the hepatocellular carcinoma cells A: Expression level of mir-53 after transfection of mir-53; B: mrna level of bcl-2 after transfection of mir-53; C: Protein expression of bcl-2 after transfection of mir-53, P<.5 vs Negative control (n=3, x±s) 2.3 MiR-53 联合顺铂对细胞活力的影响转染 24 h 后, 再分别以.2,2,2 或 2 mg/l 顺铂处理各组细胞 24 h, 在每一相同浓度组中,miR-53 转染组与阴性对照组比较, 细胞活力降低 ( 图 3) 2.4 MiR-53 通过靶向作用 bcl-2 3'-UTR 抑制其表达运用 Targetscan 软件预测 mir-53 与其靶基因 bcl-2 3'-UTR 的结合位点 ( 图 4A) 与报告基因载体 psi-check2-bcl-2-3'-utr 共转染 mir-53, 细胞荧光素酶活性较共转染阴性对照显著降低 ; 若将 psimutcheck2-bcl-2-3'-utr 与 mir-53 共转染, 细胞荧光素酶活性无明显降低 ( 图 4B) Cell viability 1..5 图 3 MiR-53 联合顺铂处理对细胞活力的影响 Figure 3 Effect of mir-53 overexpression and combination with cisplatin on the cell activity in the hepatocellular carcinoma cells MiR-53 mimic was transfected and then cisplatin (.2, 2, 2, or 2 mg/l, respectively) was added into the cells. Cell activity of cells was measured by MTT assay. P<.5 vs Negative control (n=3, x±s) Negative control mir-53 mimic Concentration of cisplatin/(mg. L 1 ) 3'-UTR bcl-2 mrna mir-53 Conserved Position of Bcl-2 3'-UTR hsa-mir-53 PolyA 5' AAUAUCCAAUCCUGUGCUGCUAU 3'GACGUCUUGACAAGGGCGACGAU A Renilla/Firefly luciferase '-UTR bcl-2 P<.5 3'-UTR mutbcl-2 Negative control mir-53 mimic B 图 4 MiR-53 通过靶向作用 bcl-2 3'-UTR 抑制 bcl-2 的表达 Figure 4 MiR-53 inhibited bcl-2 expression through combination of bcl-2 3'-UTR A: Targetscan software predicted the binding sites of mir-53 and Bcl-2 3'-UTR; B: cells were contransfected with renilla luciferase constructs containing the Bcl-2 3'-UTR or mutbcl-2 3'-UTR and mir-53 mimic for 48 h. Luciferase activity was measured(n=3, x±s)

5 MiR-53 靶向 bcl-2 增强细胞对顺铂的敏感性杨晓燕, 等 69 3 讨论顺铂是原发性肝癌及其他恶性肿瘤化疗中使用最为广泛的药物, 但是由于肿瘤细胞原发或继发的耐药性, 化疗的效果不容乐观肿瘤细胞耐药性涉及细胞的多种生化改变, 包括药物的蓄积降低细胞内金属硫蛋白水平升高耐药相关基因表达升高以及 DNA 修复能力增强等 [11-12] 因此, 临床上单用顺铂对肿瘤细胞的疗效很差然而, 至今尚未发现一种在体内能够有效逆转顺铂耐药性的药物 MiRNA 突变或者异常表达与人类肿瘤发生相关 [13] ; mirna 特异性调控靶基因的作用方式, 可能为抗肿瘤治疗提供新的方法 [14] 本研究发现 mir-53 在肝癌细胞中的表达低于正常肝细胞, 而 bcl-2 在肝癌细胞中的表达高于正常肝细胞, 这提示 mir-53 可能通过调控 bcl-2 的表达, 参与调控原发性肝癌的发生本研究利用化学合成 mir-53 模拟物, 调整修复了细胞系中 mir-53 的表达水平结果表明经转染后,miR-53 能够降低细胞活力, 同时亦能增 [15-16] 加顺铂的敏感性最近的研究发现 :mir-53 通过调控 bcl-2 的表达逆转耐顺铂的肺癌细胞对顺铂的耐药 Bcl-2 蛋白在细胞存活和肿瘤发生过程中具有重要作用 [17-19] 原癌基因 bcl-2 最先在恶性 Burkitt 淋巴瘤中发现, 是细胞凋亡的关键调节因子 [2] 大多数化疗药物通过诱导细胞凋亡发生效应, 肿瘤细胞对凋亡的抵抗可能导致它对细胞毒药物的耐受然而, 本研究利用生物信息学软件分析发现 :Bcl-2 是 mir- 53 的潜在靶标, 而 bcl-2 基因不仅在细胞凋亡中发挥重要作用, 还在肿瘤耐药过程中发挥重要作用 [21-22] 因此, 笔者设想 mir-53 能否通过调控 bcl-2 表达水平而在化疗过程中发挥其作用在本研究中, mir-53 能够抑制 Bcl-2 蛋白的表达, 故推测 mir-53 可能通过靶向作用于 bcl-2 3'-UTR 而抑制 bcl-2 基因表达, 最终导致肝癌源性细胞凋亡本研究结果提示 mir-53 可能是抗肿瘤治疗的潜在靶点, 在抗肿瘤治疗及肿瘤化疗药物敏感性方面尤为重要 ;mir-53 能够增强对顺铂化疗药物的敏感性, 降低肝癌细胞活力, 可为肝癌的基因治疗提供新的途径为了进一步明确其增强化疗药物敏感性的具体机制, 还需要验证 mir-53 对其他多种化疗药物敏感性的影响以及进行体内成瘤动物实验, 为 mir-53 应用于临床奠定基础参考文献 [1] Llovet JM. Focal gains of VEGFA: candidate predictors of sorafenib response in hepatocellular carcinoma[ J]. Cancer Cell, 214, 25(5): [2] Liu XY, Liu SP, Jiang J, et al. Inhibition of the JNK signaling pathway increases sensitivity of hepatocellular carcinoma cells to cisplatin by down-regulating expression of P-glycoprotein[ J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 216, 2(6): [3] Han SY, Han HB, Tian XY, et al. MicroRNA-33a-3p suppresses cell migration and invasion by directly targeting PBX3 in human hepatocellular carcinoma[ J]. Oncotarget, 216, 7(27): [4] Hung CH, Chiu YC, Chen CH, et al. MicroRNAs in hepatocellular carcinoma: carcinogenesis, progression, and therapeutic target[ J]. Biomed Res Int, 214, 214: [5] Pink RC, Samuel P, Massa D, et al. The passenger strand, mir-21-3p, plays a role in mediating cisplatin resistance in ovarian cancer cells[ J]. Gynecol Oncol, 215, 137(1): [6] Xiao Y, Tian Q, He J, et al. MiR-53 inhibits hepatocellular carcinoma cell growth via inhibition of insulin-like growth factor 1 receptor[ J]. Onco Targets Ther, 216, 9: [7] Li B, Liu L, Li X, et al. mir-53 suppresses metastasis of hepatocellular carcinoma cell by targeting PRMT1[ J]. Biochem Biophys Res Commun, 215, 464(4): [8] Zhou B, Ma R, Si W, et al. MicroRNA-53 targets FGF2 and VEGFA and inhibits tumor angiogenesis and growth[ J]. Cancer Lett, 213, 333(2): [9] Kuhne DE, Martine MM, Feldman DS, et al. Experimental validation of mirna targets[ J]. Methods, 28, 44(1): [1] Welch C, Chen Y, Stallings RL. MicroRNA-34a functions as a potential tumor suppressor by inducing apoptosis in neuroblastoma cells[ J]. Oncogene, 27, 26(34): [11] Galluzzi L, Senovilla L, Vitale I, et al. Molecular mechanisms of cisplatin resistance[ J]. Oncogene, 212, 31: [12] Drayton RM, Catto JW. Molecular mechanisms of cisplatin resistance in bladder cancer[ J]. Expert Rev Anticancer Ther, 212, 12(2): [13] 周宁, 周洋, 唐勇, 等. MiR-519 通过调节 HuR 表达抑制胃癌细胞活力 [ J]. 中南大学学报 ( 医学版 ), 216, 41(1): ZHOU Ning, ZHOU Yang, TANG Yong, et al. MiR-519 inhibits gastric cancer cell activity through regulation of HuR expression[ J]. Journal of Central South University. Medical Science, 216, 41(1): [14] de Nigris F. Epigenetic regulators: Polycomb-miRNA circuits in cancer[ J]. Biochim Biophys Acta, 216, 1859(5): [15] 武毅, 郭丽丽, 刘京豪, 等. MiR-53 逆转肺癌耐药细胞株 A549/ DDP 的耐药性及其机制 [ J]. 中国肺癌杂志, 214, 17(1): 1-7. WU Yi, GUO Lili, LIU Jinghao, et al. The reversing and molecular mechanisms of mir-53 on the drug-resistance to cisplatin in A549/

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Microsoft Word - 360145.doc 项目批准号 81273814 归口管理部门申请代码收件日期 H2716 360145 y 国家自然科学基金委员会资助项目计划书资助类别 : 面上项目亚类说明 : 非连续资助类项目附注说明 : 项目名称 : 益气养肺法拮抗 bfgf 对肺癌微环境介导化疗