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妮解
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1 HEREDITAS (Beijing) , 33(8): ISSN 研究报告 DOI: /SP.J 白血病细胞中不同启动子驱动外源基因表达能力差异分析周雁, 黄秋花,,, 为了分析不同启动子在白血病细胞中驱动外源基因表达能力的差异, 文章选择了 4 种含不同启动子 EF1α PGK Ubiquitin 和 CMV 驱动的 GFP 报告基因的慢病毒载体, 用以感染 4 种不同的白血病细胞株 NB4 HL60 Kasumi 和 THP1, 利用荧光显微镜流式细胞仪和荧光定量 PCR 的方法检测其 GFP 表达效率, 发现 EF1α 启动子驱动 GFP 表达的能力最强, CMV 最弱, PGK 和 Ubiquitin 则介于两者之间该结果提示在白血病细胞中研究基因功能时, 应根据不同的研究需求选择最为合适的启动子启动子 ; GFP 报告基因 ; 慢病毒载体 ; 白血病细胞 Exploration of the variance in exogenous gene expression driven by the different promoters in leukemia cells ZHOU Yan, HUANG Qiu-Hua State Key Laboratory of Medical Genomics, Shanghai Institute of Hematology, Ruijin Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai , China Abstract: To investigate the variance in exogenous gene expression driven by the different promoters in leukemia cells, four GFP reporter lentivirus vectors carrying different promoters, including EF1α, PGK, Ubiquitin and CMV, were selected. Leukemia cell lines NB4, THP1, HL60 and Kasumi were infected with lentivirus produced from these reporter vectors, respectively. Then, fluorescence microscope, flow cytometry and fluorescence quantitative PCR were used to detect the GFP expression strength. The results of this study clearly showed that the expression levels of the reporter genes with four different promoters were significantly different. Among them, EF1α drove the highest level of GFP expression, while CMV promoter induced the lowest level. Our results suggested that promoters should be carefully chosen in order to get the appropriate exogenous expression level in leukemia cells according to the study need. Keywords: promoters; GFP reporter gene; lentivirus vectors; leukemia cells,, DNA 收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : (973 ) ( 2009CB825604) 作者简介 :,, asheley_joe1203@126.com 通讯作者 :,,, HQH10632@rjh.com.cn

2 880 HEREDITAS (Beijing) UTR,,,, RNA, 3, rrna (I ) mrna ( ) trna ( ), I, ;, (CMV) [1] CAG ( CMV β- ) [2] (EF1α) [3] (PGK) [4] (Ubiquitin) [5,6], CMV,, CMV,, CMV [3],,,,,,, Western blotting (GFP),, 细胞株 (NB4) (Kasumi) (HL60) (THP1), 10% RPMI1640 (Gibco) 慢病毒包装并感染细胞 EF1α PGK Ubiquitin CMV 4 GFP NB4 Kasumi HL60 THP1, CMV SBI, 引物 Invitrogen GAPDH: F: GAAGGTGAAGGTCGGAGTC, R: GAAGATGGTGATGGGATTTC; GFP: F: ACGTAAACGGCCACAAGTTC, R: AA GTCGTGCTGCTTCATGTG 流式细胞仪分析感染细胞的 GFP 表达强度 NB4 THP1 HL60 Kasumi ( ), 72 h, , 800 r/min 5 min,, 1 PBS 1, 200 μl 1 PBS, GFP, FlowJo GFP (Geometric Mean) 荧光定量 PCR 检测感染细胞中 GFP 的 mrna 表达水平 NB4 Trizol (Invitrogen) RNA, 1 μg RNA cdna, 5 ng cdna PCR(TaKaRa) GFP (GAPDH), 全反式维甲酸 (ATRA) 处理慢病毒感染的 NB4 细胞 6 5 NB4,

3 8 : h 48 h 24 h 12 h 0 h 10-6 mol/l ATRA(Sigma), 72 h GFP GFP NB4 GFP NB4, 1 72 h, GFP EF1α 95%; PGK 92%; Ubiquitin 81%; CMV 82%, 4 NB4 ( 2A) 4,, EF1α, CMV, PGK Ubiquitin ( 2B),, GFP ( 2C), GFP, EF1α 482; PGK 199; Ubiquitin 172; CMV 73,, PCR GFP mrna, (GAPDH Ct ), 4 NB4, EF1α, CMV ( 2D) 2.2 GFP NB4 Hong [3] CMV, CMV NB4, NB mol/l ATRA, (0 h 12 h 24 h 48 h 72 h)gfp, CMV NB4 ( 3A), EF1α PGK Ubiquitin, GFP ( 3B) CMV NB4 GFP,,, 2.3 GFP GFP NB4,, 4 THP1 HL60 Kasumi 72 h GFP, GraphPad Prism 5 NB4, EF1α, CMV, PGK Ubiquitin ( 4) 3,, 图 1 慢病毒载体结构示意图

882 图2 HEREDITAS (Beijing) 2011 第 33 卷不同启动子在 NB4 细胞中驱动基因表达能力的检测 A: 流式检测含不同启动子慢病毒感染 NB4 细胞的效率散点图右象限 GFP 阳性比例表示感染效率; B: 荧光显微镜下观察慢病毒载体介导的不同启动子驱动 GFP 表达的效率( 100); C: 流式检测慢病毒载体介导的不同启动子驱动 GFP 表达的效率

4 882 图2 HEREDITAS (Beijing) 2011 第 33 卷不同启动子在 NB4 细胞中驱动基因表达能力的检测 A: 流式检测含不同启动子慢病毒感染 NB4 细胞的效率散点图右象限 GFP 阳性比例表示感染效率; B: 荧光显微镜下观察慢病毒载体介导的不同启动子驱动 GFP 表达的效率( 100); C: 流式检测慢病毒载体介导的不同启动子驱动 GFP 表达的效率直方图横坐标表示 GFP 荧光信号强度; D: 荧光定量 PCR 检测慢病毒载体介导的不同启动子驱动 GFP 表达的效率柱状图以 EF1α 驱动的 GFP mrna 表达水平为参照, 各数值表示其 3 次重复实验的表达均值和标准差的细胞株, 特别是针对一些难转染的细胞株如原代感染系统, 并且利用一些组成型启动子来驱动外源细胞干细胞造血细胞等, 我们通常会选择病毒基因的表达, 其中 CMV 是最常用的组成型启动子[7,8]

第8期图3 周雁等: 白血病细胞中不同启动子驱动外源基因表达能力差异分析 883 不同启动子在不同分化阶段的 NB4 细胞中驱动基因表达能力的检测 A: 荧光显微镜下观察慢病毒载体介导的 CMV 启动子在 10 6 mol/l ATRA 诱导后的不同分化阶段 NB4 细胞中驱动 GFP 表达的能力差异( 100); B: 流式检测慢病毒载体介导的不同启动子在 10 6 mol/l ATRA

5 第8期图3 周雁等: 白血病细胞中不同启动子驱动外源基因表达能力差异分析 883 不同启动子在不同分化阶段的 NB4 细胞中驱动基因表达能力的检测 A: 荧光显微镜下观察慢病毒载体介导的 CMV 启动子在 10 6 mol/l ATRA 诱导后的不同分化阶段 NB4 细胞中驱动 GFP 表达的能力差异( 100); B: 流式检测慢病毒载体介导的不同启动子在 10 6 mol/l ATRA 诱导后的不同分化阶段 NB4 细胞中驱动 GFP 表达的能力差异然而很多研究证实在不同细胞中, CMV 启动子驱动 [3,9,10] 子驱动 GFP 基因表达能力最强, Ubiquitin 和 PGK 次本研究也同之, 而 CMV 最弱产生这一现象的原因是首先可样发现在 NB4 细胞中, CMV 启动子驱动 GFP 报告基能与 NB4 细胞中能够识别不同启动子序列的一些反因表达的强度较 EF1α PGK 和 Ubiquitin 都弱, 这式作用因子表达水平不一致相关, CMV 启动子序列种现象在我们选择的其他几种白血病细胞株中也得中含有 NFκB 结合位点, NF 位点可以明显增强到类似的结果因此在目的细胞中研究基因功能时, CMV 启动子的表达水平 [11], 而 Ubiquitin 启动子则选择合适的启动子驱动目的基因的表达显得尤为含有比较多造血细胞特异性的转录因子识别序列 [12], 重要因此在 NB4 细胞中, 这些反式作用因子表达水平的外源基因表达并非是最好的选择真核基因的表达调控是一个复杂动态的过程, 差异可能是引起 GFP 表达强度差异的一个原因; 其在转录起始转录延伸和转录终止的循环中, 每一次可能与启动子的种属特异性相关, CMV 启动子来个细节都受到精细而复杂的调控基因启动子在转源于病毒, 相对与内源性的启动子, 在哺乳动物细录起始过程中发挥重要的调控作用, 它们能够被很胞中 CMV 表达可能更易于受到细胞内沉默机制的多反式作用因子识别, 在不同细胞中, 同一个启动影响 [13], 虽然在很多细胞中 CMV 驱动基因的表达子因相互作用的反式作用因子不同, 基因的表达水强度最强, 然而越来越多的实验结果表明 CMV 启平也不同; 而在同一细胞中, 相同反式作用因子对动子并不能驱动外源基因在机体组织中长期持续表不同启动子的识别序列不一致, 开启转录起始的能达[14~16]; 第三, 不同启动子在细胞中的表观遗传学修力也并不一致我们在 NB4 细胞中发现 EF1α 启动饰状态也可能导致其驱动基因表达能力存在差异 [17],

6 884 HEREDITAS (Beijing) 图 4 不同启动子在 NB4 THP1 HL60 和 Kasumi 细胞中驱动基因表达的能力检测 GFP, 3 CMV CpG motif, CMV [12], DNA NB4, CMV, Hong [3], ATRA NB4, NFκB, CMV, NB4, EF1α,, ; CMV,,,,,,, 参考文献 (References): [1] Ikawa M, Tanaka N, Kao WWY, Verma IM. Generation of transgenic mice using lentiviral vectors: a novel preclinical assessment of lentiviral vectors for gene therapy. Mol Ther, 2003, 8(4): [2] Pfeifer A, Ikawa M, Dayn Y, Verma IM. Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(4): [3] Hong S, Hwang DY, Yoon S, Isacson O, Ramezani A, Hawley RG, Kim KS. Functional analysis of various promoters in lentiviral vectors at different stages of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Mol Ther, 2007, 15(9): [4] Ritchie WA, Neil C, King T, Whitelaw CBA. Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors. Transgenic Res, 2007, 16(5): [5] Schorpp M, Jäger R, Schellander K, Schenkel J, Wagner EF, Weiher H, Angel P. The human ubiquitin C promoter directs high ubiquitous expression of transgenes in mice. Nucleic Acids Res, 1996, 24(9): [6] Lois C, Hong EJ, Pease S, Brown EJ, Baltimore D. Germ-

7 8 : 885 line transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science, 2002, 295(5556): [7] Keating A, Horsfall W, Hawley RG, Toneguzzo F. Effect of different promoters on expression of genes introduced into hematopoietic and marrow stromal cells by electroporation. Exp Hematol, 1990, 18(2): [8] Muller SR, Sullivan PD, Clegg DO, Feinstein SC. Efficient transfection and expression of heterologous genes in PC12 cells. DNA Cell Biol, 1990, 9(3): [9] Chung SM, Andersson T, Sonntag KC, Björklund L, Isacson O, Kim KS. Analysis of different promoter systems for efficient transgene expression in mouse embryonic stem cell lines. Stem Cells, 2002, 20(2): [10] Mao G, Marotta F, Yu J, Zhou L, Yu Y, Wang L, Chui D. DNA context and promoter activity affect gene expression in lentiviral vectors. Acta Biomed, 2008, 79(3): [11] Laegreid A, Medvedev A, Nonstad U, Bombara MP, Ranges G, Sundan A, Espevik T. Tumor necrosis factor receptor p75 mediates cell-specific activation of nuclear factor kappa B and induction of human cytomegalovirus enhancer. J Biol Chem, 1994, 269(10): [12] Yew NS, Przybylska M, Ziegler RJ, Liu DP, Cheng SH. High and sustained transgene expression in vivo from plasmid vectors containing a hybrid ubiquitin promoter. Mol Ther, 2001, 4(1): [13] Gill DR, Smyth SE, Goddard CA, Pringle IA, Higgins CF, Colledge WH, Hyde SC. Increased persistence of lung gene expression using plasmids containing the ubiquitin C or elongation factor 1α promoter. Gene Ther, 2001, 8(20): [14] Guo ZS, Wang LH, Eisensmith RC, Woo SL. Evaluation of promoter strength for hepatic gene expression in vivo following adenovirus-mediated gene transfer. Gene Ther, 1996, 3(9): [15] Löser P, Jennings GS, Strauss M, Sandig V. Reactivation of the previously silenced cytomegalovirus major immediate-early promoter in the mouse liver: involvement of NFkappaB. J Virol, 1998, 72(1): [16] Yew NS, Wysokenski DM, Wang KX, Ziegler RJ, Marshall J, McNeilly D, Cherry M, Osburn W, Cheng SH. Optimization of plasmid vectors for high-level expression in lung epithelial cells. Hum Gene Ther, 1997, 8(5): [17] Kuriyama S, Sakamoto T, Kikukawa M, Nakatani T, Toyokawa Y, Tsujinoue H, Ikenaka K, Fukui H, Tsujii T. Expression of a retrovirally transduced gene under control of an internal housekeeping gene promoter does not persist due to methylation and is restored partially by 5-azacytidine treatment. Gene Ther, 1998, 5(10): ˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇˆˇ 综合信息 2011 年第 8 期遗传封面说明,,,,,,,,,,,,, ( ) DNA RNA,,,,,, ( 杨旭, 王俊 )

Syngene GBOXHR Retsch MM400 KQ DE Eppendorf Table 1 The sources of Astragali Radix and Hedysarum Radix No. 1 AMM2011_NMGTY Astr

Syngene GBOXHR Retsch MM400 KQ DE Eppendorf Table 1 The sources of Astragali Radix and Hedysarum Radix No. 1 AMM2011_NMGTY Astr PCR 龙平, 崔占虎, 李虔全, 徐建平, 张春红, 周立社 * *, 李旻辉 ( 包头医学院, 内蒙古包头 014060) DNA 30 28 DNA trnl-trnf PCR PCR 136 bp 323 bp 10% PCR PCR Astragalus membranaceus Fisch. Bge. var. mongho- licus Bge. Hsiao A. membranaceus