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1 1310 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2014, 49 (9): 阿莫西林 氨苄西林混合降解杂质对照品的研究与应用 李 玮 1, 张伟清 2, 李翔 1, 胡昌勤 2* (1. 安徽省食品药品检验所, 安徽合肥 ; 2. 中国食品药品检定研究院, 北京 ) 摘要 : 采用控速强制降解条件, 获得阿莫西林和氨苄西林的目标杂质, 优化了制备工艺, 研制了混合杂质对照品 并采用质谱法和单体对照品对照, 鉴别了对照品中各主要杂质 该混合杂质对照品供中国药典中阿莫西林和氨苄西林有关物质项下系统适用性检查使用, 可有效评价色谱体系对各杂质的分离效能 ; 利用系统适用性对照品中各杂质的色谱保留和光谱信息, 可准确定位样品中的主要杂质, 优于欧美药典同品种项下方法 为 HPLC 方法快速准确归属多个杂质色谱峰提供了新的思路, 并为分析样品杂质来源 评价样品质量提供参考 关键词 : 阿莫西林 ; 氨苄西林 ; 系统适用性 ; 混合降解杂质 ; 对照品中图分类号 : R917 文献标识码 : A 文章编号 : (2014) Development and application of reference materials containing mixed degradation products of amoxicillin and ampicillin LI Wei 1, ZHANG Wei-qing 2, LI Xiang 1, HU Chang-qin 2* (1. Anhui Institute for Food and Drug Control, Hefei , China; 2. National Institutes for Food and Drug Control, Beijing , China ) Abstract: Reference materials containing mixed degradation products of amoxicillin and ampicillin were developed after optimization of preparation processes. The target impurities were obtained by controlled stress testing, and each major component was identified with HPLC-MS and compared with single traceable reference standard each. The developed reference materials were applied to system suitability test for verifying HPLC system performed in accordance with set forth in China Pharmacopeia and identification of major impurities in samples based on retention and spectra information, which have advantages over the methods put forth in foreign pharmacopoeias. The development and application of the reference materials offer an effective way for rapid identification of impurities in chromatograms, and provide references for analyzing source of impurities and evaluation of drug quality. Key words: amoxicillin; ampicillin; system suitability; mixed degradation product; reference material 药物中的杂质与药物的安全性 有效性密切相 关 人用药品注册技术要求国际协调会 (ICH) 制定 的指导原则 英国药典 (BP) 欧洲药典 (EP) 美国 药典 (USP) 和中国药典 (ChP) 的通则中均设有关 于杂质控制的指导原则 杂质控制的理念, 已经逐渐 收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 国家 重大新药创制 科技重大专项 (2011ZX ). * 通讯作者 Tel: , Fax: , hucq@nicpbp.org.cn [1, 转变为杂质谱的控制 2], 其核心就是对药品中的每一个杂质依据其特性分别进行控制 HPLC 分析中理想的定性定量方法是利用化学对照品 但药品的杂质种类众多 来源复杂且不稳定, 单体杂质对照品的制备过程需要耗费大量的人力 物力 目前在各国药典中, 采用原位降解技术 (in situ) [3], 或利用相对保留时间定位是 HPLC 杂质控制方法中的常用策略 然而, 不同实验室由于实验条件的差异可造成色谱峰相对保留时间的改变 [4] ; 原位降解过程繁琐 产生杂质有

2 李玮等 : 阿莫西林 氨苄西林混合降解杂质对照品的研究与应用 1311 限且重现性较差 ; 使得许多药典方法在执行中遇到 困难 如何有效地对多个杂质快速进行归属, 一直是 药品质控中亟待解决的热点问题 阿莫西林和氨苄西林均为 β- 内酰胺类抗生素, 在 BP [5] EP [6] USP [7] 和 ChP [8] 中均采用 HPLC 法控 制多个特定杂质 ( 图 1), 但应用中也常遇到无法进行 准确峰归属等问题 本文依据阿莫西林和氨苄西林的 降解反应途径 [9], 首次建立了阿莫西林和氨苄西林混 合降解杂质对照品 ( 即中国药典中阿莫西林和氨苄 西林项下所述的 系统适用性对照品 ), 用于对药 典中原料 制剂的多个主要特定杂质实现快速定位, 并可用于评价色谱系统对诸杂质的分离效能 混合杂 质对照品研制策略为 : 1 首先根据已知的降解规律 及途径, 确定需要控制的目标杂质 ; 2 分析产生目 标杂质的可能降解途径, 对原药进行酸 碱 光 热 等强制降解预实验 ; 3 选择特定的降解条件获得目 标杂质, 并确定其 HPLC 分析条件 ; 4 建立并优化对 照品制备工艺, 制备混合降解杂质对照品 ; 5 对制 备的对照品的各成分进行结构确证, 确定杂质对照 品的组成 ; 6 建立混合杂质对照图谱, 对各杂质峰 进行归属, 用于样品质控分析 材料与方法仪器与试剂 Agilent 1260 高效液相色谱仪, DAD 检测器, ABI3200Q TRAP LC/MS/MS 系统 阿莫西林钠和氨苄西林钠原料由海南卫康制药有限公司提供, 阿莫西林和氨苄西林对照品来自中国食品药品检定研究院, 阿莫西林噻唑酸 2', 5'- 二酮哌嗪 -2 (R/S) 阿莫西林 阿莫西林闭环二聚体及三聚体 氨苄西林噻唑酸 氨苄西林开环三聚体及闭环 / 开环二聚体 2', 5'- 二酮哌嗪 -2 (R) 氨苄西林对照品均由 DSM Anti- Invectives B.V. 公司提供 HPLC 方法按中国药典 (2010 版 ) 阿莫西林和氨苄西林有关物质项下方法试验 采用 Agilent HC C18 (250 mm 4.6 mm, 5 μm) 色谱柱 ; DAD 波长设定为 190~400 nm; UV 检测波长为 254 nm 阿莫西林和氨苄西林降解溶液的制备将两种原料分别溶解在水 不同浓度氢氧化钠溶液与盐酸溶液和 ph 和 7.8 醋酸盐或磷酸盐缓冲液中, 制成 0.15 g ml 1 的溶液, 分别置室温 光照 (7 500 lx) 水浴 ( 温度 60~90 ) 环境中强制降解 24 h, 每小时取样, 注入 HPLC 分析, 观测杂质产生情况 Figure 1 Structure of amoxicillin, ampicillin and their related substances LC-MS 分析方法 0.1% 甲酸 乙腈 (50 50) 为流动相, 流速 : 0.3 ml min 1, 正离子检测模式, DP EP 电压等参数, 用 Analysis 软件中 Q1 Multiple Ions 进行手动优化和 MRM Ramp Parameter 进行自动优化 阿莫西林和氨苄西林混合杂质对照品的制备工艺取阿莫西林钠原料 120 g, 用 0.01 mol L 1 氢氧化钠溶液 800 ml 溶解, 60 水浴 30 min, 加入甘露醇 120 g 溶解, 冻干 取氨苄西林原料 160 g, 用 0.1 mol L 1 盐酸溶液 1 L 溶解, 20 放置 16 h, 过滤, 作为溶液 Ⅰ; 取氨苄西林原料 6 g, 用 1 mol L 1 盐酸溶液 40 ml 溶解, 20 放置 14 h 作为溶液 Ⅱ; 混合溶液 Ⅰ 和溶液 Ⅱ, 加入甘露醇 100 g, 溶解后冻干 研细, 30 条件下减压干燥后分装 结果 1 混合杂质对照品的分析制备的两种混合杂质对照品, HPLC 谱图如图 2 重复进样比较各杂质峰的峰面积, 样品溶液在 4 h 内

3 1312 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2014, 49 (9): 稳定 对照品在室温和低温贮存条件下的长期稳定性 实验正在进行中 混合杂质对照品中 10 种杂质的色 谱保留时间及 MS 分析数据 ( 表 1), 均与已知杂质对 照品一致 碎片离子显示了阿莫西林母核结构的 β- 内酰胺环及与其稠合的噻唑环开环反应, 6 位侧链上 去 R 基团反应, 酰胺键裂及脱氨基等一系列反应, 与 [10] 已报道的青霉素类抗生素裂解规律一致 说明制 出的混合杂质对照品中已包含了所需的目标杂质 2 应用 2.1 用于系统适用性实验和杂质定位国外药典多 采用相对保留时间定位阿莫西林和氨苄西林中的特 [11] 定杂质 而 Zhu 等证明, 阿莫西林中诸杂质的相对 保留时间受色谱系统的影响较大 在实际工作中也发 现, 采用不同的色谱柱, 不仅氨苄西林诸杂质的相对 保留时间差异很大, 对杂质的分离能力的差异也很 大 利用获得良好分离的混合降解杂质对照品色谱图 谱作为对照图谱 ( 图 2), 在实际样品分析时, 首先进 样混合降解杂质对照品, 将获得的色谱图与对照图 谱进行比较, 如果其与对照图谱一致, 不仅说明色谱 系统可以满足检测的要求, 且可以直观地判断出各 特定杂质的出峰位置, 从而对样品色谱图中的杂质 进行定位 表 1 中列出了按中国药典标准色谱条件实 验, 对照图谱中各杂质峰的相对保留时间及峰面积 归一化含量, 设定其变化幅度的阈值在 0.9~1.1 之内, 作为参考依据 如果因色谱柱等因素, 使得测定的混 合降解杂质对照品的色谱图 ( 图 3) 与对照图谱 ( 图 2A) 不一致, 则提示该色谱系统不适用于测定 即利 Figure 2 Chromatogram of reference materials containing mixed degradation products of amoxicillin (A) and mixed degradation products of ampicillin (B). 2: Penicilloic acid of amoxicillin; 3: Amoxicillin; 5: Amoxicillin-2( R)-piperazine-2, 5-dion; 6: Amoxicillin-2(S)-piperazine-2, 5-dion; 9: Amoxicillin-dimer (closed)-trisodium; 10: Amoxicillin-trimer(closed)-trisodium; 1, 4, 7, 8: Unknown impurities. c: Penicilloic acid of ampicillin; d: Ampicillin; e: Ampicillin-2(R)-piperazine-2, 5-dion; f: Ampicillindimer(open)-trisodum; g: Ampicillin-dimer(closed)-disodium; h: Ampicillin-trimer(open)-trisodium; a, b, i: Unknown impurities Figure 3 Chromatogram of reference materials containing mixed degradation products of amoxicillin in failed system suitability test Table 1 Fragment ions of major components in the reference materials by mass spectrometry Compound RT Content/% Fragmental ion Amoxicillin , 349, 321, 207, 208, 160, 122 Penicilloic acid of amoxicillin , 310, 292, 211, 177, 160, 144 Amoxicillin-2 (R)-piperazine-2, 5-dion , 207, 160, 113 Amoxicillin-2 (S)-piperazine-2, 5-dion , 207, 160, 113 Amoxicillin-dimer (closed)-trisodium , 572, 366, 349, 321, 311, 208, 160 Amoxicillin-trimer (closed)-trisodium , 731, 349, 311, 160 Ampicillin , 333, 305, 192, 191, 160, 106 Penicilloic acid of ampicillin , 324, 307, 279, 191, 174, 160, 112 Ampicillin-2 (R)-piperazine-2, 5-dion , 191, 160, 114 Ampicillin-dime (open)-trisodum , 673, 643, 599, 558, 394, 368, 294, 160 Ampicillin-dimer (closed)-disodium , 540, 350, 333, 192, 160, 118, 106 Ampicillin-trimer (open)-trisodium , 717, 368

4 李玮等 : 阿莫西林 氨苄西林混合降解杂质对照品的研究与应用 1313 用混合降解杂质对照品可以判断色谱系统的适用性, 并且峰定位的准确度更高 2.2 用于制剂中特定降解杂质的定位按 ICH 指导原则, 对药物制剂中杂质控制的重点是对降解杂质的控制 口服固体制剂 ( 胶囊 片剂或干混悬剂 ) 处方中通常有多种辅料, 在采用 HPLC 分析杂质时, 如何方便有效地排除辅料峰的干扰一直是实验中亟待解决的问题 利用混合降解杂质对照品可以方便地确认口服制剂中的降解杂质, 从而快速排除辅料峰的干扰 如图 4 为阿莫西林干混悬剂色谱图, 其中峰 Ⅰ 和 Ⅲ 为辅料带来, 这些辅料色谱峰可以通过比对图 2A 的阿莫西林杂质峰而准确判断后排除 Figure 5 Recognition of degradation impurities of amoxicillin in compound preparation. A: Amoxicillin and clavulanate potassium sample; B: Reference materials containing mixed degradation products of amoxicillin. II: Clavulanic acid; IV, 3: Amoxicillin; III, VI, VII, 1, 2, 4 10: Impurities from amoxicillin; I, V: Impurities from clavulanate potassium Figure 4 Accurate localization of degradation impurities of amoxicillin in suspension. II: Amoxicillin; I, III: Impurities from ingredients; IV, V, VI: Impurities from amoxicillin 2.3 用于复方制剂中杂质的归属阿莫西林 氨苄西林和 β- 内酰胺酶抑制剂组成的复方制剂是临床广泛应用的抗生素 中国药典常用自身对照法, 用对照溶液中两主成分峰面积的和计算复方制剂杂质的量, 该法存在活性成分的质量与原料质量无法直接关联等诸多缺陷 ; 而根据杂质来源的归属进行定量, 能更好地控制产品的质量 [12] 利用混合降解杂质对照品, 可以方便地对杂质来源进行归属 比较阿莫西林克拉维酸钾复方制剂样品的色谱图与阿莫西林混合降解杂质对照品的色谱图, 可以方便地确认源于阿莫西林的降解杂质, 进而可以用阿莫西林的量表征这些杂质的含量, 使得复方制剂中阿莫西林的质量与其原料的质量相关联 图 5A 中峰 Ⅱ 为克拉维酸, 峰 Ⅳ 为阿莫西林主峰, 峰 Ⅲ Ⅵ Ⅶ 对应于图 5B 中阿莫西林混合杂质对照品色谱峰, 为阿莫西林降解产生的杂质, 而峰 Ⅰ 和 Ⅴ 为克拉维酸降解产生 讨论阿莫西林和氨苄西林受亲电和亲核试剂的进攻 时, 易发生内酰胺环开环 分子重排 聚合等反应 : 1 β- 内酰胺环易开环形成相应的噻唑酸, 2 β- 内酰胺环开环后与 5 位侧链上的氨基缩合形成相应的二酮哌嗪产物, 3 母体间相互作用形成二聚体和三聚体等聚合物 阿莫西林和氨苄西林在中性和弱酸性溶液中基本不发生降解反应或只产生少量噻唑酸类杂质 阿莫西林在酸性溶液和碱性溶液中产生的杂质种类基本一致, 主要包括噻唑酸 二酮哌嗪产物 二聚体和三聚体 ; 采用 0.01 mol L 1 氢氧化钠溶解阿莫西林钠原料 (0.15 g ml 1 ), 60 水浴降解 30 min, 可获得稳定的比例适当的阿莫西林混合杂质溶液 而氨苄西林产生开环三聚体可在 0.1 mol L 1 盐酸溶液中稳定产生 ; 在 1 mol L 1 盐酸溶液中, 氨苄西林溶液还可产生一个新的未知杂质 ( 图 2B 中色谱峰 a), 故将两种降解溶液混合 制备混合降解杂质对照品, 应建立在对该品种的降解杂质和降解反应机制充分了解的基础上, 以便选择出合适的目标杂质 也可根据 QbD 的理念 [13], 在混合降解产物中添加某个品种常见的工艺杂质, 以增加混合杂质对照品的适用范围 而制备过程中如何保证降解实验的可控性和所制备的混合对照品的稳定性, 也是需要首先考虑的问题 作者的经验是选用温和的降解条件, 溶液浓度 反应温度 水浴条件 破坏时间等条件均应严格控制, 有利于控制降解反应速度, 进而保证成品的稳定性 为方便贮存和运输,

5 1314 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2014, 49 (9): 混合降解杂质对照品最终要制成固体粉末, 固体成品在分装前需要进一步混匀 干燥, 并要考察混合降解杂质对照品中的所有杂质在质控标准中的样品溶解条件下可以完全溶解 由于色谱柱选择性的差异, 成分的保留值 色谱 [14, 峰之间的分离度 甚至流出顺序都可能出现差异 15], 但目前各国药典对色谱柱的要求均较简单, 使得在实际工作中色谱柱的选择具有一定盲目性, 所以迫切需要一种稳定 快速 有效的方法评价色谱系统, 并准确定位杂质峰 中国药典 2010 年版中阿莫西林和氨苄西林项下均规定 取系统适用性对照品适量, 加流动相 A 溶解, 取 20 μl 注入液相色谱仪, 记录的色谱图应与对照图谱一致 利用混合杂质对照品色谱图与对照图谱的比较, 不仅可以保证实际实验中各峰的分离度, 也可以方便地对样品杂质进行归属, 这使得中国药典这两个品种的系统适用性方法明显优于欧美药典 如能进一步确定各杂质相对于主成分的响应因子, 或对混合杂质对照品中的各杂质和量进行标化, 将可用于原料和制剂中各杂质的准确定量, 为 HPLC 方法快速准确分析药物杂质提供了新的思路 References [1] International Conference on Harmonization of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use. Q3A(R2): Impurities in New Drug Substances. ICH, Geneva, 2006 [EB/OL]. [2] Hu CQ. Current situation and the trend in impurity control of chemical drugs [J]. Sci Sin Chim ( 中国科学 : 化学 ), 2010, 40: [3] Ulrich R. In situ degradation: a new concept for system suitability tests in monographs of the European Pharmacopoeia [J]. J Pharm Biomed Anal, 1998, 18: [4] Zhang WQ, Hu CQ. Theory of selectivity of RP-LC C18 column and its application [J]. Acta Pharm Sin ( 药学学报 ), 2010, 45: [5] British Pharmacopoeia Commission. British Pharmacopoeia [S]. London: The Stationery Office, [6] Council of Europe. European Pharmacopoeia [S]. 7th ed. Strasbourg, [7] The United States Pharmacopeial Convention. United States Pharmacopoeia/National Formulary [S] ed. Vol 2. Baltimore: United Book Press, [8] State Pharmacopoeia Committee of the People s Republic of China. Pharmacopoeia of the People s Republic of China ( 中华人民共和国药典 ): Part II [S]. Beijing: China Medical Science Press, 2010: 402, 832. [9] Deshpande AD, Baheti KG, Chatterjee NR. Degradation of beta-lactam antibiotics [J]. Curr Sci, 2004, 87: [10] Straub RF, Voyksner RD. Determination of penicillin G, ampicillin, amoxicillin, cloxacillin and cephapirin by high-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry [J]. J Chromatogr A, 1993, 647: [11] Zhu YX, Roets E, Moreno ML, et al. Evaluation of LC methods for the separation of amoxicillin and its relative substances [J]. J Liq Chromtogr Relat Technol, 1996, 19: [12] Huang MW, Yuan YZ, Zhang M, et al. Quality evaluation of domestic amoxicillin and clavulanate potassium tablets [J]. Chin J Pharm Anal ( 药物分析杂志 ), 2012, 32: [13] Cogdill RP, Drennen JK. Risk-based quality by design (QbD): a Taguchi perspective on the assessment of product quality, and the quantitative linkage of drug product parameters and clinical performance [J]. J Pharm Innov, 2008, 3: [14] Rosa B, Victoria SN, Jose B. Modeling retention in liquid chromatography as a function of solvent composition and ph of the mobile phase [J]. J Chromatogr A, 2000, 869: [15] Vervoort RJM, Debets AJJ, Claessens HA, et al. Optimization and characterization of silica-based reversed-phase liquid chromatographic systems for the analysis of basic pharmaceuticals [J]. J Chromatogr A, 2000, 897: 1 22.

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