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1 耐酸耐胆盐乳酸菌的鉴定及筛选李利 1, 孔丽 2, 张宁 2, 赵伟超 2, 肖亦农 1, 李炳学 1*, 韩晓日 (1. 沈阳农业大学土地与环境学院土肥资源高效利用国家工程实验室, 辽宁沈阳 ;2. 沈阳农业大学生物科学技术学院, 辽宁沈阳 ) 摘要 : 从自然发酵的酸奶中分离 2 株细菌, 经 16S rdna 分子鉴定为 Lactobacillus plantarum SN1 和 Lactobacillus rhamnosus SN6, 并对其生长曲线产酸速率耐酸耐胆盐能力进行了研究 L. plantarum SN1 和 L. rhamnosus SN6 在 2h 后进入对数期,16h 后达到稳定期, 其 OD 600nm 值分别为 L. plantarum SN1 和 L. rhamnosus SN6 的产酸速率较快,pH 值在 8h 后就降到了 4.2 以下,48h 后降到 3.3 左右 L. plantarum SN1 和 L. rhamnosus SN6 在 ph 4 的培养基培养 16h 后, 其相对 OD 600nm 值分别为 49.29% 47.14%, 具有较强的耐酸能力 L. plantarum SN1 和 L. rhamnosus SN6 在 0.3g/L 胆盐浓度下培养 16h 后, 相对 OD 600nm 值分别为 57.7% 69.48%; 在 0.6g/L 胆盐浓度下的相对 OD 值分别为 48.22% 29.56%, 具有较强的耐胆盐能力结果表明 : L. plantarum SN1 和 L. rhamnosus SN6 是生长性能好产酸能力强耐酸耐胆盐的益生菌株关键词 : 乳酸菌 ; 耐酸耐胆盐 ;16S rdna 序列分析 Identification and Selection of Lactic Acid Bacteria Resistant to Acid and Bile Salt LI Li 1, KONG Li 2, ZHANG Ning 2, ZHAO Wei-chao 2, XIAO Yi-nong 1, LI Bing-xue 1*, HAN Xiao-ri (1. National Engineering Laboratory for Efficient Utilization of Soil and Fertilizer Resources, College of Land and Environment, Shenyang Agricultural University, Shenyang, Liaoning , China; 2. College of Biological Science & Technology, Shenyang Agricultural University, Shenyang, Liaoning , China) Abstract: Two strains of lactic acid bacteria were isolated from naturally fermented yogurt. The 16S rdna sequence analysis indicated that two strains are Lactobacillus plantarum SN1 and Lactobacillus rhamnosus SN6. Strains were studied through growth curve, acid production rate, acid and bile salt tolerance. L. plantarum SN1 and L. rhamnosus SN6 which entered logarithmic growth phase after 2h and reached a stable period after 16h were faster-growing, the OD 600nm values of strains were 8.47 and 7.43, respectively. The ph value dropped to 4.2 at 8 h, to 3.3 at 48h. L. plantarum SN1 and L. rhamnosus SN6 had strong resistance to acid, and the relative OD 600nm value was 49.29%, 47.14% at ph 4.0 for 16h, respectively. When the concentration of bile salt was 0.3g/L, the relative OD 600nm values of L. plantarum SN1 and L. rhamnosus SN6 were 57.7% and 69.48%, respectively. When the concentration of bile salt was 0.6g/L, the relative OD 600nm values of strains were 48.22% and 29.56%, respectively. The results show that L. plantarum SN1 and L. rhamnosus SN6 both are probiotic strains that exhibited a strong ability to growth, acid production and tolerance to acid and bile salt. Key words: lactic acid bacteria; acid and bile salt tolerance; 16S rdna sequences analysis 中图分类号 :Q935 文献标志码 : 文章编号 : 乳酸菌是发酵葡萄糖, 主要代谢终产物为乳酸的一类无芽孢革兰氏阳性细菌的总称 [1] 乳酸菌主要包括乳杆菌属魏斯氏菌属肉杆菌属链球菌属肠球菌属乳球菌属漫游球菌属明串球菌属酒球菌属四联球菌属等 [2] 乳酸菌具有促进营养物质消化和吸收降低血清胆固醇调节肠道菌群平衡激活机体免疫系统改善食品风味和预防癌症等生理功能 [3], 在工业农业食品及医疗保健等与人类密切相关的领域中有很高的应用价值 [4] 自然界中乳酸菌种类很多, 分布极广, 在乳制品肉制品水果蔬菜及植物制品上都有发现, 有些种类甚至存在于人体的口腔胃肠中 [5] 分离自开菲尔粒的植物乳杆菌 Lp27 [6], 发酵酸肉的消化乳杆菌 SR10 [7], 奶豆腐的屎肠球菌 M1-1 植物乳杆菌 M1-2 乳酸片球菌 M1-3 [8], 人肠道的屎肠球菌食窦魏斯氏菌干酪乳杆菌发酵乳杆 1 基金项目 : 国家自然科学基金 (No ); 沈阳市科技创新农业科技攻关专项 (No.F ); 中国博士后科学基金 (No. 2012M510836, No. 2013T60299) 作者简介 : 李利 (1989-), 女, 硕士研究生, 研究方向为微生物生理与遗传 lili2008aa@163.com * 通信作者 : 李炳学 (1973-), 男, 副教授, 博士, 研究方向为微生物生理与遗传 libingxue1027@163.com 1

2 菌 [9], 鼠李糖乳杆菌 Lr10 [10], 均具有降胆固醇益生作用分离自发酵食品和粪便的植物乳杆菌 CCFM8661 和干酪乳杆菌 CCFM1566 [11], 奶豆腐的鼠李糖乳杆菌 M6-1 [8] 具有抗氧化能力从风干香肠中分离的明串珠菌既有去除胆固醇能力又有抗氧化能力 [12] 分离自开菲尔粒的乳酸乳球菌乳亚种 HUCM 201 [13], 人肠道的植物乳杆菌 L2 [14] 对肠道细胞表现出了良好的黏附性从酸菜中分离的植物乳杆菌 [15] [16], 传统乳制品仔猪粪便及鸡肠道分离的短乳杆菌, 粪肠球菌, 嗜酸乳杆菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等有害菌株, 均有明显的抑菌效果分离自奶酪的植物乳杆菌具有调节肠道菌群的功能 [17], 分离自传统乳制品中的保加利亚乳杆菌 LJJ 自溶活性较强 [18] 乳酸菌在人体内发挥益生作用的前提是其可在人体肠道中存活并定植, 而乳酸菌能否在人体内存活定植主要与其耐酸耐胆盐能力有关 [19] 因此, 耐酸耐胆盐能力是筛选益生性乳酸菌的一个重要指标 [20] 本文从自然发酵的酸奶中分离 2 株细菌, 经 16S rdna 分子鉴定为 Lactobacillus plantarum SN1 和 Lactobacillus rhamnosus SN6, 并对其生长曲线产酸速率耐酸耐胆盐能力进行了研究 1 材料与方法 1.1 材料与试剂酸奶是将鲜牛奶封闭于灭菌容器内, 经 37 自然发酵 1d 制成 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum CGMCC Lactobacillus brevis CGMCC 1.558;Lactobacillus acidophilus CGMCC ; Lactobacillus casei CGMCC ;Lactobacillus pentosus CGMCC ;Lactobacillus rhamnosus CGMCC 购自中国普通微生物保藏管理中心 DNA 2000 marker ( 宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 ) 2 Taq MasterMix( 北京康为世纪生物科技有限公司 ) GoodView 核酸染料 ( 北京赛百盛基因技术有限公司 ), 其它所需试剂均为进口或国产分析纯产品 1.2 仪器与设备 TC-412 型 PCR 仪 ( 英国 TECHNE);Bio-Rad universal hood II 型凝胶成像系统 ( 美国 BIO-RAD); Lambda Bio35 紫外 - 可见分光光度计 ( 美国 Perkin Elmer);GNP-9080 型电热恒温培养箱 ( 上海精宏实验设备公司 ) ph 计 ( 美国 ORION) 等 ; 1.3 培养基 MRS 液体培养基 (g/l): 蛋白胨牛肉膏 10.0 酵母粉 5.0 葡萄糖 20.0 柠檬酸二钠 2.0 吐温磷酸氢二钾 2.0 乙酸钠 5.0 硫酸铵 1.63 硫酸镁 0.58 硫酸锰 0.25,pH 值为 6.5,115 灭菌 30min 1.4 方法乳酸菌的分离及初步鉴定称取 5g 自制酸奶样品, 用 45mL 无菌水均质, 然后做 10 倍系列稀释, 取三个稀释度, 各稀释度取 0.1 ml 液体分别涂布于固体 MRS 培养基平板上,37 厌氧培养 48h-72h 根据形态特征挑选典型菌落, 反复划线获得纯菌株, 进行革兰氏染色镜检和过氧化氢酶试验乳酸菌 16S rdna 分子鉴定引物的设计与合成 16S rdna 通用引物 : 7F : 5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3' ; 1540R : 5'- AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3' 引物由生工生物工程( 上海 ) 股份有限公司合成 [21] 总 DNA 的提取取过夜培养的菌液 1 ml 置于 1.5 ml EP 管中,4000r/min 离心 5min 后, 弃上清收获菌体在沉淀物中加入 μl 裂解液 (mm Tris,30mM EDTA,0.5%SDS), 沸水浴 15min 后, 加入 μl 的 2.5M 醋酸钾后, 置于冰上 30min 再加入等体积的氯仿: 异戊醇 (24:1) 剧烈震荡后,12000r/min 离心 10min, 取上清加入等体积的冷的异丙醇,-20 静置 15min;13000r/min 离心 15min; 用 μl 70% 乙醇洗涤沉淀,13000r/min 离心 5min, 用 μl 无水乙醇再次洗涤沉淀, 将沉淀置于真空干燥器中 2

抽干, 加入 50μL ddh 2 O 溶解, 即为 DNA 将提取的 DNA 于 -20 下保存备用 1.4.2.3 PCR 扩增反应体系为 DNA 模板 1.5µL;2 Taq MasterMix 12.5µL;10 µmol/l 7F 1540R 上下游引物各 0.

5 乳酸菌生物学性质研究 1.5.1 生长曲线测定将活化的菌株, 按 3%(v/v) 接种量接种于 MRS 液体培养基中,37 厌氧培养 36h, 每隔 2h 取样, 在 600nm 下测定样品的吸光值, 绘制生长曲线图 1.5.2 产酸性试验将活化的菌株, 按 3%(v/v) 接种量接种于 MRS 液体培养基中,37 厌氧培养 30 h, 每隔 2 h 取样测 ph 值 1.5.3 耐酸性试验将活化的菌株, 按 3%(v/v) 接种量接种于 ph 为 2.

1 菌落形态及细胞形态的初步鉴定从酸奶中共分离出 2 株革兰氏染色阳性过氧化氢酶阴性的杆菌, 分别命名为 SN1 SN6 菌落形态为乳白色或白色表面光滑边缘整齐大小不一的圆形菌落细胞形态为短杆状, 一般呈单个成对或链状排列 2.

3 抽干, 加入 50μL ddh 2 O 溶解, 即为 DNA 将提取的 DNA 于 -20 下保存备用 PCR 扩增反应体系为 DNA 模板 1.5µL;2 Taq MasterMix 12.5µL;10 µmol/l 7F 1540R 上下游引物各 0.5 µl; 加无菌水至总体积为 25µL PCR 条件为 :94 预变性 5 min;94 变性 1min,60 退火 1min, 72 延伸 90s, 共 35 个循环 ; 第 35 个循环 72 延伸 10min,4 保存按照以上条件设定程序, 使用 PCR 仪进行 PCR 扩增 PCR 扩增产物的凝胶电泳配制 1% 的琼脂糖凝胶, 以 5:1 的比例加入 PCR 产物和 6 Loading buffer, 在 V 电压下电泳 30min, 利用紫外凝胶成像系统进行观察与分析最后, 将 PCR 产物送到生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司测序将测序结果在 GenBank 中进行 BLAST 分析, 构建系统发育树 1.5 乳酸菌生物学性质研究生长曲线测定将活化的菌株, 按 3%(v/v) 接种量接种于 MRS 液体培养基中,37 厌氧培养 36h, 每隔 2h 取样, 在 600nm 下测定样品的吸光值, 绘制生长曲线图产酸性试验将活化的菌株, 按 3%(v/v) 接种量接种于 MRS 液体培养基中,37 厌氧培养 30 h, 每隔 2 h 取样测 ph 值耐酸性试验将活化的菌株, 按 3%(v/v) 接种量接种于 ph 为和 7.0 的 MRS 液体培养基中, 37 厌氧培养 16 h, 测各组菌液的 OD 600nm 值耐胆盐试验将活化后的菌株, 按 3%(v/v) 接种量接种于胆盐质量浓度为 g/L 的 MRS 液体培养基中,37 厌氧培养 16 h, 测各组菌液的 OD 600 nm 值 2 结果与分析 2.1 菌落形态及细胞形态的初步鉴定从酸奶中共分离出 2 株革兰氏染色阳性过氧化氢酶阴性的杆菌, 分别命名为 SN1 SN6 菌落形态为乳白色或白色表面光滑边缘整齐大小不一的圆形菌落细胞形态为短杆状, 一般呈单个成对或链状排列 2.2 乳酸菌 16S rdna 基因序列分析 PCR 扩增产物经 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测, 分离株在 1500 bp 处均出现特异性条带, 与预期扩增大小一致, 说明扩增成功 ( 图 1) 泳道 :M 为 2000bpDNA marker;1,2 分别为 SN1 SN6 图 1 分离株 16S rdna 基因 PCR 扩增产物电泳结果 Fig.1 Electrophoresis result of PCR-amplified 16S rdna gene fragment from isolates 3

4 测序后, 将各菌株的 16S rdna 基因测序结果在 GenBank 中进行 BLAST 分析, 各菌株与参考菌株的同源性均达到 99% 以上 ( 表 2) 为显示菌株之间的亲缘关系及系统地位,MEGA5 构建系统发育树 ( 图 2) 表 2 16S rdna 序列的 BLAST 分析结果 Table 2 16S rdna sequence analysis results of BLAST 菌株参考序列同源性 (%) BLAST 结果 SN1 NR_ L. plantarum SN6 NR_ L. rhamnosus Lactobacillus plantarum WCFS1 strain WCFS1 SN1 Lactobacillus plantarum strain NBRC Lactobacillus plantarum strain CIP Lactobacillus plantarum strain JCM 1149 Lactobacillus versmoldensis NBRC Lactobacillus senmaizukei NBRC Lactobacillus namurensis NBRC Lactobacillus acidifarinae NBRC Lactobacillus zymae NBRC Lactobacillus curvatus NBRC Lactobacillus sakei NBRC Lactobacillus rhamnosus NBRC SN6 Lactobacillus saerimneri NBRC Lactobacillus acidipiscis NBRC Lactobacillus salivarius NBRC 图 2 分离株 16S rdna 序列系统进化树 Fig.2 Phylogenetic tree of 16S rdna sequences of isolates 如图 2 所示, 分离株中 1 株与 L. plantarum 有较近亲缘性,1 株与 L. rhamnosus 有较近的亲缘性, 且与相似菌株的相似性达到 %, 故 SN1 鉴定为 L. plantarum (NCBI 收录号为 KP296678),SN6 鉴定为 L. rhamnosus (NCBI 登录号为 KP296679) 2.3 乳酸菌生物学性质乳酸菌生长曲线的测定由图 3 可知, 各菌株生长迅速,L. plantarum subsp. plantarum CGMCC L. rhamnosus CGMCC L. plantarum SN1 L. rhamnosus SN6 L. casei CGMCC 在 2h 后进入对数期,L. plantarum subsp. plantarum CGMCC 在 12h 后达到稳定期 ;L. rhamnosus CGMCC 在 14h 后达到稳定期, SN1 SN6 在 16h 后达到稳定期,L. casei CGMCC 在 18h 后达到稳定期 L. pentosus CGMCC 在 4 h 后进入对数期,16h 后进入稳定期 L. brevis CGMCC 在 6h 后进入对数期,14h 后进入稳定期 L. acidophilus CGMCC 在 10h 后进入对数期,16h 后进入稳定期 L. plantarum SN1 L. rhamnosus SN6 L. pentosus CGMCC L. rhamnosus CGMCC L. casei CGMCC L. plantarum subsp. plantarum CGMCC L. brevis CGMCC L. acidophilus CGMCC 对数期的 OD 600nm 值分别为

5 图 3 乳酸菌的生长曲线 Fig.3 The growth curve of lactic acid bacteria 产酸性试验产酸速率是乳酸菌活力良好的重要特征之一, 也是筛选优良菌株的重要指标由图 4 可知,L. rhamnosus 和 L. plantarum SN1 L. rhamnosus SN6 产酸最快,8h 后 ph 值降到 4.2 以下 ;L. plantarum subsp. plantarum CGMCC L. pentosus CGMCC 在 10h 后 ph 下降到 4.2 以下 ; L. casei CGMCC 在 12h 后下降到 4.2,L. brevis L. acidophilus CGMCC 产酸相对较慢,36h 后 ph 下降到 4 以下以上菌株显示了较好的产酸能力图 4 乳酸菌的产酸性 (ph 值 ) Fig.4 Lactic acid bacteria isolates acid-production test(ph) 耐酸性试验由图 5 可知,L. acidophilus CGMCC L. pentosus CGMCC L. plantarum SN1 在培养基 ph 为 6.0 时 OD 值最大, L. plantarum subsp. plantarum CGMCC L. brevis CGMCC L. casei CGMCC L. rhamnosus CGMCC 在培养基 ph 为 6.5 时 OD 值最大, 而 L. rhamnosus SN6 在 ph 为 6.0 和 ph 为 6.5 均达到了最大的生长量, 说明培养基在 ph 6 左右为各菌株的最佳培养条件 ph 2 的培养基中各菌株基本不生长 ; 在 ph 4 的培养基中,L. plantarum subsp. plantarum CGMCC L. brevis CGMCC L. acidophilus CGMCC L. casei CGMCC L. pentosus CGMCC L. rhamnosus CGMCC SN1 SN6 的相对 OD 600nm 分别为 3.98% 31.91% 13.58% 31.5% 56.53% 45.98% 49.29% 47.14% 综上结果,L. plantarum SN1 L. rhamnosus SN6 均较参考菌株的相对 OD 600nm 值高, 说明 L. plantarum SN1 L. rhamnosus SN6 具有较强的耐酸能力 5

6 图 5 乳酸菌在不同 ph 培养基中培养 16h 后的 OD 600 值 Fig.5. The OD 600nm values of lactic acid bacteria cultivated in different ph media for 16h 耐胆盐试验耐胆盐能力是乳酸菌的重要特征之一, 乳酸菌要到达并定殖于肠道, 必须对胆盐有一定的耐受性由图 6 可知, 随着胆盐浓度的升高, 各菌株的生长受到不同程度的抑制将菌株在 0. 3g/L 胆盐浓度下培养 16h 后, 与培养基中没添加胆盐的 OD 值相比,L. plantarum subsp. plantarum L. brevis L. acidophilus L. casei L. pentosus L. rhamnosus L. plantarum SN1 L. rhamnosus SN6 的相对 OD 600nm 值分别为 12.81% 57.31% 34% 53.4% 53.66% 89.02% 57.7% 69.48% 在 0.6g/L 胆盐浓度下培养 16h 后, 与培养基中没添加胆盐的 OD 值相比,L. plantarum subsp. plantarum L. brevis L. acidophilus L. casei L. pentosus L. rhamnosus L. plantarum SN1 L. rhamnosus SN6 的相对 OD 值分别为 3.31% 48.84% 14.33% 28.53% 35.58% 27.36% 48.22% 29.56% 与参考菌株相比,L. plantarum SN1 L. rhamnosus SN6 具有较强的耐胆盐能力图 6 乳酸菌在不同胆盐含量培养基中培养 16h 后的 OD 600 值 Fig.6 The OD 600nm values of lactic acid bacteria cultivated in different bile salt content media for 16h 3 讨论酸奶经自然发酵会保留许多具有优良特性的乳酸菌, 如植物乳杆菌发酵乳杆菌干酪乳杆菌戊糖乳杆菌消化乳杆菌詹氏乳杆菌耐酸乳杆菌德氏乳杆菌玉米乳杆菌粪肠球菌嗜热链 [22, 球菌植物乳球菌和肠膜明串珠菌 23] [24, 鼠李糖乳杆菌多分离于人的粪便 25] 人群肠道 [10] 乳酪 [26] [27] 以及发酵橄榄等本研究从自然发酵的酸奶中分离到 2 株细菌, 进行革兰氏染色过氧化氢酶及 16S rdna 鉴定为 L. plantarum SN1 和 L. rhamnosus SN6 乳酸菌作为发酵剂被广泛应用到食品行业, 如酸奶奶酪风干香肠酸菜等的生产在发酵初期, 乳酸菌快速生长且能够足量的产酸, 使 ph 迅速降低, 这不仅对产品色泽的形成有促进作用, 还 [28, 能够提高产品的稳定性 29], 和安全性 [30] 本研究通过生长曲线和产酸速率指标筛选出生长迅速产酸较快 L. plantarumsn1 L. rhamnosus SN6 初步可作为具有潜在发酵特性的菌株 6

7 乳酸菌作为益生菌能否在人体内发挥益生作用, 关键在于其能否在胃液的酸性环境和肠道的胆盐环境中存活下来正常人的胃液在 ph1.5~4.5 之间, 其 ph 的大小因食物结构不同而波动 [31] 在 ph2 时, 所有菌株基本不生长 ; 在 ph4 时, 各菌株均表现出不同程度的耐受性,L. plantarum SN1 和 L. rhamnosus SN6 相对 OD 600nm 值分别为 49.29% 47.14%, 且均较参考菌株的相对 OD 600nm 值高, 说明 L. plantarum SN1 和 L. rhamnosus SN6 具有较强的耐酸能力这种耐酸特性是多种机制共同作用的结果, 包括双组分信号转导系统维持胞内外 ph 值平衡, 细胞膜组成变化, 蛋白质 DNA 损伤修复等 [5] L. plantarum SN1 和 L. rhamnosus SN6 具有较强的耐酸能力, 能够保证一定数量的活菌体顺利通过胃酸环境到达肠道内人体小肠中胆盐质量分数在 0.03%~0.3% 之间波动, 能够在正常生理胆盐浓度中生长和代谢的菌株才可能在肠道消化过程中存活 [32] 本研究中 L. plantarum SN1 和 L. rhamnosus SN6 在 0.3g/L 胆盐浓度下培养 16h 后, 相对 OD 600nm 值分别为 57.7% 69.48%; 在 0. 6g/L 胆盐浓度下的相对 OD 值分别为 48.22% 29.56%, 均表现出一定的耐受力, 且均较参考菌株的相对 OD 600nm 值高, 由此可见,L. plantarum SN1 和 L. rhamnosus SN6 具有较强的耐胆盐能力耐胆盐特性主要与自身的胆盐水解酶表层蛋白有关 [5] 乳酸菌作为益生菌对人体具有重要的生理功能, 它对胃肠道的耐受性是其发挥生理功能的基本前提本研究所鉴定的两株乳酸菌有较强的耐酸耐胆盐能力, 具有在人体内定殖的潜力, 可以广泛应用在酸奶豆类谷物等乳酸发酵制品中, 也可应用在发酵肉制品青贮饲料中目前, 对于乳酸菌耐酸耐胆盐机制的研究已有诸多报道, 但尚不完全清楚 [5] 本课题组将运用同源基因克隆方法研究 L. plantarum SN1 和 L. rhamnosus SN6 中的胆盐水解酶 (BSH) 基因等, 深入分析其耐酸耐胆盐的机制 4 结论本文从自然发酵的酸奶样品中, 经 16S rdna 鉴定出 2 株乳酸菌, 分别为 L. plantarum SN1 和 L. rhamnosus SN6 通过测定生长曲线和产酸速率,L. plantarum SN1 和 L. rhamnosus SN6 生长迅速产酸较快, 初步可作为具有潜在发酵特性的菌株在 ph 4 的 MRS 液体培养基中培养 16h,L. plantarum SN1 和 L. rhamnosus SN6 均表现出较强的耐酸能力, 能够保证一定数量的活菌体顺利通过胃酸环境到达肠道内在 0.3g/L 和 0. 6g/L 胆盐浓度下培养 16h,L. plantarum SN1 和 L. rhamnosus SN6 均表现出较强的耐胆盐能力, 可以在肠道消化过程中存活, 具有在人体内定殖的潜力参考文献 [1] BAO Qiuhua, LIU Wenjun, JIE Yu, et al. Isolation and identification of cultivable lactic acid bacteria in traditional yak milk products of Gansu Province in China[J]. J. Gen. Appl. Microbiol, 2012, 58(2): [2] DE MORENO DE LEBLANC A, DEL CARMEN S, ZURITA-TURK M, et al. Importance of IL-10 modulation by probiotic microorganisms in gastrointestinal inflammatory diseases[j]. ISRN Gastroenterol, 2011, 2011: [3] 左志芳, 谢红兵, 刘长忠, 等. 乳酸菌的生理功能及在饲料发酵中的应用 [J]. 河南科技学院学报 ( 自然科学版 ), 2014,42(2): [4] 白洪涛, 郭松年, 田淑梅. 乳酸菌及乳酸菌发酵食品 [J]. 粮食与食品工业, 2005,12(1): [5] 胡爱华, 敖晓琳, 陈岑, 等. 乳酸菌耐酸耐胆盐机制的研究进展 [J/OL]. 食品工业科技, [ ]. [6] HUANG Ying, WU Fei, WANG, Xiaojun, et al. Characterization of Lactobacillus plantarum Lp27 isolated from Tibetan kefir grains: A potential probiotic bacterium with cholesterol-lowering effects[j]. Journal of Dairy Science, 2013,96(5): [7] 丁苗, 刘洋, 葛平珍, 等. 发酵酸肉中降胆固醇乳酸菌的筛选鉴定及降胆固醇作用的初步研究 [J]. 食品科学, 2014, 35(19): [8] 王辑, 顾芸佳, 马文慧, 等. 内蒙古奶豆腐中潜在益生性乳酸菌的筛选 [J]. 食品科学, 2014,35(13): [9] 陈大卫, 郭飞翔, 顾瑞霞, 等. 具有降胆固醇能力的人源乳酸菌筛选 [J]. 现代食品科技, 2014,30(3):

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广告.indd 生物工程食品科学, Vol., No. 耐酸耐胆盐乳酸菌的鉴定及筛选李利, 孔丽, 张宁, 赵伟超, 肖亦农,, 李炳学 *, 韩晓日 (. 沈阳农业大学土地与环境学院, 土肥资源高效利用国家工程实验室, 辽宁沈阳 8;. 沈阳农业大学生物科学技术学院, 辽宁沈阳 8) 摘要 : 从自然发酵的酸奶中分离出株细菌, 经 S rdna 分子鉴定为 Lactobacillus plantarum 和