滑膜间充质干细胞向透明软骨分化条件的体外研究胡伟全, 等 777 透明软骨覆盖于活动性关节的表面, 其主要组成物质是软骨细胞和软骨基质, 有助于减少关节面之间的摩擦, 减轻机械性震荡关节软骨自身无神经血管, 其营养物质主要从滑液中获得, 一旦受损, 常难以自行恢复, 软骨受损的关节最终发展为骨关节

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贩刚伏
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1 776 临床与病理杂志 J Clin Pathol Res 2016, 36(6) doi: /j.issn View this article at: 滑膜间充质干细胞向透明软骨分化条件的体外研究胡伟全, 张雷, 徐敬, 赵建宁 ( 南京大学医学院临床学院 ( 南京军区南京总医院 ) 骨科, 南京 ) [ 摘要 ] 目的 : 研究 TGFβ1 BMP-2 bfgf IGF BMP-7 ASA Dex 七种因素在滑膜间充质干细胞向透明软骨分化中起的作用方法 : 酶消化法有限稀释法获得滑膜间充质干细胞, 并诱导其向脂肪细胞软骨细胞和骨细胞分化正交实验中纳入 TGFβ1 BMP-2 bfgf IGF BMP-7 AsA Dex 七种因素通过 SPSS22.0 统计软件设计 L8(27) 正交实验及表头, 定义 2 水平条件结果 : 滑膜间充质干细胞在成骨成脂成软骨分化后分别进行油红染色碱性磷酸酶染色甲苯胺蓝染色, 染色结果均呈现为阳性正交实验中直观观察主体间方差分析显示 TGFβ1 作用最强结论 : 滑膜间充质干细胞能够成功诱导向各种组织细胞分化,TGFβ1 是七种因素中作用最明显的一种 [ 关键词 ] 间充质干细胞 ; 透明软骨 ; 正交实验 Express of conditions in synovial-derived mesenchymal stem cells differentiating into hyaline cartilage HU Weiquan, ZHANG Lei, XU Jing, ZHAO Jianning (Department of Orthopedics, Clinical college of Medical Nanjing University, Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command, Nanjing , China) Abstract Keywords Objective: To explore the effects of TGFβ1, BMP-2, bfgf, IGF, BMP-7, ASA, Dex on the differentiation of synovial-derived mesenchymal stem cells into hyaline cartilage. Methods: The synovial-derived mesenchymal stem cells were acquired by enzymatic digestion method and limited dilution method. The synovial-derived mesenchymal stem cells were used for osteogenic/adipogenic/chondrogenic differentiation. TGF-β1, BMP-2, bfgf, IGF, BMP-7, AsA, Dex were included in the orthogonal experiment. L8(27) orthogonal experiment and table heading were designed by SPSS22.0 statistical software while 2 level conditions were defined. Results: These cells gave positive reacts in oil red O staining, alkaline phosphatase staining and toluidine blue stain. TGF-β1 was found to have the strongest effect in synovial-derived mesenchymal stem cells differentiating into hyaline cartilage. Conclusion: The synovial-derived mesenchymal stem cells have multidirectional differentiation ability, TGFβ1 showed the strongest effect in synovial-derived mesenchymal stem cells differentiating into hyaline cartilage. synovial-derived mesenchymal stem cells; hyaline cartilage; orthogonal experiment 收稿日期 (Date of reception): 通信作者 (Corresponding author): 赵建宁, zhaojianning.0207@163.com 基金项目 (Foundation item): 江苏省临床医学科技专项资助 (BL ); 南京市科研课题 ( ) This work was supported by Medical Scientific Research Foundation of Jiangsu Province (BL ) and Research Project of Nanjing ( ), P. R. China.

2 滑膜间充质干细胞向透明软骨分化条件的体外研究胡伟全, 等 777 透明软骨覆盖于活动性关节的表面, 其主要组成物质是软骨细胞和软骨基质, 有助于减少关节面之间的摩擦, 减轻机械性震荡关节软骨自身无神经血管, 其营养物质主要从滑液中获得, 一旦受损, 常难以自行恢复, 软骨受损的关节最终发展为骨关节炎, 给患者带来疼痛活动受限甚至终身残疾, 也给国家带来巨大的经济损失目前治疗关节软骨损伤主要包括保守治疗, 如口服塞来昔布氨基葡萄糖等药物关节腔内注射玻璃酸钠及手术治疗, 如自体软骨移植自体骨软骨移植微骨折等 [1-2] 临床疗效受多种因素影响, 包括软骨缺损部位大小患者年龄患者活动量等, 最佳治疗方案尚存争议, 由于不能完美地重建透明软骨, 这些治疗方法均有待于进一步发展 [3] 随着人口逐渐老龄化人类活动量增加等因素, 越来越多关节软骨损伤急需治疗, 若无合适的方法修复关节软骨, 后期都不得不采用关节置换治疗, 此时, 若可以通过组织工程使关节软骨再生, 这对软骨有损伤的患者而言是一个新的希望本文选用滑膜间充质干细胞 (synovialderived mesenchymal stem cells,smscs) 作为种子细胞, 通过正交实验探索 TGFβ1 BMP-2 bfgf IGF BMP-7 AsA Dex 七种因素在诱导 SMSCs 朝透明软骨分化中的作用, 为组织工程修复关节软骨提供理论支持 1 材料与方法 1.1 材料与仪器 3% 戊巴比妥钠 ;Ⅱ 型胶原酶 ( 上海医药工业研究院 ) ; 青霉素 / 链霉素溶液 (GibcolBRL 公司 );200 mm GlutamaxTM(GibcolBRL); 胎牛血清 (Hyclone 公司 );DMEM 培养基干粉 (GibcolBRL 公司 );0.25% 胰蛋白酶 /0.02% EDTA(GibcolBRL 公司 );10 ng/ml TGF-ib(Sigma);500 ng/ml BMP-2 (Sigma); 200 ng/ml bfgf(sigma); 20 ng/ml IGF(Sigma);500 μg/ml ASA(Sigma);2 000 nmol/l DEX(Sigma);10 ng/ml BMP-7 (Sigma); 成骨诱导液 (LG-DMEM,10%FBS (Fetal Bovine Serum),L- 谷氨酰胺 300 μg/ml, 抗坏血酸 50 μg/ml, 青霉素 100 U/mL, 链霉素 100 U/mL, 地塞米松 100 nm,β- 磷酸甘油 10 mm, 抗坏血酸 50 μm); 成脂诱导液 (LG- DMEM,10%FBS (Fetal Bovine Serum),L- 谷氨酰胺 300 μg/ml, 抗坏血酸 50 μg/ml, 青霉素链霉素各 100 U/mL,0.5 μm 地塞米松,0.5 mm IBMX, 50 μm 吲哚美辛 ); 成软骨诱导液 [HG-DMEM, 10%FBS (Fetal Bovine Serum),TGF-β3 1 ng/ml, BMP μg/ml, 青霉素链霉素各 100 U/mL]; 油红 -O 染色剂 ; 甲苯胺蓝染色剂 ; 碱性磷酸酶染色剂 ;PBS 缓冲液 ;Ⅰ 型小鼠胶原单克隆抗体 ;Ⅱ 型小鼠胶原单克隆抗体 ;0.2% 明胶溶液自动温控 CO 2 培养箱 (Heraeus 5060/BB16); 超净台 ( 苏州净化设备 ); 低速离心机 (Thermo 公司 ); 倒置相差显微镜和配套摄影装置 :NikonTMS 显微镜和 HFX-DX 显微摄影系统 ; 自动温控水浴箱 ; 超低温冰箱 (Forma Scientific Inc.); 超纯水制备系统 (Labconco Water PROTMPS); 微量加样器 ( 吉尔森公司 ); 一次性培养瓶 (Geriner 或 Corning 公司 ); 一次性培养皿 (Geriner 或 Corning 公司 ); 一次性培养板 (Geriner 或 Corning 公司 );10 ml/5 ml 一次性吸管 (Corning 公司 );200 目不锈钢筛网 ( 上海实生公司 ); 冻存管 (eriner 或 Corning 公司 ); 注射器 (BD 公司 ) 1.2 方法 SMSCs 分离培养取 5 只新西兰大白兔, 耳缘静脉麻醉后刮净膝关节处兔毛, 于后肢根部绑止血带, 使用 75% 的酒精对兔双侧膝关节进行消毒 3 遍, 铺无菌巾, 于膝关节的前内侧切开皮肤和皮下组织, 将膝关节充分暴露, 再用尖刀片于膝关节双侧关节囊内表面获取滑膜组织, 将其存放于无菌性的干净的容器内, 在低温状态下迅速转到超净工作台关节腔用 ml 生理盐水冲洗, 结扎止血, 由内到外依次缝合伤口滑膜组织提取后转移至平皿内, 使用无菌含双抗的 PBS 冲洗 3 遍, 滑膜组织上的脂肪和肌肉组织使用无菌的尖刀仔细刮除, 再在一个新的培养皿用 PBS 冲洗 3 次滑膜组织将冲洗干净后的滑膜组织转移至第 3 个培养皿, 滑膜组织全部浸泡于 PBS 中, 无菌刀片将滑膜组织修剪为 1 cm 1 cm 大小组织块, 再将组织块置于 200 目不锈钢滤网中, 用约 100 ml PBS 冲洗, 尽量清除血液细胞用一个新培养皿存放修剪过后的组织块, 添加 10 ml DMEM 培养基, 培养基含 20% 的 FBS 及 2 mg/ml 的 Ⅱ 型胶原酶于 37 5%CO 2 条件下消化 14 h,200 目不锈钢滤网过滤小组织块, 过滤过程中用约 100 ml PBS 冲洗用无菌性的移液管将过滤后的液体加入到离心管内, 培养皿滤器用 PBS 冲洗, 尽量获得细胞 r/min 离心滤液 10 min, 去除上清液,20 ml PBS 重悬,1 000 r/min 离心滤液 10 min, 离心后将离心管上清液吸除, 如此反复次数为 3 次, 目的是将胶原酶从中分离出

3 778 临床与病理杂志, 2016, 36(6) 去离心之后, 收集细胞, 将细胞转到已添加了 10% 的小牛血清的 DMEM 培养基培养皿内, 培养 2 d 时间后第 1 次对培养基进行更换, 以后对培养基进行更换的时间均为间隔 2 d 当显微镜下显示培养皿内布满细胞时,0.05% 胰蛋白酶处理细胞, 并将获得的细胞分离培养和传代, 每天用显微镜查看细胞并记录成软骨分化将第 3 代 SMSCs 制作成悬液, 然后转移到 24 孔板内培养, 浓度设定为个 /ml,3 h 细胞贴壁后添加软骨诱导液 ( 含 10 ng/ml TGF-β μg/ml 胰岛素 50 μg/ml 抗坏血酸 6.25 μg/ml 转铁蛋白 1.25 mg/ml BSA 6.25 μg/ml 亚硒酸 5.35 mg/ml 亚麻酸 100 nmol/l DEX 的 DMEM 的培养基 ), 以基础培养液为参照组每次换新的培养液时间间隔是 48 h,21 d 以后不再更换培养液, 甲苯胺蓝染色, 倒置显微镜查看染色情况成骨分化将第 3 代 SMSCs 制作成悬液, 然后转移到 24 孔板内培养, 浓度设定为个 /ml,3 h 细胞贴壁后添加成骨诱导液 ( 含 100 nmol/l DEX 10 mmol/l β- 甘油磷酸钠 0.2 nmol/l ASA 的 DMEM 的培养基 ) 每次换新的培养液时间间隔是 48 h,21 d 以后不再更换培养液, 碱性磷酸酶染色, 倒置显微镜查看染色情况成脂分化将第 3 代 SMSCs 制作成悬液, 然后转移到 24 孔板内培养, 浓度设定为个 /ml,3 h 待细胞贴壁后添加诱导液 ( 含 1 μmol/l DEX 100 μmol/l 吲哚美辛 0.5 mmo/l 3- 已丁基 -1- 甲基黄嘌呤 10 μg/ml 胰岛素的 DMEM 的培养基 ) 诱导细胞成脂分化, 每次换新的培养液时间间隔是 48 h,21 d 以后不再更换培养液, 油红染色, 倒置显微镜查看染色情况正交实验设计查阅相关文献, 筛选出 TGF-β1 BMP-2 bfgf IGF BMP-7 AsA Dex 作为体外诱导 SMSCs 向透明软骨分化的条件, 通过 SPSS22.0 统计软件设计 L8(27) 正交实验及表头 ( 见表 1), 纳入 2 水平 ( 见表 2) 正交实验,2 水平值参考文献获得采用流式细胞仪检测 CD151 + /CD44 + 细胞数, 并记录为 N 值, 免疫组织化学染色检测高表达 ColⅡ 的 Ⅱ 型胶原细胞与软骨细胞总数的比值, 该比值视为透明软骨转化率 (N), 设定 rate 为检验指标,rate 为 CD151 + /CD44 + 细胞数乘以 N 所得结果, 对所得的结果进行采用免疫组化甲苯胺蓝染色证实表 1 实验所用正交实验表 ( 各因素不同水平详见表 2) Table 1 Orthogonal experimental design (levels of factor detailed in the Table 2) ASA BMP-2 IGF TGF-2l DEX BMP-7 bfgf 表 2 正交试验水平和条件 Table 2 levels and parameters of Orthogonal experimental 诱导因素水平条件 1 水平条件 2 TGF-β1/ng ml BMP-2/ng ml bfgf/ng ml IGF/ng ml ASA/μg ml DEX/nmol L BMP-7/ng ml

滑膜间充质干细胞向透明软骨分化条件的体外研究胡伟全, 等 779 1.3 统计学处理将最典型的那组动物的转化率作为实验的转化率, 正交试验结果使用主体间方差分析及直接观察, 当 P 值小于 0.05 时认为具有显著性差异 2 结果 2.

2 SMSCs 鉴定经过 21 d 的成脂诱导后, 油红染色后细胞内出现圆形的脂肪滴被染色成了红色, 表明 SMSCs 成功分化成了脂肪细胞 ; 经过 21 d 的成骨诱导后, 碱性磷酸酶染色显示细胞质内有灰黑色颗粒状或块状物质形成, 表明 SMSCs 分化为骨细胞 ; 经过 21 d 的成软骨诱导后,

3 正交实验直观观察及主体间方差分析结果正交实验采用直观观察和主体间方差分析进行比较 ( 见图 3-4), 直观观察可见 TGF- 察可作用最强, 其次为 BMP-7, DEX 作用最弱, 主体间方差分析显示 TGFβ1 bfgf IGF BMP-7 AsA 可以显著影响 SMSCs 向透明软骨分化, 其中

倒置显微镜下判断各组甲苯胺蓝染色深度及区域,Ⅱ 型胶原阳性细胞数量与 Ⅰ 型胶原染色阳性细胞数量比值, 甲苯胺蓝染色和免疫组化染色结果与直观观察主体间方差分析结果大致相符 ( 见图 5) A B 图 1 原代及第三代 SMSCs( 倒置相差显微镜 40) Figure 1 The primary and

4 滑膜间充质干细胞向透明软骨分化条件的体外研究胡伟全, 等统计学处理将最典型的那组动物的转化率作为实验的转化率, 正交试验结果使用主体间方差分析及直接观察, 当 P 值小于 0.05 时认为具有显著性差异 2 结果 2.1 原代的滑膜组织细胞形态学观察原代的滑膜组织细胞呈圆形或者梭型, 突起较多, 细胞间差异性较为明显培养 12 天后, 细胞的形状逐渐变得较为一致, 呈向心性分布 ( 见图 1) 2.2 SMSCs 鉴定经过 21 d 的成脂诱导后, 油红染色后细胞内出现圆形的脂肪滴被染色成了红色, 表明 SMSCs 成功分化成了脂肪细胞 ; 经过 21 d 的成骨诱导后, 碱性磷酸酶染色显示细胞质内有灰黑色颗粒状或块状物质形成, 表明 SMSCs 分化为骨细胞 ; 经过 21 d 的成软骨诱导后, 甲苯胺蓝染色后细胞外基质为蓝色改变, 这提示在细胞外基质有糖胺聚糖合成, 表明 SMSCs 分化为骨细胞 ( 见图 2) 2.3 正交实验直观观察及主体间方差分析结果正交实验采用直观观察和主体间方差分析进行比较 ( 见图 3-4), 直观观察可见 TGF- 察可作用最强, 其次为 BMP-7, DEX 作用最弱, 主体间方差分析显示 TGFβ1 bfgf IGF BMP-7 AsA 可以显著影响 SMSCs 向透明软骨分化, 其中 TGFβ1 BMP-7 差异性最为显著, 直接观察结果与主体方差分析结果相似实验表明这七种因素中对 SMSCs 分化为透明软骨影响最大的是 TGFβ1, 紧接着是 BMP-7,DEX 在其中发挥作用最弱 8 组 SMSCs 依照正交实验表进行诱导分化后分别进行甲苯胺蓝染色和免疫组化染色, 倒置显微镜下判断各组甲苯胺蓝染色深度及区域,Ⅱ 型胶原阳性细胞数量与 Ⅰ 型胶原染色阳性细胞数量比值, 甲苯胺蓝染色和免疫组化染色结果与直观观察主体间方差分析结果大致相符 ( 见图 5) A B 图 1 原代及第三代 SMSCs( 倒置相差显微镜 40) Figure 1 The primary and 3rd generation of SMSCs(Magnification 40) A B C 图 2 SMSCs 多向分化鉴定 Figure 2 Differentiation identification of SMSCs (A) 成软骨分化 ( 甲苯胺蓝, 100);(B) 成脂分化 ( 油红, 100);(C) 成骨分化 ( 碱性磷酸酶染色, 100) (A) chondrogenic (toluidine blue stain, 100); (B) adipogenic differentiation (Oil red O staining, 100); (C) osteogenic differentiation (alkaline phosphatase staining, 100).

780 临床与病理杂志, 2016, 36(6) http://lcbl.amegroups.com ASA BMP-2 IGF TGF-β1 DEX BMP-7 bfgf Rate 1 1 1 1 1 1 1 18.156 1 1 1 2 2 2 2 31.374 1 2 2 1 1 2 2 19.546 1 2 2 2 2 1 1 41.697 2 1 2 1 2 1 2 35.

009 29.306 23.172 30.229 35.796 28.681 K2 34.55 32.234 32.938 39.071 32.014 26.447 33.563 极差 27.426 8.899 14.528 63.596 7.142 37.394 19.

5 780 临床与病理杂志, 2016, 36(6) ASA BMP-2 IGF TGF-β1 DEX BMP-7 bfgf Rate K K k K 极差图 3 实验所用正交实验表及结果 ( 各因素不同水平详见表 2) Figure 3 Results of orthogonal experimental (levels of factor detailed in the Table 2) 主旨间效果检定因变数 :Rate 来源第 Ⅲ 类平方和 df 均方 F 显著性修正模型 a 截距 ASA BMP IGF TGF-β DEX BMP bfgf 误差总计矫正后总计 a, R 2 =0.925( 调整后 R 2 =0.904) 图 4 正交试验进行方差分析所得结果 Figure 4 Results of variance analysis of orthogonal experimental A B 图 5 细胞支架复合物行甲苯胺蓝染色及 Ⅱ 型胶原免疫组化染色 Figure 5 Toluidine blue stain and immunohistochemistry stain of collagen Ⅱ of cell-scaffold composite (A) 14 d 之后细胞支架复合物行甲苯胺蓝染色结果 ( 100);(B)Ⅱ 型胶原免疫组化染色结果 ( 200) (A) Toluidine blue stain of cell-scaffold composite cultured for 14 days ( 100); (B) Immunohistochemistry stain of collagen Ⅱ( 200).

6 滑膜间充质干细胞向透明软骨分化条件的体外研究胡伟全, 等讨论关节软骨通过减少关节面之间的摩擦有助于使关节更为灵活, 当因为外伤或者退化使软骨出现缺损的时候, 由于其营养物质主要来自于滑液, 自身缺少神经血管, 再生能力很差, 最终常发展为骨关节炎, 给患者带来疼痛活动功能障碍等痛苦, 同时也给国家及家庭带来经济损失目前临床上治疗软骨损伤常用的方法有口服止痛保护软骨的药物, 关节腔内药物注射及手术等, 这些方法均在短期内表现出缓解疼痛改善功能的作用, 但均不能让受损的软骨回受损前的状态, 距离治疗的时间越久, 患者对于治疗效果越不满意在理论情况下, 如果能够依靠组织工程的手段, 让分化成熟的透明软骨细胞去修补缺损的软骨, 有助于避免关节继续发展成为骨关节炎目前使用组织工程修复软骨的想法是采用合适的种子细胞进行增殖和诱导分化, 再移植到软骨缺损处, 从而修复损伤的软骨目前组织工程中骨髓脂肪及滑膜来源的干细胞是较为常用的种子细胞, 应用最常使用的是骨髓脂肪来源的干细胞 [4-5] 这两种干细胞在诱导软骨再生方面表现出较为理想的潜能, 在适当的诱导条件下, 均可以有效地向透明软骨分化, 但由于合适的细胞浓度植入技术支架生长因子有待于进一步探索及诱导出的软骨细胞易出现软骨肥大移植到活体动物体内后出现矿物质化等原因, 目前, 尚无合适的诱导方法产生稳定的透明软骨 [6] 近年来, 由于滑膜组织可在膝关节镜检查时获得, 来源充足, 且对膝关节结构与功能无明显影响其次由于 SMSCs 扩增稳定, 多次传代后依然具有多向分化潜能,SMSCs 越来越多应用于组织工程修复透明软骨, 表现出优异的应用前景这次实验中, 我们先用 Ⅱ 型胶原酶消化从兔膝关节内获得的滑膜组织细胞, 使用有限稀释法获取 SMSCs, 在倒置显微镜下查看细胞的形态, 并诱导细胞向骨软骨脂肪分化, 分别染色实验在南京军区南京总医院的伦理委员会批准后进行再通过 SPSS22.0 统计软件设计 L8(27) 正交实验及表头, 定义 2 水平条件, 诱导因素及水平条件通过阅读文献获得采用流式细胞仪检测 CD151 + /CD44 + 细胞数, 免疫组织化学染色检测高表达 ColⅡ 的 Ⅱ 型胶原细胞与软骨细胞总数的比值, 该比值视为透明软骨转化率 (N), 设定 rate 为检验指标,rate 为 CD151 + /CD44 + 细胞数乘以 N 所得结果对所得的结果进行采用免疫组化甲苯胺蓝染色证实, 正交试验结果的分析使用主体间方差分析法及直接观察法实验中, 实验第 2 天使用显微镜查看细胞时发现细胞形态呈圆形或者梭型, 突起较多, 细胞间形态差异较大, 培养 12 d 后, 细胞的形状逐渐变得较为一致, 呈向心性分布成脂诱导显示细胞内有圆形红色脂滴, 成骨诱导后显示细胞质内有灰黑色颗粒状或块状物质形成, 成软骨诱导后可见蓝色的细胞外基质, 这 3 种染色成功证明 SMSCs 能够分化为多种细胞, 具备了干细胞的特征通过对兔 SMSCs 的分离与鉴定表明,SMSCs 扩增稳定, 具有多项分化潜能, 由于是采用自体细胞进行诱导分化, 不存在免疫排异反应, 同时, 既往研究表明, 相比较其他的两种干细胞而言,SMSCs 在向透明软骨方向分化中表现更为优异, 同时其形成骨细胞脂肪细胞的能力较弱的优点, 在组织工程修补缺损软骨的时候可以选用 SMSCs [7] 正交实验最后结果证明 TGF-β1 bfgf IGF BMP-7 ASA 在 SMSCs 向透明软骨分化的过程中均发挥重要作用,7 种因素中 TGF-β1 对分化过程影响最强, 而地塞米松影响最为微弱直观观察结果显示 TGF-β1 作用最强, 其次为 BMP-7,DEX 作用最弱直接观察和主体方差分析结果均表明, TGFβ1 为诱导 SMSCs 向透明软骨分化最为重要的因素, 其次为 BMP-7,DEX 作用最弱 TGF-β 家族是启动 SMSCs 向软骨细胞分化的重要因素, 有研究表明 TGFβ1 活性异常是类风湿关节炎及骨关节软骨退变的重要启动因素 [8], 全身性或局部性 TGFβ1 活性缺失时, 可引起关节软骨的破坏 TGF-β 家族主要是通过经典 Smad(drosophila mothers against decapentaplegic protein) 信号通路和非 Smad 信号通路诱导软骨分化 [9] 其在经典 Smad 信号通路中, 可以通过 Smad2/3 促进 Ⅱ 型胶原合成增加, 同时核心结合因子 (runt related gene-two,runx2) 诱导的基质金属蛋白酶 3(matrix metalloproteinase3, MMP-3) 表达较少,Smad7 还可以对该通路进行反馈调节, 使软骨合成有序进行非 Smad 信号通路是另外一条 TGF-β 诱导软骨形成的通路当 TGF-β 激活了 TGF-βⅡ 型受体 AKT-mTOR 信号通路时, 与细胞外基质相关的基因表达就会上升, 当 AKT 的活性受到抑制的时候,Ⅱ 型胶原的合成也受到抑制 [10] 体外实验中,TGF-β 过度表达可增强 SMSCs 增殖及成软骨能力, 不会影响 SMSCs 的表型, 将 TGF-β 和 SOX9 共同转染细胞时, 可以促

7 782 临床与病理杂志, 2016, 36(6) 进细胞增殖生物合成和成软骨活性 [11-12] 让软骨细胞表达 TGF-β1, 然后将该细胞注射进入关节腔内, 临床试验表明其可以缓解膝关节疼痛改 [13] 善膝关节功能和生活质量但 Zhen 等认为, 软骨下骨内 TGF-β1 处于高浓度状态成骨细胞表达 TGF-β1 的时候, 关节可以逐渐形成骨关节炎, 如果抑制 TGF-β1 的活性, 软骨退变就会延缓, 尤其当敲除 GF-βⅡ 型受体时, 可以明显延缓骨关节炎进展, 因而作者认为抑制 TGF-β1 活性有助于骨关 [14] 节炎的治疗 Xie 等采用 TGF-β 中和抗体 1D11 抑制 TGF-β1 活性时, 亦得到同样结论 BMP 隶属于 TGF-β 家族, 其也是通过 Smad 信号通路或者非 Smad 信号通路诱导软骨形成 [15-16] 本次实验中,BMP-7 被证明较 BMP-2 可以更有效的促进 SMSCs 向软骨细胞转化 BMP-2 在诱导间充质干细胞形成脂肪细胞或者骨细胞时, 在 25~100 ng/ml 区间内效应与剂量呈正相关, 当超过 100 ng/ml 时, 其诱导分化作用逐渐减弱 [17], 本实验中 BMP-2 在 [18] 100~500 ng/ml 区间作用无明显差异, 亦有研究表明, 单独采用含 BMP-2 的腺病毒转染细胞时, 糖胺聚糖合成减少, 而与肥大相关基因如 X 型胶原及成骨相关基因如碱性磷酸酶表达增高, 这些对于 [19] 透明软骨行成不利体外实验表明,BMP 可以促进 Ⅱ 型胶原及黏多糖合成, 亦可以抑制 MMP-2 MMP-13 表达, 后者是主要的 Ⅱ 型胶原酶, 能够直接破坏细胞外基质在实验中,BMP 常与其他细胞因子联用使用用于促进软骨形成, 最常见的是与 TGF-β 联合使用当 BMP 与 TGF-β 共同作用于 SMSCs 时,TGF-β 可以增强 BMP 成软骨作用, 还可以抑制软骨细胞向肥大细胞分化 [20] 当 BMP 与更多促软骨形成物质联用时, 其促软骨形成能力将进一步加强 [21] IGF-1 IGF-2 都是属于 IGF,IGF-1 在促进细胞向透明软骨形成和提高细胞外基质的合成中表现得更为优异 [22-23], 还可以抑制白介素 -1 升高, 白介素增高可以抑制蛋白激酶 A 活性及 SOX9 磷酸化, 其中 SOX9 在促进 Ⅱ 型胶原糖胺聚糖表达发挥着重要的作用当 SOX9 表达时,Runx2 的表达 [24] 就减少, 对成骨有抑制作用 Zhou 等仅仅研究 IGF 一种因素在间充质干细胞向透明软骨转化时, 观察到 Ⅱ 型胶原 SOX9 糖胺聚糖基因的表达和蛋白的合成量提高, 在软骨形成方面,IGF-1 的影响较 IGF-2 更为明显 FGF 与 IGF 作用机制相似, 实验表明 FGF 可以促进细胞增殖, 减少细胞倍增时间, 同时对细胞表型无影响 [25], FGF 也可以依赖 SOX9 提高 Ⅱ 型胶原的合成量, 在间充质干细胞向软骨转化中扮演重要角色 [26-27] 但也有不一致的研究报道,bFGF 在调节细胞外基质的合成分解起着重要的作用, 在软骨诱导形成中有着和 TGF-β 相反的效果 ASA 在 MSCs 证明其有明显促进成骨作用, 但其在成软骨作用中研究较少, 本实验中, ASA 亦可以促进 SMSCs 向软骨转化, 但较 TGF-β1 与 BMP-7 弱地塞米松促进软骨形成的机制不太明确, 它既可以抑制 TGF-β1 诱导软骨形成, 又可以促进细胞外基质的表达 [28] [29], 既往研究表明, 当地塞米松浓度为 100 μm 时, 糖皮质激素可能通过抑制 p38 MAPK 抑制 Sox9 表达, 除此之外, 它还可以促进 Fas/FasL 基因表达, 这将促使软骨细胞加速凋亡, 这种抑制效果在浓度为 25 μg/ml 的时候表现得最为突出本次实验结果表明, 地塞米松无明显促 SMSCs 向软骨细胞转化的能力综上所述,SMSCs 分化潜能在体外可以稳定增殖, 是组织工程修复透明软骨的理想种子细胞通过正交实验发现, 直接观察及主体方差分析结果均表明, 较其他 6 种因素,TGF-β1 促进 SMSCs 向透明软骨的能力最强, 其次是 BMP-7, 而地塞米松影响较弱通过合理调节各因素浓度及选用合适的细胞因子, 可以有效得调节 SMSCs 向透明软骨分化但考虑到实验包含的调节因子较少, 更为合适的调控因素不同浓度之间的组合有待于进一步研究参考文献 1. Kaderli S, Boulocher C, Pillet E, et al. A novel biocompatible hyaluronic acid-chitosan hybrid hydrogel for osteoarthrosis therapy[ J]. Int J Pharm, 2015, 483(1-2): Koh YG, Kwon OR, Kim YS, et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells with microfracture versus microfracture alone: 2-year followup of a prospective randomized trial[ J]. Arthroscopy: The Journal of Arthroscopic & Related Surgery, 2016, 32(1): Reissis D, Tang QO, Cooper NC, et al. Current clinical evidence for the use of mesenchymal stem cells in articular cartilage repair[ J]. Expert Opin Biol Ther, 2016, 16(4): Latief N, Raza FA, Bhatti FU, et al. Adipose stem cells differentiated chondrocytes regenerate damaged cartilage in rat model of osteoarthritis[ J]. Cell Biol Int, 2016, 40(5): Nakagawa Y, Muneta T, Otabe K, et al. Cartilage derived from bone marrow mesenchymal stem cells expresses lubricin in vitro and in

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生长因子用于软骨修复的研究进展胡伟全, 等 475 微环境 4 大要素生长因子以其可调节软骨细胞基质的合成代谢以及软骨形成, 引起了人们的重视, 但理想的生长因子及其组合用于软骨修复尚处于探索中本文就转录生长因子 - β 骨形态发生蛋白胰岛素样生长因子等的最新研究做一综述, 探索各

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