标题

Size: px

Start display at page:

Download "标题"

陪刊章
5 years ago
Views:

1 ２０１５年生第１０卷第６期ꎬ１８１１９０态毒理学报 Asian Journal of Ecotoxicology Vol. 10, 2015 No.6, DOI: /AJE 陶贤继, 黎翠兰, 刘冬雨, 等. 食物源 nc60 损害斑马鱼脑鳃肾和肝胰腺正常机能[J]. 生态毒理学报ꎬ2015, 10(6): Tao X J, Li C L, Liu D Y, et al. The dietary uptake of nanocrystals (nc60 ) decreases the functions of gill, kidney and hepatopancreas of zebrafish (Danio rerio) [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(6): (in Chinese) 食物源ｎｃ６０损害斑马鱼脑鳃肾和肝胰腺正常机能陶贤继1 ꎬ 黎翠兰1 ꎬ 刘冬雨1 ꎬ 魏华2,* ꎬ 何义亮3 ꎬ 吕为群1 1. 上海海洋大学水产与生命学院上海海洋大学水产动物遗传与育种中心ꎬ上海上海农林职业技术学院ꎬ上海上海交通大学环境科学与工程学院ꎬ上海收稿日期: 录用日期: 摘要: 水体中稳定存在的富勒烯纳米晶体(nC60 )可被浮游动物滤食ꎬ并通过食物链传递到更高营养级生物ꎮ 为探究食物源 nc60 的生物效应ꎬ本试验选取携带 nc60 的大型溞喂养斑马鱼 21 dꎬ考察了食物源 nc60 对斑马鱼脑鳃肾和肝胰腺 4 个器官中 ROS Na K ATPase Ca2 ATPase 酸性磷酸酶(ACP) 碱性磷酸酶(AKP) 谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)活性等指标ꎬ用以评价食物源 nc60 对斑马鱼的机能影响ꎮ 暴露于食物源 nc60 下的结果表明:斑马鱼脑 ROS 随时间增加而增加ꎬ暴露 21 d 后增加了 79.17% ꎮ 鳃肾 Na K ATPase 活性随暴露时间增加而降低ꎬ暴露 21 d 后分别降低了 47.09% 和 51.07% ꎻ鳃肾 Ca2 ATPase 活性随暴露时间增加而减少ꎬ暴露 21 d 后分别降低了 28.28% 和 35.13% ꎮ 鳃肾肝胰腺 AKP 活性随时间增加而增加ꎬ暴露 21 d 后分别增加 45.97% 26.68% 和 83.01% ꎻ鳃肾肝胰腺 ACP 活性随时间增加而增加ꎬ暴露 21 d 后分别增加 38.85% 84.12% 和 55.77% ꎮ 肝胰腺 GPT 和 GOT 活性随时间增加而降低ꎬ暴露 21 d 后各降低了 50.05% 和 76.50% ꎮ 本研究不但阐述了食物源 nc60 降低高一级水生动物(斑马鱼)脑鳃肾和肝胰腺的正常机能ꎬ而且为进一步研究食物源 nc60 对水生生物的生态毒理提供了部分基础数据ꎮ 关键词: 富勒烯ꎻ纳米水稳型 C60 ꎻ大型溞ꎻ斑马鱼文章编号: (2015) 中图分类号: X171.5 文献标识码: A ＴｈｅＤｉｅｔａｒｙＵｐｔａｋｅｏｆＮａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ ( ｎｃ６０ ) ＤｅｃｒｅａｓｅｓｔｈｅＦｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆＧｉｌｌꎬ ＫｉｄｎｅｙａｎｄＨｅｐａｔｏｐａｎｃｒｅａｓｏｆＺｅｂｒａｆｉｓｈ ( Ｄａｎｉｏｒｅｒｉｏ) Tao Xianji1, Li Cuilan1, Liu Dongyu1, Wei Hua2,*, He Yiliang3, Lu Weiqun1 1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai Ocean University Aquatic Animal Breeding Center, Shanghai , China 2. Shanghai Vocational College of Agriculture and Forestry, Shanghai , China 3. School of Environmental Science and Engineering, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai , China Ｒｅｃｅｉｖｅｄ 27 April 2015 ａｃｃｅｐｔｅｄ 15 June 2015 Ａｂｓｔｒａｃｔ: Aqueous stable fullerene nanocrystals (nc60 ) can be filtered by zooplanktons, and sequentially trans ferred to upper trophic level organisms. To investigate the dietary biological effects of nc60, Daphnia magna with 基金项目:国家自然科学基金( )ꎻ国家海洋局公益项目( ); 上海市知识服务平台上海海洋大学水产动物遗传与育种中心 (ZF1206) 作者简介:陶贤继(1975 )ꎬ男ꎬ博士ꎬ研究方向为水生动物生理学ꎬE mail: xjtao@ shou.edu.cn * 通讯作者( Corresponding author) ꎬ E mail: weih@ shafc.edu.cn

2 182 生态毒理学报第 10 卷 cumulated nc 60 were fed to zebrafish for 21 d. The reactive oxygen species (ROS), Na K ATPase, Ca 2 ATPase, alkali phosphatase (AKP), acid phosphatase (ACP), glutamic pyruvic transaminase (GPT), and glutamic oxalacetic transaminase (GOP) were measured in the brain, gills, kidney, and hepatopancreas to investigate the dietary effects on zebrafish organs. The dietary exposure results indicated that dietary nc 60 increased the ROS production in brain tissues with increasing experimental time, and finally increased by 79.17%. The Na K ATPase activities in the gills and kidney tissues decreased with increasing experimental time, and finally decreased by 47.09% and 51.07%, respectively. The Ca 2 ATPase activities in the gills and kidney tissues decreased with increasing experimental time, and finally decreased by 28.28% and 35.13%, respectively. The AKP activities in the gills, kidney and hepatopan creas tissues were increased with increasing experimental time, and finally increased by 45.97%, 26.68% and 83.01%, respectively. The ACP activities were increased with increasing experimental time, and finally increased by 38.85%, 84.12%, and 55.77%, respectively. The GPT and GOT activities in the hepatopancreas were decreased with the increasing experimental time, and finally decreased by 50.05% and 76.50%, respectively. In summary, this study not only describes the decreased functions of the brain, gill, kidney and hepatopancreas as a result of dietary nc 60 in upper trophic level organisms (zebrafish), but also provides fundamental data regarding the dietary effects of nc 60 on aqueous organisms for the further eco toxicological study. Keywords: fullerene (C 60 ); aqueous stable fullerene nanocrystals (nc 60 ); Daphnia magna; Danio rerio 由于具有碳原子构成的足球结构 ꎬ 富勒烯 (C 60 ) 形成了特殊的碳 π 键和笼状结构 ꎬ 可以进行加成衍生和包埋 ꎬ 因此被广泛应用于防晒霜药物传递载体和有机磁体等产品 [1] ꎮ 随着大规模的生产与应用 ꎬC 60 通过废弃和泄露等方式进入周围环境 ꎬ 最终随着降雨等进入水中 ꎮ 欧洲城市污水处理厂的排放水中已检测出含有 C 60 [2] ꎮ C 60 在水体中可通过多种途径形成水稳型纳米晶体 C 60 (nc 60 ) [3] ꎮ 目前已知 nc 60 阻碍斑马鱼胚胎的发育并导致胚胎畸形水肿 [4] ꎻ 提高斑马鱼体内的氧化性 ꎬ 并抑制生长 [5] ꎮ 此前诸多报道均将斑马鱼直接暴露于 nc 60 悬浮液中以评价毒性效应和机制 ꎬ 而通过食物源 nc 60 暴露产生的风险尚未多见 [6] ꎮ 虽然已有关于金属 / 金属氧化物 TiO 2 Se ZnO Au 纳米颗粒通过食物链方式暴露造成风险的评价 [6 7] ꎬ 但是对于有机纳米颗粒 nc 60 的研究甚少 [8] ꎮ [8] 虽然 Fraser 等利用饲料中添加 nc 60 暴露给虹鳟幼鱼 ꎬ 但是利用天然水体初级消费者从水体中富集的 nc 60 ꎬ 并以此作为饵料喂养斑马鱼的评价尚未见报道 ꎮ 斑马鱼 (Danio rerio) 和大型溞 (Daphnia magna) 是 2 种评估环境毒性和风险的模式生物 ꎬ 本研究利用它们之间的捕食和被捕食的关系 ꎬ 评价食物源 nc 60 ( 大型溞携带 ) 给斑马鱼造成的影响 ꎮ 将斑马鱼暴露于食物源 nc 60 ( 大型溞携带 )ꎬ 构成了大型溞和斑马鱼两者间简单食物链节 ꎬ 有助于更好地探索可能存在的生态食物链风险 ꎮ 1 材料与方法 (Materials and methods) 1.1 化学试剂 C 60 购于美国 Materials Electronics Research Cor porationꎬ 纯度 99% ꎮ 四氢呋喃和甲苯 (99.9% ) 为液相色谱纯 ꎬ 购自 Fisher Scientific 公司 ꎮ 测试 ROS ACP 和 AKP ATPase GOT 和 GPT 的试剂盒购于南京建成生物工程研究所 ꎮ 其他相关试剂为分析纯或者优级纯 ꎬ 购于上海国药集团 ꎮ 1.2 试验生物大型溞 (Daphnia magna) 购于美国 Carolina Bio [9] logical Supply Companyꎬ 按 U.S. EPA 标准方法进行养殖 ꎮ 具体养殖条件如下 :12 h:12 h 昼夜周期 ꎬ (20 ± 1) ꎬ6.5 mg L 1 以上溶氧 ꎬ3 000 Lx 光强 ꎮ 每 [10] 日 8:00 16:00 喂食斜生栅藻 ( 水生 4 号培养基培养 )ꎬ 维持藻细胞密度为 (1±0.2) 10 5 藻细胞 ml 1 ꎮ 斑马鱼 (Danio rerio) 购于上海蓝天水族馆 ꎬ 体重为 (0.211±0.001) gꎬ 体长为 (23.45±0.01) mmꎮ 每 1 尾斑马鱼单独饲养于 1 个 80 ml 玻璃瓶 ꎬ 含水 50 mlꎮ 养殖用水提前曝气 24 hꎬ 每天更换 1/4ꎮ 维持 12 h: 12 h 昼夜周期 ꎬ(28 ± 0.5) ꎬ6.5 mg L 1 以上溶氧 ꎮ 用大型溞驯养 2 周 ꎬ 驯养期间内成活率 > 97% ꎮ 1.3 nc 60 制备 [11] nc 60 的制备参照 Tao 等方法进行 ꎮ 具体操作如下 : 称取 100 mg C 60 溶于 4 L 四氢呋喃 (THF) 中 ꎬ 冲氮气 (99.99% ) 去除顶部氧气 ꎬ 密封避光后搅拌

第6期陶贤继等:食物源 nc60 损害斑马鱼脑鳃肾和肝胰腺正常机能 24 hꎮ 使用分液漏斗将 250 ml 纯水加入等量搅拌的饱和 C60 THF 溶液中ꎬ持续搅拌 1 minꎮ 为除去 THF 和 THF 衍生物ꎬ 使用旋转蒸发仪 (Büchi Ro tovap system)蒸馏去 250 ml 体积ꎬ然后补加 250 ml 超纯水ꎬ重复蒸馏 3 次ꎮ 冷却 12

3 第6期陶贤继等:食物源 nc60 损害斑马鱼脑鳃肾和肝胰腺正常机能 24 hꎮ 使用分液漏斗将 250 ml 纯水加入等量搅拌的饱和 C60 THF 溶液中ꎬ持续搅拌 1 minꎮ 为除去 THF 和 THF 衍生物ꎬ 使用旋转蒸发仪 (Büchi Ro tovap system)蒸馏去 250 ml 体积ꎬ然后补加 250 ml 超纯水ꎬ重复蒸馏 3 次ꎮ 冷却 12 h 形成稳定平衡的悬浮液ꎬ用 0.22 μm 的醋酸纤维膜过滤后备用ꎮ 为１８３ Mg(ClO 4 )2 和 2 ml 甲苯ꎬ并充分混合ꎬ在恒温震荡仪(室温ꎬ300 r min 1 )中振荡萃取 8 hꎬ于 4 中静置 30 minꎬ 20 下冷冻ꎬ取上层甲苯相ꎬ测定 345 nm 波长的吸光度值ꎬ根据标准曲线( y = xꎬ x 为 OD 345 ꎬy 为 nc60 浓度(mg L 1 )ꎬR2 = )计算溶液中 C60 浓度ꎮ 大型溞体中 C60 的含量测定如下:取 20 了进一步去除 THF 及其衍生物ꎬ连续使用旋转超滤只暴露于 nc60 溶液(0.1 mg L 1 )4 h 的大型溞ꎬ用中杯氮气加压过滤 nc60 溶液 10 次(每次更换一半体等硬度水冲洗体表 3 次(去除体表 nc60 )ꎮ 之后吸干积溶剂)ꎮ 最后使用 GC MS 未检测到 THF 及其衍体表水分ꎬ加入 2 ml 超纯水ꎬ手动匀浆 15 minꎬ转生物的存在ꎮ 使用透射电镜观察制备的 nc60 (JEM 入 10 ml 棕色小瓶中ꎬ 然后重复水体中 C60 测定 2100F) (见图 1)ꎮ 步骤ꎮ １.５食物源ｎｃ６０对斑马鱼的毒性效应试验将携带 nc60 的大型溞喂养斑马鱼ꎬ用以评价食物源 nc60 对斑马鱼的毒性效应ꎮ 为保证采样数量(8 次 4 尾次 1 )ꎬ64 尾斑马鱼随机平均分配到含 nc60 组和无 nc60 组 2 个组ꎬ每组 32 尾(试验养殖条件与驯养条件相同)ꎮ 据斑马鱼对大型溞摄食预试验ꎬ每条斑马鱼每日投喂 16 只大型溞(分 4 次ꎬ日投饲率为 4% )ꎬ每次喂食后 2 h 去除斑马鱼的粪便ꎮ 分别投喂有/无 nc60 的大型溞作为食物ꎮ 试验为期 21 dꎮ 第和 21 天分别对 2 个试验组随图１ Fig. 1 １.４制备机采样 4 尾斑马鱼ꎬ取脑组织鳃肾和肝胰腺于生ｎｃ６０的透射电镜图理盐水(冰浴)中漂洗干净ꎬ然后用滤纸吸干后存放 Transmission electron microscope image of nc60 于液氮罐(不超过 1 周)ꎮ 为了较为全面的评价食物大型溞体内ｎｃ６０的生物累积及食物源ｎｃ６０的试验首先将大型溞暴露于最高无效应浓度(0.1 mg L )的 nc60 溶液中 1 [10] ꎬ用以确定大型溞体内 nc60 源 nc60 对脑细胞膜抗氧化鳃和肾的离子调节及相关能量提供ꎬ以及肝胰腺解毒功能和能量提供 3 个方面机能的影响ꎬ故此试验将检测斑马鱼脑活性氧自由基 (ROS)ꎬ 测定鳃肾中 Na K ATPase Ca2 ATPase 碱性磷酸酶 (AKP) 和酸性磷酸酶 (ACP) 活生物累积达到平衡的时间和最大累积量ꎮ 挑选 160 性ꎬ分析肝胰腺 AKP ACP 谷丙转氨酶(GPT)和谷只健康的 5 日龄幼溞(未怀卵)ꎬ用中等硬度水冲洗 3 草转氨酶(GOT)活性ꎬ以评价食物源 nc60 对鳃肝次ꎬ之后暂养 4 h 以除去肠道中的残渣ꎮ 然后暴露肾和肝胰腺产生的毒性效应ꎮ 于 100 ml 的 0.10 mg L 1 nc60 溶液中ꎬ 分别于 h 各取 20 只ꎬ用纯水冲洗 3 次(每次 5 min)ꎬ用于测定大型溞体内 nc60 的累积量ꎮ 试验确定 0.1 mg L 1 溶液中累积平衡时间为 4 hꎮ 将 5 日龄大型溞浸泡于 0.1 mg L 1 nc60 溶液中 4 h 之后ꎬ用纯水冲洗 3 次(每次 5 min)ꎬ冷冻干燥 8 １.６斑马鱼脑鳃肾肝胰腺组织前处理取脑组织于生理盐水(冰浴)中漂洗解冻ꎬ用滤纸吸干并称重ꎮ 以 1:20 的质量比(w/w )加入 4 匀浆介质(100 mmol L 1 磷酸缓冲液(PBS) ph 7.4)ꎬ冰浴下手动匀浆ꎬ于 r min 冷冻离心10 min (4 )ꎮ 取上清液 r min 1 再次冷冻离心 20 min h(冷冻干燥机ꎬ Labconco)ꎬ 密封存于 40 冰箱中 (4 )ꎬ然后用 100 mmol L 1 的 PBS 重悬沉淀(300 利用实验室原有方法测定水溶液和大型溞体内鳃肾肝胰腺组织于生理盐水(冰浴)中漂洗解备用ꎮ C60 的含量 [12] ꎮ 水中 C60 的含量测定如下:取 2 ml 滤液于 10 ml 棕色小瓶中ꎬ 加入 1 ml 0.1 mol L 1 μl ph 7.4)ꎬ混匀后待测ꎮ 冻ꎬ用滤纸吸干并称重ꎮ 以 1 9 的质量比(w/w)加 4 生理盐水ꎬ 手动匀浆后冷冻离心 (

4 １８４生态毒理学报第 10 卷 r min 1 10 min)ꎮ 取上清液ꎬ分别用生理盐水稀释成 2% 鳃肾和 1% 的肝胰腺组织匀浆液ꎬ待测ꎮ １.７斑马鱼脑鳃肾肝胰腺组织各参数的测定 ROS 的测定参考 Shao 等 [13] 的方法ꎬ 利用 DCFH DA(2,7 dichlorofuorescin diacetate) 在细胞内脂解后被活性氧氧化产生强绿色荧光的原理测定ꎮ 具体操作如下: 取 100 μl 的试样加 100 μl 的 4 μmol L 1 的 DCFH DAꎬ孵育 30 min(37 )ꎮ 使用荧光酶标仪(Biotek, Synergy H4)测定荧光强度(激发波长 488 nmꎬ发射波长 522 nm)ꎮ 结果以荧光强度 (fluorescence intensity)/毫克蛋白表示(fi mg pr. 1 )ꎮ Na K ATPase 活性参照 Leone 等 [14] 的方法测定ꎮ Ca2 ATPase 活性参考 Jiang 等 [15] 的方法测定ꎮ ATP 酶活力单位定义为:每小时每毫克组织蛋白的组织中 ATP 酶分解 ATP 产生 1 μmol 无机磷的量为图２一个 ATP 酶活力单位ꎮ 即微摩尔分子磷毫克蛋白 1 小时 1(μmol Pi mg pr. 1 h 1 )ꎮ Fig. 2 大型溞体内ｎｃ６０的累积 The nc60 accumulation in D. magna 酸性磷酸酶(ACP) 碱性磷酸酶(AKP)的活性参考 Tao 等 [16] 的方法测定ꎮ AKP 或 ACP 酶活力单位定义为:37 ꎬ每克组织蛋白与基质作用 15 min 或 30 min 产生 1 mg 酚定义为 AKP 或 ACP 的 1 个活力单位ꎮ 谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)的参照周顺伍等 [17] 的方法进行测定ꎮ GPT 和 GOT 单位定义为:37 ꎬ每克组织蛋白与基质作用 1 min 使吸光度每下降为 1 个活力单位ꎮ 脑鳃肾和肝胰腺组织蛋白含量采用考马斯亮蓝 Bradford 法测定ꎬ以牛血清白蛋白(BSA)为标准品ꎮ １.８数据统计与分析所有试验数据采用平均值±标准偏差(means±SD) 表示ꎻ使用 Microsoft Excel 2013 进行数据计算绘图图３和线性回归ꎻ采用 SPSS 19.0 进行方差分析ꎬ显著性水平设为 0.05(P < 0.05)ꎬ极显著差异为 0.01(P < 0.01)ꎮ ２２.１ Fig. 3 相比于空白组ꎬ大型溞体内 nc60 的含量随时间 The dietary nc60 in D. magna increased the ROS content in the zebrafish brain tissues 结果 ( Ｒｅｓｕｌｔｓ) 大型溞体内ｎｃ６０的累积食物源ｎｃ６０提高斑马鱼脑组织ＲＯＳ的含量２.２食物源ｎｃ６０促进斑马鱼脑组织ＲＯＳ产生相比于空白组ꎬ斑马鱼脑组织 ROS 含量随食物的延长不断增加ꎬ至 4 h 逐渐趋于平衡(图 2)ꎮ 根据源 nc60 暴露时间的延长不断增加ꎬ至 21 d 时达到最实验室已发表的研究 [12] 生物累积方程ꎬ计算得知此大值(图 3)ꎮ 从第 0 天至第 6 天ꎬnC60 缓慢提升脑组时大型溞 nc60 的累积量为 mg kg 1 湿重ꎮ 由于大型溞是一种喂养斑马鱼的优质天然饵料ꎬ故此研究选取了累积有 nc60 的大型溞作为斑马鱼饵料ꎬ 用以评价食物源 nc60 沿食物链传递的风险ꎮ 织中 ROS 含量ꎬ至第 9 天出现显著性增强(P < 0.05)ꎬ 并于 21 d 达到最大值(263 ± 1.68) FI mg pr. 1 ꎮ 第和 21 天分别比第 0 天增加了 37.61% 53.80% 66.59% 75.66% 和 79.17% ꎮ

5 第6期陶贤继等:食物源 nc60 损害斑马鱼脑鳃肾和肝胰腺正常机能２.３１８５食物源ｎｃ６０对斑马鱼鳃ＮａＫＡＴＰａｓｅＣａ２ＡＴＰａｓｅ和ＡＫＰＡＣＰ活性的影响食物源 nc60 降低斑马鱼鳃 Na K ATPase 和 Ca2 ATPase 的活性相比于空白组ꎬ 鳃 Na K ATPase 和 Ca2 AT Pase 活性随食物源 nc60 暴露时间的延长不断降低ꎬ 并在 21 d 降至最低值(图 4)ꎮ 食物源 nc60 组鳃 Na K ATPase 和 Ca2 ATPase 的活性呈逐渐降低趋势ꎬ 至 12 d 出现极显著性下降( P < 0.01)ꎬ最终于 21 d 达到最小值(2.12 ± 0.10)和(2.21 ± 0.08) μmol Pi mg Pr 1 h 1 ꎮ 第和 21 天ꎬ鳃 Na K ATPase 活性分别比第 0 天降低了 15.12% 22.55% 36.45% 和 47.09% ꎻ鳃 Ca2 ATPase 活性分别比第 0 天降低了 11.06% 11.19% 19.64% 和 28.28% ꎮ 食物源 nc60 增加斑马鱼鳃 AKP 和 ACP 活性相比于空白组ꎬ鳃 AKP 和 ACP 活性随食物源图４食物源ｎｃ６０降低斑马鱼鳃ＮａＫＡＴＰａｓｅ和Ｃａ２ＡＴＰａｓｅ活性 Fig. 4 The dietary nc60 decreased the activities of Na K ATPase and Ca2 ATPase in zebrafish gill tissues nc60 暴露时间的延长增加ꎬ在 21 d 增至最大值(图 5)ꎮ 食物源 nc60 组鳃 AKP 和 ACP 活性呈上升趋势ꎬ至 9 d 有显著性升高(P < 0.05)ꎬ最终于 21 d 达到最大值(23.11 ± 0.79)和(36.64 ± 1.12) U g Pr. 1 ꎮ 第和 21 天ꎬ鳃 AKP 活性分别比第 0 天增加了 % % % % 和 45.97% ꎻ鳃 ACP 活性分别比第 0 天增加了 23.83% 28.21% 28.82% 36.10% 和 38.85% ꎮ ２.４食物源ｎｃ６０对斑马鱼肾ＮａＫＡＴＰａｓｅＣａ２ＡＴＰａｓｅＡＫＰ和ＡＣＰ活性影响食物源 nc60 降低斑马鱼肾 Na K ATPase 和 Ca2 ATPase 的活性相比于空白组ꎬ 肾 Na K ATPase 和 Ca2 AT Pase 活性随食物源 nc60 暴露时间的延长不断降低ꎬ 并在 21 d 降至最低值(图 6)ꎮ 食物源 nc60 组肾 Na K ATPase 和 Ca2 ATPase 的活性呈下降趋势ꎬ至 9 d 有显著性降低(P < 0.01)ꎬ于 21 d 分别达到最小值 (0.74 ± 0.04)和(0.27 ± 0.03) Pi mg pr 1 h 1 ꎮ 第和 21 天ꎬNa K ATPase 活性分别比第 0 天降低了 % % % % 和 51.07% ꎻ Ca2 ATPase 活性分别比第 0 天降低了 10.04% 15.81% 16.82% 28.65% 和35.13% ꎮ 食物源 nc60 增加斑马鱼肾 AKP 和 ACP 的活性相比于空白组ꎬ肾 AKP 和 ACP 活性随食物源图５ Fig. 5 食物源ｎｃ６０增强鳃ＡＫＰ和ＡＣＰ活性 The dietary nc60 increased the activities of AKP and ACP in zebrafish gill tissues nc60 暴露时间的延长迅速增加ꎬ并在 21 d 增至最大值(图 7)ꎮ 食物源 nc60 组肾 AKP 和 ACP 活性呈上升趋势 ꎬ 至 9 d 有显著性升高 ( P <0.0 5 ) ꎬ 于 2 1 d 达

6 １８６生图６态食物源ｎｃ６０降低斑马鱼肾ＮａＫＡＴＰａｓｅ和ＣａＡＴＰａｓｅ活性２ Fig. 6 毒理学图８报第 10 卷食物源ｎｃ６０增强斑马鱼肝胰腺ＡＫＰ和ＡＣＰ活性 Fig. 8 The dietary nc60 decreased the activities of The dietary nc60 increased the activities of AKP and ACP in hepatopancreas tissues Na K ATPase and Ca ATPase in zebrafish kidney tissues 2 到最大值(17.33 ± 0.51)和(11.53 ± 0.54) U g pr. 1 ꎮ 第和 21 天ꎬ肾 AKP 活性分别比第 0 天增加了 7.83% 13.57% 14.90% 22.53% 和 26.68% ꎻ ACP 活性分别比第 0 天增加了 35.34% 39.30% 59.45% 80.35% 和 84.12% ꎮ ２.５食物源ｎｃ６０对斑马鱼肝胰腺ＡＫＰＡＣＰＧＰＴ和ＧＯＴ活性的影响食物源 nc60 增加斑马鱼肝胰腺 AKP 和 ACP 的活性相比于空白组ꎬ肝胰腺 AKP 和 ACP 活性随食物源 nc60 暴露时间的延长迅速增加ꎬ并在 21 d 时增至最大值(图 8)ꎮ 食物源 nc60 组肝胰腺 AKP 和 ACP 活性呈上升趋势ꎬ至 9 d 有显著性升高(P < 0.05)ꎬ于 21 d 达到最大值(24.18 ± 0.43)和(22.96 ± 1.07) U g 图７ Fig. 7 食物源ｎｃ６０增强肾ＡＫＰ和ＡＣＰ活性 The dietary nc60 increased the activities of AKP and ACP in zebrafish kidney tissues pr. 1 ꎮ 第和 21 天ꎬ肝胰腺 AKP 活性分别比第 0 天增加了 46.95% 57.11% 59.04% 68.14% 和 83.01% ꎻ肝胰腺 ACP 活性分别比第 0 天增加了 17.74% 25.52% 33.72% 41.88% 和 50.05% ꎮ

7 第6期陶贤继等:食物源 nc60 损害斑马鱼脑鳃肾和肝胰腺正常机能１８７量 [19] ꎮ Zhu 等 [19] Oberdörster 等 [20] 和朱小山等 [21] 各自通过体外直接暴露途径试验ꎬ都发现 nc60 可使斑马鱼脑产生过量 ROSꎬ出现氧化性损伤ꎮ 可见 nc60 在体外直接暴露条件下可致使脑部产生过量 ROSꎮ 本试验采用大型溞携带的 nc60 喂养斑马鱼ꎬ结果显示 nc60 可致使斑马鱼脑产生过量 ROSꎮ 由此可见ꎬ nc60 不论通过体外暴露途径ꎬ还是通过食物源暴露途径都使斑马鱼脑 ROS 含量升高ꎮ 过量的 ROS 可以导致细胞凋亡ꎬ异常诱发防御基因表达ꎬ异常动用离子通道等ꎮ 这些由于过量的 ROS 造成的鱼脑组织的毒性效应ꎬ将导致脑细胞像体外培养的细胞一样损坏 [22] ꎬ这些脑细胞的损伤将极大的导致脑功能的紊乱ꎮ 故食物源 nc60 和体外直接暴露 nc60 都可通过产生过量 ROS 损害脑组织正常功能ꎮ 其他纳米颗粒ꎬ如纳米银和纳米 TiO 2 也可以诱导脑组织产生过量 ROS [23 24] ꎬ故评价纳米颗粒物生物风险不能忽视纳米颗粒对脑部 ROS 的诱导产生现象ꎮ ３.２图９食物源ｎｃ６０降低斑马鱼肝胰腺ＧＰＴ和ＧＯＴ活性 Fig. 9 The dietary nc60 decreased the activities of GPT and GOT in zebrafish hepatopancreas tissues 食物源 nc60 降低斑马鱼肝胰腺 GPT 和 GOT 的活性相比于空白组ꎬ肝胰腺 GPT 和 GOT 活性随食物源 nc60 暴露时间的延长降低ꎬ并在 21 d 降至最小值(图 9)ꎮ 食物源 nc60 组肝胰腺 GPT 和 GOT 活性食物源ｎｃ６０抑制斑马鱼肾和鳃ＮａＫＣａ２离子的调节能力 Na K ATPase 和 Ca2 ATPaseꎬ 是普遍存在于细胞膜上的跨膜载体蛋白ꎬ参与调节细胞内 Na K 和 Ca2 浓度ꎬ在维持细胞的渗透压保持细胞的静息电位方面肌肉收缩和信号转导等方面起到主要作用 [25] ꎬ特别是在鳃和肾作为调节体内离子水平的重要器官ꎮ 鳃上氯细胞中存在大量的 Na K AT Pase Ca2 ATPase 和离子转运蛋白 [26] ꎬ 是调控离子水平的主要功能区域这些离子通道ꎻ同时肾在维持水盐平衡和调节渗透压方面有很重要的作用ꎬ并为大多数电解液重吸收和转运提供能量 [25] ꎮ 当通道酶有下降趋势ꎬ至第 9 天有显著性降低( P < 0.01)ꎬ于活性的降低时ꎬ其机体功能会部分丧失ꎮ Hou 等 [27] pr. 1 ꎮ 第和 21 天ꎬ肝胰腺 GPT 分别比从而抑制鱼体对 Na 和 K 等离子调节能力ꎮ 已有 21 d 达到最低值(17.29 ± 2.96)和(10.41 ± 1.41) U g 采用体外暴露表明 nc60 抑制 Na K ATPase 活性ꎬ 第 0 天增加了 17.74% 25.52% 33.72% 41.88% 和研究表明 nc60 可从小肠吸收进入鳃肾等器官 [28] ꎮ 35.38% 41.19% 51.12% 71.08% 和 76.50% ꎮ 间延长而不断降低斑马鱼鳃肾 Na K ATPase ３是食物源方式暴露都可以降低鱼的离子调节能力ꎮ 50.05% ꎻ 肝胰腺 GOT 活性分别比第 0 天增加了３.１讨论( Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ) 食物源ｎｃ６０氧化胁迫斑马鱼脑细胞膜活性氧(ROS)自由基包括超氧自由基过氧化氢过氧化物和羟基自由基等ꎬ是呼吸链的副产物ꎬ 当线粒体发生电子漏即氧与酶复合物直接结合ꎬ 机体将产生 ROS [18] ꎮ 由于 C60 特有的笼状结构ꎬ可使生物体产生单线态氧(1 O 2 )ꎬ提高生物体 ROS 含本试验从食物暴露途径进一步研究表明ꎬnC60 随时 Ca2 ATPase 的活性ꎮ 因此ꎬnC60 无论是直接暴露还也有其他研究表明ꎬnCu ntio 2 也产生抑制离子转运和离子浓度调节能力 [26, 29] ꎮ 因此ꎬ纳米颗粒在直接暴露和食物途径暴露时都可能存在降低鱼鳃离子调节能力的风险ꎮ 食物源 nc60 降低鳃肾 Na K ATPase 和 Ca2 ATPase 活性的原因可能是 nc60 可从小肠吸收进入鳃肾等器官 [28] ꎬ进而干扰膜蛋白的功

8 １８８生态毒理学报第 10 卷能和氧化损伤膜的结构发生泄漏 [22] ꎬ致使跨膜载体 GPT 从肝细胞逸出进入血液ꎬ提高血清中转氨酶水响降低活性ꎬ最终降低细胞对 Na K Ca2 离子调结果显示 nc60 抑制了肝胰脏 GOT 和 GPT 活性ꎬ即蛋白如 Na K ATPase 和 Ca ATPase 受膜电位影 2 节能力ꎮ 综合上述ꎬ食物源 nc60 影响 Na K ATPase 平 [37] ꎮ 本试验中斑马鱼喂食了大型溞携带的 nc60 ꎬ 抑制了肝细胞的转氨基作用ꎬ降低了肝细胞除去外和 Ca ATPase 的活性ꎬ从而影响生物体离子代谢ꎮ 来蛋白的能力ꎮ 由此可见ꎬ食物源 nc60 或其他纳米 Ca ATPase 活性影响的机制ꎮ 性ꎬ抑制氨基酸代谢能力ꎬ从而损害斑马鱼解毒能力ꎮ 2 将来研究尚需进一步确认 nc60 对 Na K ATPase 和 2 ３.３食物源ｎｃ６０降低斑马鱼肾肝胰腺的同化能量利用 AKP 和 ACP 都是水生生物体内极其重要的调控酶和水解酶ꎬ催化磷酸单脂水解和磷酸基团的转颗粒都可能会损害鱼和其他动物肝细胞ꎬ增加膜通透总之ꎬ食物源 nc60 胁迫斑马鱼脑细胞产生过量 ROSꎬ抑制鳃肾组织 Na K ATPase 和 Ca2 AT Pase 的调节能力ꎬ降低鳃肾和肝胰腺 ACP AKP 活移反应ꎬ破坏清除掉表面带有磷酸酯的异物ꎬ在营养性ꎬ减弱肝胰腺组织中 GPT 和 GOT 活性ꎮ 今后的物质的消化吸收和运转过程起着重要作用研究亟需探讨有机纳米 C60 颗粒在鱼体的蓄积量和 [16] ꎮ AKP 和 ACP 活性升高有利于斑马鱼相应组织的物分布等机体迁移行为ꎮ 质代谢ꎬ增加提供 ADP 磷酸化形成 ATP 所需的无机磷ꎬ增强机体在防御过程中的能量供应ꎮ 此试验通讯作者简介:魏华(1962 )ꎬ男ꎬ博士ꎬ教授ꎬ研究方向为鱼类结果表明ꎬ 食物源 nc60 提高肾肝胰腺的 AKP 和生理学ꎮ ACP 的活性ꎮ 其他纳米材料ꎬ如 Nano Zn 和 Nano Cuꎬ使得血清中 AKP 和 ACP 的活性显著升高 [30 31] ꎮ 由此可见ꎬnC60 和其他纳米颗粒增强血清和肝细胞等部位 AKP 和 ACP 的活性ꎬ增强细胞用于防御消参考文献( Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ) : [ 1 ] Langa F, Nierengarten J. Fullerenes: Principles and Appli cations [M]. UK London Cambridge: Royal Society of Chemistry, 2011: 耗的能量ꎬ减少细胞用于物质存储生长和分裂的能 [ 2 ] Gottschalk F, Sonderer T, Scholz R, et al. Modeled envi 量ꎬ降低同化作用的总能量ꎮ nc60 提高 AKP 和 ACP ronmental concentrations of engineered nanomaterials 的活性ꎬ其原因可能是受到食物源 nc60 的胁迫诱导 (TiO2, ZnO, Ag, CNT, fullerenes) for different regions [J]. 时ꎬ为克服 nc60 进入或防止中毒ꎬ机体会迅速做出 Environmental Science & Technology, 2009, 43 ( 24 ): 防御反应ꎬ诱导斑马鱼产生更多的 AKP 和 ACP [32] ꎬ 提供更多的能量用于防御ꎮ 由于肾和肝胰腺是 nc60 等主要代谢器官 [33] ꎬ需要对 nc60 进行转运和解毒ꎬ从而增加细胞用于此类活动的能量消耗ꎮ 这些器官细胞为了平衡代谢外物(nC60 )所消耗的大量能量ꎬ极大提高 AKP 和 ACP 活性 [34] ꎮ 将来内容需着重于 nc60 对 AKP 和 ACP 活性调控途径和作用机制研究ꎮ ３.４食物源ｎｃ６０损害斑马鱼肝胰腺解毒能力 [ 3 ] Andrievsky G V, Kosevich M V, Vovk O M, et al. On the production of an aqueous colloidal solution of fullerenes [J]. Journal of the Chemical Society, Chemical Communi cations, 1995, 12: [ 4 ] Usenko C Y. In vivo evaluation of carbon fullerene toxici ty using embryonic zebrafish [J]. Carbon, 2007, 45 (9): [ 5 ] Zhu X, Zhu L, Li Y, et al. Developmental toxicity in ze brafish (Danio rerio) embryos after exposure to manufac 肝脏是水生动物的重要的解毒和代谢器官ꎬ主 tured nanomaterials: Buckminster fullerene aggregates 要依靠转氨酶的作用去除(分解)异物蛋白(解毒)ꎮ (nc60 ) and fullerol [J ]. Environmental Toxicology and GOT 和 GPT 是肝脏细胞中重要氨基转移酶ꎬ它们 Chemistry, 2007, 26(5): 在蛋白质代谢中起着重要的转移氨基作用 [35] ꎬ可以将异物蛋白进行转氨基作用去除ꎮ 转氨酶活性越大ꎬ氨基酸转换作用越强ꎬ即转氨酶活性大小反映了 [ 6 ] Skjolding L M, Winther Nielsen M, Baun A, et al. Troph ic trasfer of differently functionalized zinc oxide nanopar ticles from crustaceans (Daphnia magna) to zebrafish (Da nio rerio) [J]. Aquatic Toxicology, 2014, 157: 氨基酸氧化代谢强度的大小ꎮ 有研究表明老鼠口服 [ 7 ] Lee W M, Yoon S J, Shin Y J, et al. Trophic transfer of 纳米银后ꎬ导致肝脏出现淋巴渗透的炎症ꎬ使得细胞 gold nanoparticles from Euglena gracilis or Chlamydo 受损ꎬ释放出 GOT 和 GPT 进入血液 [36] ꎮ Nano ZnO 也损害肝组织ꎬ 使细胞膜通透性增加ꎬ 使 GOT 和 monas reinhardtii to Daphnia magna [J]. Environmental Pollution, 2015, 201: 10 16

9 第 6 期陶贤继等 : 食物源 nc 60 损害斑马鱼脑鳃肾和肝胰腺正常机能 189 [ 8 ] Fraser T W. Dietary toxicity of single walled carbon nanotubes and fullerenes (C 60 ) in rainbow trout (On corhynchus mykiss) [J]. Nanotoxicology, 2011, 5(1): [ 9 ] EPA. Standard Operating Procedure for Mass Culture (Daphnia pulex) [S]. SoBranꎬ Cincinnati: EPA, 2004 [10] 余言想, 魏华, 陶贤继, 等. 纳米水稳型 C 60 (nc 60 ) 促进 Zn 2 和 Cr 6 在大型溞体内的吸收抗氧化性和急性毒性 [J]. 生态毒理学报, 2014, 9(3): Yu Y X, Wei H, Tao X J, et al. Aqueous stable fullerene nanocrystals nc 60 promoted the accumulation, anti oxi dation and acute toxicity of Zn 2 and Cr 6 on Daphnia magna [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2014, 9(3): (in Chinese) [11] Tao X, Yu Y, Fortner J D, et al. Effects of aqueous stable fullerene nanocrystal (nc 60 ) on Scenedesmus obliquus: E valuation of the sub lethal photosynthetic responses and inhibition mechanism [J]. Chemosphere, 2015, 122: [12] Tao X, He Y, Zhang B, et al. Effects of stable aqueous fullerene nanocrystal (nc 60 ) on Daphnia magna: Evalua tion of hop frequency and accumulations under different conditions [J]. Journal of Environmental Science, 2011, 23 (2): [13] Shao B. DNA damage and oxidative stress induced by en dosulfan exposure in zebrafish (Danio rerio) [J]. Ecotoxi cology, 2012, 21(5): [14] Leone F A, Garcon D P, Lucena M N, et al. Gill specific (Na, K ) ATPase activity and α subunit mrna expres sion during low salinity acclimation of the ornate blue crab Callinectes ornatus (Decapoda, Brachyura) [J]. Com parative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemis try and Molecular Biology, 2015, 186: [15] Jiang L, Bechtel M D, Bean J L, et al. Effects of ganglio sides on the activity of the plasma membrane Ca 2 AT Pase [J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Biomem branes, 2014, 1838(5): [16] Tao X, Wang C, Wei H, et al. Effects of dietary cholester ol levels on moulting performance, lipid accumulation, ecdysteroid concentration and immune enzymes activities of juvenile Chinese mitten crab Eriocheir sinensis [J]. Aq uaculture Nutrition, 2014, 20: [17] 周顺伍, 邹思湘, 姜涌明. 动物生物化学 ( 第三版 )[M]. 北京 : 中国农业出版社, 2003: [18] Buonocore G, Perrone S, Tataranno M. Oxygen toxicity: Chemistry and biology of reactive oxygen species [ J ]. Seminars in Fetal & Neonatal Medicine, 2010, 15(4): [19] Zhu S, Oberdörster E M H. Toxicity of an engineered nanoparticle (fullerene, C 60 ) in two aquatic species, daph nia and fathead minnow [J]. Marine Environmental Re search, 2006, 62(4): S 5 S 9 [20] Oberdörster E. Manufactured nanomaterials ( fullerenes, C 60 ) induce oxidative stress in the brain of juvenile large mouth bass [J]. Environmental Health Perspectives, 2004, 112(10): [21] 朱小山, 朱琳, 郎宇鹏, 等. 人工纳米材料富勒烯 (C 60 ) 低剂量长期暴露对鲫鱼的氧化伤害 [J]. 环境科学, 2008, 29(4): Zhu X S, Zhu L, Lang Y P, et al. Oxidative damages of long term exposure to low level fullerenes (C 60 ) in Caras sius auratus [J]. Environmental Science, 2008, 29(4): (in Chinese) [22] Sayes C M, Gobin A M, Ausman K D, et al. Nano C 60 cytotoxicity is due to lipid peroxidation [J]. Biomaterials, 2005, 26(36): [23] Rahman M F, Wang J, Patterson T A. Expression of genes related to oxidative stress in the mouse brain after expo sure to silver 25 nanoparticles [ J ]. Toxicology Letters, 2009, 187(1): [24] Long T C, Veronesi B. Nanosize titanium dioxide stimu lates reactive oxygen species in brain microglia and dama ges neurons in vitro [J]. Environmental Health Perspec tives, 2007, 115(11): [25] 魏华, 吴垠. 鱼类生理学 ( 第 2 版 )[M]. 北京 : 中国农业出版社, 2011: [26] Griffitt R. Exposure to copper nanoparticles causes gill in jury and acute lethality in Zebrafish (Danio rerio) [J]. En vironmental Science & Technology, 2007, 41(23): [27] Hou W C, Westerhoff P, Posner J D. Biological accumu lation of engineered nanomaterials: A review of current knowledge [J]. Environmental Science: Processes & Im pacts, 2012, 1(1): [28] Hillyer J, Albrecht R. Gastrointestinal persorption and tis sue distribution of differently sized colloidal gold nanop articles [J]. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2001, 90 (12): [29] Ramsden C S, Smith T J, Shaw B J, et al. Dietary expo sure to titanium dioxide nanoparticles in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss): No effect on growth, but subtle biochemical disturbances in the brain [J]. Ecotoxicology, 2009, 18(7): [30] Bertinato J, Mr L'Abbe '. Maintaining copper homeostasis: Regulation of copper trafficking proteins in response to copper deficiency or overload [J]. The Journal of Nutri

10 190 生态毒理学报第 10 卷 tional Biochemistry, 2004, 15(6): [31] Chen Z, Meng H, Xing G, et al. Acute toxicological effects of copper nanoparticles in vivo [J]. Toxicology Letter, 2006, 163(2): [32] 谭树华, 袁志栋, 刘雨芳, 等. 镉对克氏原螯虾肝胰腺抗氧化系统的影响 [J]. 应用生态学报, 2012, 23 (9): Tan S H, Yuan Z D, Liu Y F, et al. Effects of Cd 2 on an tioxidant system in hepatopancreas of Procambarus clarkia [J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2012, 23 (9): (in Chinese) [33] Yamago S, Tokuyama H, Nakamura E, et al. In vivo bio logical behavior of a water miscible fullerene: 14 C labe ling, absorption, distribution, excretion and acute toxicity [J]. Chemistry & Biology, 1995, 2(6): [34] 郑永华, 蒲富永. 汞对鲤鲫鱼组织转氨酶活性的影响 [J]. 西南农业大学学报, 1997, 19(1): Zheng Y H, Pu F Y. Effect of mercury on transaminase activities of tissues in carpio & cauratus [J]. Journal of Southwest Agricultural University, 1997, 19(1): (in Chinese) [35] 惠天朝, 施明华, 朱荫湄. 硒对罗非鱼慢性镉中毒肝抗氧化酶及转氨酶的影响 [J]. 中国兽医学报, 2000, 20(3): Hui T C, Shi M H, Zhu Y M. Effects of selenium on an tioxidant enzymes and transaminases of liver in cadmium chronic toxic Tilapia nilotica [J]. Chinese Journal of Vet erinary Science, 2000, 20(3): (in Chinese) [36] Cha K, Hong H, Choi Y, et al. Comparison of acute re sponses of mice livers to short term exposure to nano sized or micro sized liver particles [J]. Biotechnology Let ter, 2008, 30(11): [37] Amutha C, Subramanian P. Tissues damaging effect of zinc oxide nanoparticles on Oreochromis mossambicus [J]. Biochemical and Cellular Archives, 2009, 9(2):

Microsoft Word - 32 李文静.doc

Microsoft Word - 32 李文静.doc 44 3 Vol.44, No.3 2013 5 OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA May, 2013 汞胁迫对拟穴青蟹 (Scylla paramamosain) * 主要消化和免疫因子的影响 1, 2 1, 2 1 1, 2 1 1 (1. 361021; 2. 361021), (Scylla paramamosain), 0.00