Transcription

1 植物保护学报 Journal of Plant Protection DOI /j.cnki.zwbhxb 烟草青枯病菌与其拮抗菌解淀粉芽胞杆菌的 代谢表型差异分析 汪汉成 1* 黄艳飞 2 龙明锦 1 商胜华 1 史彩华 2* 1. 贵州省烟草科学研究院 贵阳 长江大学农学院 湖北 荆州 摘要 为探究解淀粉芽胞杆菌 X60 作为烟草青枯病生防菌剂的潜力 采用 Biolog 代谢表型技术比 较了 2 种细菌的不同代谢表型 结果表明 烟草青枯病菌和解淀粉芽胞杆菌分别能代谢 19% 41% 的碳源 43% 77%的氮源 95% 86%的磷源以及 100% 69%的硫源 分别有 种生物合成途径 种渗透压表型以及 种 ph 代谢表型 解淀粉芽胞杆菌比烟草青枯病菌代谢显著的碳 源有 L果胶糖 D甘露糖等 34 种 氮源有腺苷 胞苷等 29 种 烟草青枯病菌比解淀粉芽胞杆菌代 谢显著的碳源有 D糖二酸 半乳糖醇等 9 种 氮源有缩二脲 葡萄糖苷酸等 11 种 解淀粉芽胞杆菌 的渗透压和 ph 环境适应力比烟草青枯病菌强 解淀粉芽胞杆菌具有脱羧酶和脱胺酶的活性 研 究表明 2 种细菌的代谢表型间存在较大差异 解淀粉芽胞杆菌的碳源 氮源 渗透压及 ph 代谢表 型较烟草青枯病菌的丰富 烟草青枯病菌的磷源 硫源和生物合成途径代谢表型较解淀粉芽胞杆 菌的丰富 关键词 解淀粉芽胞杆菌 烟草青枯病菌 代谢表型 Analysis of the difference in metabolic phenotypes between Ralstonia solanacearum from tobacco and its antagonistic bacterium Bacillus amyloliquefaciens Wang Hancheng1* Huang Yanfei2 Long Mingjin1 Shang Shenghua1 Shi Caihua2* 1. Guizhou Academy of Tobacco Science, Guiyang , Guizhou Province, China; 2. College of Agriculture Yangtze University, Jingzhou , Hubei Province, China Abstract: In order to assess the potential ability of Bacillus amyloliquefaciens X60 aganist tobacco bacterial wilt, different metabolic phenotypes of the two bacteria were analyzed by using Biolog technology. The results showed that R. solanacearum and B. amyloliquefaciens could metabolize 19% and 41% of the carbon substrates, 43% and 77% of the nitrogen substrates, 95% and 86% of the phosphorus substrates, 100% and 69% of the sulfur substrates, respectively, and exhibited 94 and 91 different biosynthetic pathways; they could metabolize 49 and 95 different osmolytes in 19 and 94 different ph environments, respectively. Bacillus amyloliquefaciens showed much stronger metabolic ability in 34 carbon substrates than R. solanacearum, including Larabinose, Dxylose and so on; and in 29 different nitrogen substrates, including adenosine, cytidine and so on. In comparison, R. solanacearum showed much stronger metabolic ability in nine carbon substrates than B. amyloliquefaciens, including Dsaccharic acid, galactitol and so on; and in 11 different nitrogen substrates, including biuret, glucuronamide and so on. Bacillus amyloliquefaciens showed strong metabolic ability in osmolytes and ph environment than R. solanacearum. Bacillus amyloliquefaciens had both decarboxylase and deaminase activities. The re 基金项目 国家自然科学基金 中国烟草总公司贵州省公司科技项目 * 通讯作者 Authors for correspondence xiaobaiyang126@hotmail.com shicaihua1980@126.com 收稿日期

2 754 植物保护学报 44 卷 sults indicated that there were many differences in metabolic phenomics of two bacteria, phenotypic characters of B. amyloliquefaciens in carbon substrates, nitrogen substrates, osmolytes and ph environments were more abundant than that of R. solanacearum, while phenotypic characters of R. solanacearum in phosphorus substrates, sulfur substrates and biosynthetic pathways were more abundant than that of B. amyloliquefaciens. Key words: Bacillus amyloliquefaciens; Ralstonia solanacearum; metabolic phenotype 由茄科雷尔氏菌 Ralstonia solanacearum 引起的烟草青枯病极具破坏性 (Robertson et al.,2004;qian et al.,2013;xue et al.,2013), 它可侵染烟草根 茎 叶等多个组织 (Hayward,1991), 常对烟草造成毁灭性的危害 近年来, 烟草青枯病的危害范围逐步扩大, 而且长期连作进一步加重了该病害的危害, 使烟叶质量下降, 导致烟叶减产甚至绝收 生物防治是控制土传病害的一种重要方法 (Trigalet et al.,1998;han et al.,2005) 解淀粉芽胞杆菌 Bacillus amyloliquefaciens 是青枯病的一种重要生防资源 (Choudhary & Johri,2009;Tan et al., 2013a), 在室内表现出较好的效果, 而田间防治效果却不稳定 田间防治效果通常是生防菌 病原菌 植株和环境等多方面生态互作的结果 (Yang et al.,2012;tan et al.,2013b), 了解解淀粉芽胞杆菌与烟草青枯病菌在营养元素上的代谢差异和不同环境下的适应能力, 有助于解淀粉芽胞杆菌对烟草青枯病的防治 Biolog 细胞表型芯片技术是美国 Bochner 在 2000 年发明的一种用于测定细胞表型的技术 (Bochner et al.,2001;bochner,2003;2009), 可测定微生物近 种代谢表型 如 Li & Lu(2007) 通过对绿脓假单胞杆菌 Pseudomonas aeruginosa 的代谢表型分析获得了该细菌的碳源和氮源代谢信息 ;Wang et al.(2015b) 通过对链格孢 Alternria alternata 的代谢分析获得了烟草赤星病菌的 ph 和渗透压环境适应能力 ; 同时, 代谢表型分析还可用于包括蜡样芽胞杆菌 Bacillus cereus 在内的多种微生物基因功能研究 (Mols et al.,2007) 目前, 关于有益微生物与病原菌的代谢表型差异分析尚未有研究报道 本研究以烟草青枯病菌及前期获得其拮抗菌解淀粉芽胞杆菌为对象, 采用 Biolog 细胞代谢表型技术对 2 种细菌的代谢表型进行差异分析, 以期为解淀粉芽胞杆菌生防菌剂的开发提供理论基础, 为解淀粉芽胞杆菌有效防治烟草青枯病提供科学依据 1 材料与方法 1.1 材料供试菌株 : 本试验所选用的烟草青枯病菌菌株 R6 及其拮抗菌解淀粉芽胞杆菌菌株 X60(CC TCC M ), 均由贵州省烟草科学研究院微生物实验室提供 供试培养基 : 牛肉膏蛋白胨 (nutrient agar,na) 固体培养基 : 牛肉膏 5 g 蛋白胨 10 g NaCl 5 g 琼脂粉 16 g 水 ml, 不加琼脂配制牛肉膏蛋白胨液体培养基 (Bonjar et al.,2006;oku et al.,2011), 以上 2 种培养基均用于细菌的培养 ;(BUGB) 培养基 (#71102), 美国 Biolog 公司, 用于 2 种细菌的代谢表型分析 试剂及仪器 :PM1~PM10 代谢板 ( 货号 :#12111 #12112 #12121 #12131 #12141 #12181 #12182 # #12161 #12162), 无菌加样槽 (#3002),IF0a GN/GP(#72268) 和 IF10b GN/GP(#72266) 接种液, Mix F(#74226) Mix G(#74227) 和 Mix H(#74228) 染料, 美国 Biolog 公司 ; 琥珀酸钠 (#S2378) 柠檬酸铁 (#F6129), 美国 Sigma 公司 OmniLog PM 系统 (#91171) 浊度测定仪 (#3531) 8 通道电动移液器 (#3501A), 美国 Biolog 公司 1.2 方法参照 Biolog 革兰氏阴性 阳性细菌的代谢表型分析的标准程序 (Bochner,2003), 进行烟草青枯病菌与解淀粉芽胞杆菌的表型分析 将这 2 种供试细菌分别在 (BUGB) 平板上活化, 配制 PM1~PM10 的接种液和 2 种细菌的新鲜细胞悬浮液, 将烟草青枯病菌和解淀粉芽胞杆菌悬浮液的浓度分别调为 85%T 和 81%T(T 为 Biolog 标准浓度单位 ) 烟草青枯病菌的碳源代谢表型测定 : 吸取烟草青枯病菌细胞悬浮液 ml 至无菌加样槽中, 混合均匀, 用 8 通道电动移液器将细胞悬浮液添加至 PM1 和 PM2 代谢板中, 每孔 100 µl 氮源 硫源 磷源及生物合成途径的表型测定 : 吸取 2 mol/l 琥珀酸钠与 200 μmol/l 柠檬酸铁的混合溶液 680 µl,

3 5期 汪汉成等 烟草青枯病菌与其拮抗菌解淀粉芽胞杆菌的代谢表型差异分析 将混合溶液与烟草青枯病菌细胞悬浮液混合均匀 用 8 通道电动移液器将混合后的细胞悬浮液加入 PM3 PM4 PM5 PM6 PM7 和 PM8 代谢板中 渗 透压和 ph 代谢表型测定 将 600 µl 的烟草青枯病 菌细胞悬浮液添加至 ml 的 PM9 和 PM10 接 种液中 混合均匀 用 8 通道电动移液器将细胞悬浮 液加入代谢板中 将准备好的代谢板置于恒温培养 箱中 33 培养 48 h 设置 OmniLog 工作软件 收集 数据 根据细菌代谢的动力学曲线分析其细胞代谢 表型 解淀粉芽胞杆菌的碳代谢表型测定 将解淀粉 芽胞杆菌细胞悬浮液 1.76 ml 添加至 ml 的 PM1 和 PM2 接种液中 混合均匀 用 8 通道电动移 液器将混匀后的细胞悬浮液添加至PM1和PM2代谢 板中 每孔100 µl 氮代谢表型测定 将细胞悬浮液 3.52 ml 添加至 ml 的 PM3 PM6 PM7 和 PM8 接种液中 混合均匀 用 8 通道电动移液器将细胞悬 浮液加入代谢板中 磷和硫代谢表型测定 将细胞悬 浮液0.88 ml添加至11.12 ml的pm4接种液中 混合 均匀 用 8 通道电动移液器将细胞悬浮液加入代谢 板中 生物代谢途径表型测定 将细胞悬浮液0.88 ml 添加至 ml 的 PM5 接种液中 混合均匀 用8通 道电动移液器将细胞悬浮液加入代谢板中 渗透压和 ph 代谢表型测定 将细胞悬浮液 1.76 ml 添加至 ml的pm9和pm10接种液中 混合均匀 用8通 道电动移液器将细胞悬浮液加入代谢板中 755 采用 Biolog D5E_OKA_data.exe 软件收集 2 种 细菌的代谢表型数据 并采用 Biolog OL_FM_1.2.exe 软件进行数据转换 在 Biolog 同块 PM 板中 以烟草 青枯病菌的代谢为对照 标记为绿色 以解淀粉芽胞 杆菌为靶标 标记为红色 采用 Biolog OL_PR_1.2. exe 软件将 2 组数据进行比对分析 选择峰面积 Area 为对比参数 峰面积越大 说明菌株对被检测营养物 质的代谢越强 烟草青枯病菌与解淀粉芽胞杆菌共 同代谢的区域标记为黄色 根据代谢孔颜色面积的 大小来分析 2 种细菌的代谢表型差异 2 结果与分析 2.1 烟草青枯病菌与解淀粉芽胞杆菌的碳代谢差异 通过代谢表型组学分析 共获得烟草青枯病菌 与解淀粉芽胞杆菌各 190 种碳源代谢表型信息 分 别能代谢 19%和 41%的供试碳源 表 1 解淀粉芽 胞杆菌能代谢的碳源数量比烟草青枯病菌多 2 种细菌能共同代谢的碳源有 29 种 主要包括琥珀 酸 D半乳糖 L天冬氨酸 L脯氨酸 D海藻糖 D山梨糖 甘油等 仅能被解淀粉芽胞杆菌代谢的 碳源有 34 种 主要包括 L果胶糖 D甘露糖 磷酸 甘油 D木糖 D核糖 D蜜二糖 D乳糖 尿苷 D纤维二糖 D阿洛酮糖 L来苏糖和凝胶等 仅能被 烟草青枯病菌代谢的碳源有 9 种 主要包括 D糖二 酸 半乳糖醇 吐温 20 吐温 40 吐温 80 粘酸 胶 质 γ氨基丁酸和 L酒石酸 图 1 图 1 解淀粉芽胞杆菌与烟草青枯病菌在 Biolog PM1~PM8 代谢板上的代谢图谱比较 Fig. 1 Metabolic fingerprints of Bacillus amyloliquefaciens and Ralstonia solanacearum generated by using Biolog Phenotype MicroArray PM1PM8 plates A~H PM1~PM8 绿色为解淀粉芽胞杆菌代谢图谱 黄色为解淀粉芽胞杆菌和青枯病菌共同代谢的图谱 红色为烟草青 枯病菌代谢的图谱 横坐标 1~12 和纵坐标 a~h 为 Biolog PM 板的布局 Green indicates metabolic fingerprint of B. amyloliquefaciens yellow indicates common fingerprints of both B. amyloliquefaciens and R. solanacearum red indicates metabolic fingerprint of R. solanacearum. Horizontal axis of 1 to 12 and vertical axis of A to H are the layout of Biolog PM MicroPlate.

4 756 植物保护学报 44 卷 1A05 1A06 1A07 1A08 1A10 1B02 1B03 1B05 1B06 1B09 1B11 1C03 1C07 1C09 1D01 1D11 1E01 1F02 1F05 1F06 1G05 1G09 1G10 1G12 1H08 1H10 2F06 2G06 2H03 表 1 烟草青枯病菌与解淀粉芽胞杆菌在 Biolog PM1 和 PM2 板中的碳源代谢情况 Table 1 Carbon substrates in Biolog PM1 and PM2 microplates metabolized by Ralstonia solanacearum 2 种细菌均代谢 Metabolized by both bacteria 琥珀酸 Succinic acid D 半乳糖 Dgalactose L 天冬氨酸 Laspartic acid L 脯氨酸 Lproline D 海藻糖 Dtrehalose D 山梨糖 Dsorbitol 甘油 Glycerol D 葡萄糖醛酸 Dglucuronic acid D 葡萄糖酸 Dgluconic acid 乳酸 D,Llactic acid D 甘露醇 Dmannitol 苹果酸 D,Lmalic acid D 果糖 Dfructose D 葡萄糖 αdglucose L 天冬酰胺酸 Lasparagine 蔗糖 Sucrose L 谷氨酰胺 Lglutamine 柠檬酸 Citric acid 富马酸 Fumaric acid 溴丁二酸 Bromosuccinic acid L 丙氨酸 Lalanine 丁二酸单甲酯 Monomethyl succinate 丙酮酸甲酯 Methyl pyruvate L 苹果酸 Lmalic acid 丙酮酸 Pyruvic acid D 半乳糖醛酸 Dgalacturonic acid 奎尼酸 Quinic acid L 组氨酸 Lhistidine 羟基苯乙酸 mhydroxy phenyl acetic acid and/or Bacillus amyloliquefaciens 仅解淀粉芽胞杆菌代谢 Metabolized by B. amyloliquefaciens only 1A02 1A11 1B07 1B08 1C04 1C11 1D09 1D12 1E04 1E08 1F01 1F11 1G06 1H05 1H06 2A07 2B04 2B05 2B08 2B09 2C01 2C03 2C05 2C12 2D01 2D05 2D06 2D07 2E05 2E12 2G04 2H01 2H09 2H11 L 果胶糖 Larabinose D 甘露糖 Dmannose 磷酸甘油 D,Lαglycerol phosphate D 木糖 Dxylose D 核糖 Dribose D 蜜二糖 Dmelibiose D 乳糖 αdlactose 尿苷 Uridine D 果糖 6 磷酸 Dfructose6phosphate 多碳糖 βmethyldglucoside 甘氨酰 天冬氨酸 GlyAsp D 纤维二糖 Dcellobiose 丙氨酸 甘氨酸 AlaGly D 阿洛酮糖 Dpsicose L 来苏糖 Llyxose 凝胶 Gelatin 苦杏苷 Amygdalin D 阿拉伯糖 Darabinose 熊果苷 Arbutin 2 脱氧 D 核糖 2deoxyDribose 龙胆二糖 Gentiobiose D 乳糖醇 Dlactitol 麦芽糖醇 Maltitol 帕拉金糖 Palatinose D 蜜三糖 Draffinose 水苏糖 Stachyose D 塔格糖 Dtagatose 松二糖 Turanose D 葡萄糖胺 Dglucosamine 5 酮基 D 葡萄糖酸 5ketoDgluconic acid L 精氨酸 Larginine L 鸟氨酸 Lornithine 二羟基丙酮 Dihydroxyacetone 丁酮 2,3butanone 仅烟草青枯病菌代谢 Metabolized by R. solanacearum only 1A04 1A12 1C05 1D05 1E05 1F08 2A12 2D10 2F12 D 糖二酸 Dsaccharic acid 半乳糖醇 Dulcitol 吐温 20 Tween 20 吐温 40 Tween 40 吐温 80 Tween 80 粘酸 Mucic acid 胶质 Pectin γ 氨基丁酸 γaminonbutyric acid L 酒石酸 Ltartaric acid

5 5 期汪汉成等 : 烟草青枯病菌与其拮抗菌解淀粉芽胞杆菌的代谢表型差异分析 烟草青枯病菌与解淀粉芽胞杆菌的氮代谢差异本试验共获得烟草青枯病菌与解淀粉芽胞杆菌各 380 种氮源代谢表型信息, 分别能代谢 43% 和 77% 的氮源, 解淀粉芽胞杆菌代谢的氮源数量较烟草青枯病菌多 2 种细菌能共同代谢的氮源有 150 多种, 主要包括氨 亚硝酸盐 硝酸盐 尿素 氨基酸 类 肽类等 ; 只能被解淀粉芽胞杆菌能代谢的氮源有 29 种, 主要包括腺苷 胞苷和部分肽类 ; 烟草青枯病菌能的氮源有 11 种, 主要包括缩二脲 葡萄糖苷酸 鸟苷 肌苷和部分肽类 此外, 烟草青枯病菌在无氮源的情况下能正常代谢, 而解淀粉芽胞杆菌不能 ( 表 2) 表 2 烟草青枯病菌与解淀粉芽胞杆菌在 Biolog PM3 PM6~PM8 板中的氮源代谢情况 Table 2 Nitrogen substrates in Biolog PM 3, PM6, PM7 and PM 8 microplates metabolized by Ralstonia solanacearum or Bacillus amyloliquefaciens 3F03 3F04 3G07 3G11 3G12 6B06 6 B07 6E11 6F10 6G07 6H09 6H10 7A07 7A08 7A09 仅解淀粉芽胞杆菌代谢 Metabolized by B. amyloliquefaciens only 腺苷 Adenosine 7A10 赖氨酸 亮氨酸 LysLeu 胞苷 Cytidine 7B07 甲硫氨酸 精氨酸 MetArg D,Lα 氨基 N 丁酸 7B08 甲硫氨酸 天冬氨酸 MetAsp D,LαaminoNbutyric acid δ 氨基 N 戊酸 7C01 甲硫氨酸 异亮氨酸 MetIie δaminonvaleric acid α 氨基 N 戊酸 7C07 甲硫氨酸 色氨酸 MetTrp αaminonvaleric acid 精氨酸 精氨酸 ArgArg 7D11 脯氨酸 脯氨酸 ProPro 精氨酸 天冬氨酸 ArgAsp 7E07 丝氨酸 脯氨酸 SerPro 甘氨酸 脯氨酸 GlyPro 7F08 色氨酸 天冬氨酸 SerSer 组氨酸 脯氨酸 HisPro 7F09 色氨酸 谷氨酸 SerTyr 异亮氨酸 组氨酸 IieHis 7H05 缬氨酸 天冬氨酸 ValAsp 亮氨酸 异亮氨酸 LeuIie 7H12 γ 谷氨酸 甘氨酸 γglugly 亮氨酸 亮氨酸 LeuLeu 8D08 丝氨酸 谷胺酰胺 SerGln 赖氨酸 精氨酸 LysArg 8E08 缬氨酸 谷氨酸 ValGlu 赖氨酸 谷氨酸 LysGlu 8G02 D 谷氨酸 甘氨酸 DAlaGlyGly 赖氨酸 异亮氨酸 LysIie 仅青枯病菌代谢 Metabolized by R. solanacearum only 3A01 阴性对照 Negative control 3A06 缩二脲 Biuret 3E06 葡萄糖苷酸 Glucuronamide 3F07 鸟苷 Guanosine 3F12 肌苷 Inosine 6C09 天冬氨酸 天冬氨酸 AspAsp 6C10 天冬氨酸 谷氨酸 AspGlu 6D08 谷氨酸 谷氨酸 GluGlu 6E04 甘氨酸 半胱氨酸 GlyCys 7A01 阴性对照 Negative control 7B02 赖氨酸 丝氨酸 LysSer 7D02 苯丙氨酸 丝氨酸 PheSer 7H02 酪氨酸 酪氨酸 TyrTyr 8A01 阴性对照 Negative control 2.3 两种菌的磷 硫及生物合成途径代谢差异本试验共获得烟草青枯病菌与解淀粉芽胞杆菌各 59 种磷源 35 种硫源及 94 种生物合成途径代谢表型 ( 图 1), 结果表明, 分别能代谢 95% 86% 的供试磷源和 100% 69% 的供试硫源, 分别具有 94 种和 91 种生物合成途径 解淀粉芽胞杆菌与烟草青枯病菌均能代谢所测定的 59 种磷源, 但解淀粉芽胞杆菌对半胱胺 S 磷酸盐 (PM4 D04) 的代谢速率高于烟草青枯病菌 ; 解淀粉芽胞杆菌与烟草青枯病菌均能代谢所测定的 35 种硫源, 但解淀粉芽胞杆菌对异戊酸脱氢酶 (PM4 H04) 的代谢速率高于烟草青枯病菌 ;2 种细菌均表现出类似的代谢途径, 但烟草青枯病菌对所测试底物的代谢速率较解淀粉芽胞杆菌高 2.4 烟草青枯菌与解淀粉芽胞杆菌渗透压代谢差异烟草青枯病菌与解淀粉芽胞杆菌分别具有 49 种和 95 种渗透压表型 差异分析表明, 解淀粉芽胞杆菌的渗透压适应能力较烟草青枯病菌强 解淀粉芽胞杆菌能高效代谢 95 种, 唯一不能代谢的为 200 mmol/l 的苯甲酸钠 (ph 5.2); 烟草青枯病菌能代谢 49 种, 其高效代谢的物质包括 :1%~5% 的氯化钠 5%~20% 的乙二醇 2%~4% 的尿素 1%~6% 的乳酸钠 20~200 mmol/l 的磷酸钠 (ph 7) 10~100 mmol/l 的硫酸铵 (ph 8) 10~100 mmol/l 的硝酸钠 10~ 80 mmol/l 的亚硝酸钠 ; 其不能代谢的物质主要包括 :5.5%~10% 的氯化钠 3%~6% 的甲酸钠 5%~7% 的尿素 7%~12% 的乳酸钠 50~200 mmol/l 的苯甲酸钠 (ph 5.2)( 表 3)

6 758 植物保护学报 44 卷 表 3 烟草青枯病菌与解淀粉芽胞杆菌在 Biolog PM9 板中的代谢情况 Table 3 Metabolic profiling of Ralstonia solanacearum and Bacillus amyloliquefaciens on Biolog PM9 plate R B R B A1 1% 氯化钠 1% NaCl E5 5% 甲酸钠 5% sodium formate A2 2% 氯化钠 2% NaCl E6 6% 甲酸钠 6% sodium formate A3 3% 氯化钠 3% NaCl E7 2% 尿素 2% urea A4 4% 氯化钠 4% NaCl E8 3% 尿素 3% urea A5 5% 氯化钠 5% NaCl E9 4% 尿素 4% urea A6 5.5% 氯化钠 5.5% NaCl E10 5% 尿素 5% urea A7 6% 氯化钠 6% NaCl E11 6% 尿素 6% urea A8 6.5% 氯化钠 6.5% NaCl E12 7% 尿素 7% urea A9 7% 氯化钠 7% NaCl F1 1% 乳酸钠 1% sodium lactate A10 8% 氯化钠 8% NaCl F2 2% 乳酸钠 2% sodium lactate A11 9% 氯化钠 9% NaCl F3 3% 乳酸钠 3% sodium lactate A12 B1 B2 B3 10% 氯化钠 10% NaCl 6% 氯化钠 6% NaCl 6% 氯化钠 甜菜碱 6% NaClbetaine 6% 氯化钠 NN 二甲基甘氨酸 F4 F5 F6 F7 4% 乳酸钠 4% sodium lactate 5% 乳酸钠 5% sodium lactate 6% 乳酸钠 6% sodium lactate 7% 乳酸钠 7% sodium lactate 6% NaClNN dimethyl glycine F8 8% 乳酸钠 8% sodium lactate B4 B5 6% 氯化钠 肌氨酸 6% NaClsarcosine 6% 氯化钠 二甲基磺酰基丙酸盐 F9 F10 9% 乳酸钠 9% sodium lactate 10% 乳酸钠 10% sodium lactate 6% NaCldimethyl sulphonyl propionate F11 11% 乳酸钠 11% sodium lactate B6 B7 B8 B9 B10 6% 氯化钠 丙磺酸 6% NaClMOPS 6% 氯化钠 四氢嘧啶 6% NaClectoine 6% 氯化钠 胆碱 6% NaClcholine 6% 氯化钠 磷酸胆碱 6% NaClphosphoryl choline 6% 氯化钠 肌酸 6% NaClcreatine F12 G1 G2 12% 乳酸钠 12% sodium lactate ph 7,20 mmol/l 磷酸钠 ph 7,20 mmol/l sodium phosphate ph 7,50 mmol/l 磷酸钠 ph 7,50 mmol/l sodium phosphate B11 6% 氯化钠 肌酐 6% NaClcreatinine G3 ph 7,100 mmol/l 磷酸钠 B12 C1 C2 C3 6% 氯化钠 左旋肉碱 6% NaClLcarnitine 6% 氯化钠 氯化钾 6% NaClKCl 6% 氯化钠 L 脯氨酸 6% NaClLproline 6% 氯化钠 N 乙酰基 L 谷酰胺 G4 G5 ph 7,100 mmol/l sodium phosphate ph 7,200 mmol/l 磷酸钠 ph 7,200 mmol/l sodium phosphate ph 5.2,20 mmol/l 苯甲酸钠 6% NaClNacethylLglutamine ph 5.2,20 mmol/l sodiumbenzoate C4 6% 氯化钠 β 谷氨酸 6% NaClβglutamic acid G6 ph 5.2,50 mmol/l 苯甲酸钠 C5 6% 氯化钠 γ 氨基 N 丁酸 ph 5.2,50 mmol/l sodium benzoate 6% NaClγaminoNbutyric acid G7 ph 5.2,100 mmol/l 苯甲酸钠 C6 6% 氯化钠 谷光氨肽 6% NaClglutathione ph 5.2,100 mmol/l sodium benzoate C7 6% 氯化钠 甘油 6% NaClglycerol G8 ph 5.2,200 mmol/l 苯甲酸钠 C8 6% 氯化钠 海藻糖 6% NaCltrehalose ph 5.2,200 mmol/l sodium benzoate C9 6% 氯化钠 三甲胺 N 甲氧氮芥 G9 ph 8,10 mmol/l 硫酸铵 6% NaCltrimethylamineNoxide ph 8,10 mmol/l ammonium sulfate C10 6% 氯化钠 三甲胺 6% NaCltrimethylamine G10 ph 8,20 mmol/l 硫酸铵 C11 6% 氯化钠 章鱼碱 6% NaCloctopine ph 8,20 mmol/l ammonium sulfate C12 6% 氯化钠 葫芦巴碱 6% NaCltrigonelline G11 ph 8,50 mmol/l 硫酸铵 D1 3% 氯化钾 3% potassium chloride ph 8,50 mmol/l ammonium sulfate D2 4% 氯化钾 4% potassium chloride G12 ph 8,100 mmol/l 硫酸铵 D3 5% 氯化钾 5% potassium chloride ph 8,100 mmol/l ammonium sulfate

7 5 期汪汉成等 : 烟草青枯病菌与其拮抗菌解淀粉芽孢杆菌的代谢表型差异分析 759 续表 3 Continued R B R B D4 6% 氯化钾 6% potassium chloride H1 10 mmol/l 硝酸钠 10 mmol/l sodium nitrate D5 2% 硫酸钠 2% sodium sulfate H2 20 mmol/l 硝酸钠 20 mmol/l sodium nitrate D6 3% 硫酸钠 3% sodium sulfate H3 40 mmol/l 硝酸钠 40 mmol/l sodium nitrate D7 4% 硫酸钠 4% sodium sulfate H4 60 mmol/l 硝酸钠 60 mmol/l sodium nitrate D8 5% 硫酸钠 5% sodium sulfate H5 80 mmol/l 硝酸钠 80 mmol/l sodium nitrate D9 5% 乙二醇 5% ethylene glycol H6 100 mmol/l 硝酸钠 100 mmol/l sodium nitrate D10 10% 乙二醇 10% ethylene glycol H7 10 mmol/l 亚硝酸钠 10 mmol/l sodium nitrite D11 15% 乙二醇 15% ethylene glycol H8 20 mmol/l 亚硝酸钠 20 mmol/l sodium nitrite D12 20% 乙二醇 20% ethylene glycol H9 40 mmol/l 亚硝酸钠 40 mmol/l sodium nitrite E1 1% 甲酸钠 1% sodium formate H10 60 mmol/l 亚硝酸钠 60 mmol/l sodium nitrite E2 2% 甲酸钠 2% sodium formate H11 80 mmol/l 亚硝酸钠 80 mmol/l sodium nitrite E3 3% 甲酸钠 3% sodium formate H mmol/l 亚硝酸钠 100 mmol/l sodium nitrite E4 4% 甲酸钠 4% sodium formate 与 分别表示 Biolog PM9 板中的物质能够被烟草青枯病菌和解淀粉芽胞杆菌代谢与不能代谢 ;R 与 B 分别代表烟草青 枯病菌与解淀粉芽胞杆菌 and indicate that the substrate is metabolized or not metabolized by the tested bacteria Ralstonia solanacearum and Bacillus amyloliquefaciens examined using the Biolog PM9 plate,respectively. R and B were short for R. solanacearum and B. amyloliquefaciens,respectively. 2.5 烟草青枯病菌与解淀粉芽胞杆菌 ph 代谢差异烟草青枯病菌与解淀粉芽胞杆菌分别具有 19 种和 94 种 ph 代谢表型 分析结果表明, 解淀粉芽胞杆菌能代谢的有 94 种, 其中高效代谢的有 80 多种, 不能代谢的为 ph 3.5 及 ph 4.5 条件下的邻氨基苯甲酸 烟草青枯病菌能代谢的有 19 种, 其代谢的 ph 范围为 5.0~8.0; 在 ph 4.5 时, 烟草青枯病菌能代谢 2 种氨基酸 ; 在 ph 9.5 时, 该病原菌均不能生长 解淀粉芽胞杆菌具有脱胺酶和脱羧酶活性 此外, 2 种细菌均能代谢辛酸盐 葡萄糖苷 半乳糖苷 葡糖苷酸 氨基葡糖苷 氨基半乳糖苷 甘露糖苷 磷酸盐和硫酸盐 ( 表 4) 3 讨论 传统的微生物代谢测定需要配制不同试剂, 工作量大, 耗时长, 测定结果还易出现误差 (Zhu et al.,2009;yin et al.,2010) 本研究借助 Biolog 高通量代谢表型技术, 对烟草青枯病菌与其拮抗细菌解淀粉芽胞杆菌的代谢表型进行了比较分析, 该技术具有通量高 速度快 准确性高 能动态反应微生物细胞代谢的生化过程等优点, 在国外已被广泛应用于微生物的研究 (Mols et al.,2007; Oh et al.,2007;rico & Preston,2008) 由于表型测定仪进入国内较晚, 加上试剂耗材较贵, 目前还 未在国内广泛应用 茄科雷尔氏菌是全球性的土传病原细菌, 它虽不是土壤优势微生物种群, 但当寄主 根系分泌物 温湿度等条件适宜时, 其种群就会迅速增加, 进而引起植物病害 (Wei et al.,2011;wang et al.,2015a) 已报道的烟草根系分泌物有对羟基苯甲酸 香草酸 丁香酸 肉桂酸等 (Wu et al.,2015) Biolog 代谢板的底物中含有多种植物根系分泌物, 本研究获得了烟草青枯病菌对这些根系分泌物的代谢表型信息, 有助于了解该病原菌在土壤和烟草上的定植能力, 而根系分泌物与烟草青枯病菌致病力的关系有待深入了解 此外, 本试验发现烟草青枯病菌能够高效代谢多种硝酸盐 亚硝酸盐及尿素等高等植物的氮素营养, 并且在无氮环境下仍能正常生长 Wang et al. (2015c) 研究发现烤烟复合肥等能促进烟草青枯病菌的代谢, 本试验所选用的含氮化合物与其虽然不同, 但二者研究结果类似, 均体现了氮素营养化合物能促进烟草青枯病菌的代谢 为此, 烟田氮肥的不合理施用可能会加重青枯病的危害 本研究中烟草青枯病菌的渗透压和 ph 环境适范围虽然较解淀粉芽胞杆菌小, 但其适应力仍然比较强, 能否利用烟草青枯病菌不能代谢的环境因素来防治烟草青枯病值得下一步深入研究

8 760 植物保护学报 44 卷 表 4 烟草青枯病菌与解淀粉芽孢杆菌在 Biolog PM10 板中的代谢情况 Table 4 Metabolic profiling of Ralstonia solanacearum and Bacillus amyloliquefaciens on Biolog PM10 plate A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 ph 3.5 ph 4 ph 4.5 ph 5 ph 5.5 ph 6 ph 7 ph 8 ph 8.5 ph 9 ph 9.5 ph 10 ph 4.5 ph 4.5,L 丙氨酸 ph 4.5,Lalanine ph 4.5,L 精氨酸 ph 4.5,Larginine ph 4.5,L 天门冬酰胺 ph 4.5,Lasparagine ph 4.5,L 天冬氨酸 ph 4.5,Laspartic acid ph 4.5,L 谷氨酸 ph 4.5,Lglutamic acid ph 4.5,L 谷酰胺 ph 4.5,Lglutamine ph 4.5, 甘氨酸 ph 4.5,glycine ph 4.5,L 组氨酸 ph 4.5,Lhistidine ph 4.5,L 异亮氨酸 ph 4.5,Lisoleucine ph 4.5,L 亮氨酸 ph 4.5,LLeucine ph 4.5,L 赖氨酸 ph 4.5,LLysine ph 4.5,L 蛋氨酸 ph 4.5,Lmethionine ph 4.5,L 苯基丙氨酸 ph 4.5,Lphenylalanine ph 4.5,L 脯氨酸 ph 4.5,Lproline ph 4.5,L 丝氨酸 ph 4.5,Lserine ph 4.5,L 苏氨酸 ph 4.5,Lthreonine ph 4.5,L 色氨酸 ph 4.5,Ltryptophan ph 4.5,L 酪氨酸 ph 4.5,Ltyrosine ph 4.5,L 缬氨酸 ph 4.5,Lvaline ph 4.5, 羟基脯氨酸 ph 4.5,hydroxyLproline ph 4.5,L 鸟氨酸 ph 4.5,Lornithine ph 4.5,L 高精氨酸 ph 4.5,Lhomoarginine ph 4.5,L 高丝氨酸 ph 4.5,Lhomoserine ph 4.5, 邻氨基苯甲酸 ph 4.5,anthranilica acid ph 4.5,L 正亮氨酸 ph 4.5,Lnorleucine ph 4.5,L 正缬氨酸 ph 4.5,Lnorvaline ph 4.5,α 氨基 N 丁酸 ph 4.5,αaminoNbutyric ph 4.5,p 氨基苯甲酸 ph 4.5,paminobenzoate ph 4.5,L 磺基丙氨酸 ph 4.5,Lcysteic acid ph 4.5,D 赖氨酸 ph 4.5,Dlysine ph 4.5,5 羟赖氨酸 ph 4.5,5hydroxy lysine ph 4.5,5 羟色胺 ph 4.5,5hydroxy tryptophan ph 4.5,D,L 二氨基 庚氨酸 R B E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12 G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11 G12 H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 ph 9.5 ph 9.5,L 丙氨酸 ph 9.5,Lphenylalanine ph 9.5,L 精氨酸 ph 9.5,Larginine ph 9.5,L 天门冬酰胺 ph 9.5,Lasparagine ph 9.5,L 天冬氨酸 ph 9.5,Laspartic acid ph 9.5,L 谷氨酸 ph 9.5,Lglutamic acid ph 9.5,L 谷酰胺 ph 9.5,Lglutamine ph 9.5, 甘氨酸 ph 9.5,glycine ph 9.5,L 组氨酸 ph 9.5,Lhistidine ph 9.5,L 异亮氨酸 ph 9.5,Lisoleucine ph 9.5,L 蛋氨酸 ph 9.5,Lleucine ph 9.5,L 赖氨酸 ph 9.5,Llysine ph 9.5,L 蛋氨酸 ph 9.5,Lmethionine ph 9.5,L 苯基丙氨酸 ph 9.5,Lphenylalanine ph 9.5,L 脯氨酸 ph 9.5,Lproline ph 9.5,L 丝氨酸 ph 9.5,Lserine ph 9.5,L 苏氨酸 ph 9.5,Lthreonine ph 9.5,L 色氨酸 ph 9.5,Ltryptophan ph 9.5,L 酪氨酸 ph 9.5Ltyrosine ph 9.5,L 缬氨酸 ph 9.5,Lvaline ph 9.5, 羟基脯氨酸 ph 9.5,hydroxyLproline ph 9.5,L 鸟氨酸 ph 9.5,Lornithine ph 9.5,L 高精氨酸 ph 9.5,Lhomoarginine ph 9.5,L 高丝氨酸 ph 9.5,Lhomoserine ph 9.5, 邻氨基苯甲酸 ph 9.5,anthranilic acid ph 9.5,L 正亮氨酸 ph 9.5,Lnorleucine ph 9.5,L 戊氨酸 ph 9.5,Lnorvaline ph 9.5, 胍基丁胺 ph 9.5,agmatine ph 9.5, 尸胺 ph 9.5,cadaverine ph 9.5, 腐胺 ph 9.5,putrescine ph 9.5, 组胺 ph 9.5,histamine ph 9.5, 苯乙胺 ph 9.5,phenylethylamine ph 9.5, 酪胺 ph 9.5,tyramine ph 9.5, 色胺 ph 9.5,creatine ph 9.5, 三甲胺甲氧氮芥 ph 9.5,trimethyl aminenoxide ph 9.5, 尿素 ph 9.5,urea 辛酯酶 Xcaprylate XαD 葡萄糖苷 XαDglucoside XβD 葡萄糖苷 XβDglucoside XαD 半乳糖苷 XαDgalactoside XβD 半乳糖苷 XβDgalactoside XαD 葡糖苷酸 XαDglucuronide XβD 葡糖苷酸 XβDglucuronide XβD 氨基葡萄糖苷 XβDglucosaminide XβD 氨基半乳糖苷 XβDgalactosaminide R B

9 5 期汪汉成等 : 烟草青枯病菌与其拮抗菌解淀粉芽胞杆菌的代谢表型差异分析 761 续表 4 Continued R B R B ph 4.5,D,Ldiamino pimelic acid H10 XαD 甘露糖苷 XαDmannoside D11 ph 4.5, 三甲胺 N 甲氧氮芥 H11 XPO 4 ph 4.5,trimethyl aminenoxide H12 XSO 4 D12 ph 4.5, 尿素 ph 4.5,urea 与 分别表示 Biolog PM10 板中的物质能够被烟草青枯病害和解淀粉芽胞杆菌代谢与不能代谢 ;R 与 B 分别代表烟草青 枯病菌与解淀粉芽胞杆菌 and mean the substrate was metabolized and not metabolized by the tested bacteria Ralstonia solanacearum and Bacillus amyloliquefaciens examined using the Biolog PM10 plate, respectively. R and B were short for R. solanacearum and B. amyloliquefaciens,respectively. 解淀粉芽胞杆菌是土壤和植物生态系统中的优势微生物种群, 它以芽孢度过不良环境 (Borriss et al.,2011;fan et al.,2011) 本研究中解淀粉芽胞杆菌表现出广泛的碳 氮 磷 硫源代谢能力, 这有助于它在诸多环境中能形成优势种群, 同时其较强的渗透压和 ph 环境适应力有助于它度过诸多不利环境 本试验获得的解淀粉芽胞杆菌代谢表型与同属的蜡样芽胞杆菌 Bacillus cereus 和枯草芽胞杆菌 Bacillus subtilis 的代谢表型类似 (Mols et al.,2007;oh et al.,2007), 进一步增加了对芽胞杆菌属细菌代谢表型组学的认识 此外, 本研究还发现解淀粉芽胞杆菌在无氮的环境中不能代谢, 因此, 在其生防菌剂的开发中必须注意添加氮素营养 本研究获得了解淀粉芽胞杆菌与烟草青枯病菌喜爱的碳 氮 磷 硫源信息及其适应的渗透压和 ph 环境, 同时也获得了 2 种细菌代谢不利的碳 氮 磷 硫源信息与不适应的渗透压和 ph 环境 综合利用对解淀粉芽胞杆菌有利而对烟草青枯病菌不利的营养与环境因素等信息, 进行优化解淀粉芽胞杆菌的培养条件 优化孢子形成或者萌发的条件 发现导致或抑制细胞分化的条件 筛选适合其定植的条件, 以便最大程度地发挥该生防细菌的功能和作用 本试验发现的诸多关于 2 种细菌的代谢表型信息对于解淀粉芽胞杆菌生防菌剂的开发以及将其应用于防治病害提供了科学依据, 同时还需继续进行多项试验以确定各种营养元素的具体参数 参考文献 (References) Bochner BR New technologies to assess genotypephenotype re lationships. Nature Reviews Genetics, 4: Bochner BR Global phenotypic characterization of bacteria. FEMS MicrobiologyReviews,33(1): Bochner BR, Gadzinski P, Panomitros E Phenotype microarrays for high throughput phenotypic testing and assay of gene function. Genome Research, 11(7): Bonjar GHS, Barkhordar B, Pakgohar N, Aghighi S, Biglary S, Farrokhi PR, Aminaii M, Mahdavi MJ, Aghelizadeh A Biological control of Phytophthora drechsleri Tucker, the causal agent of pistachio gummosis, under greenhouse conditions by use of actinomycetes. Plant Pathology Journal, 5(1): 2023 Borriss R, Chen XH, Rueckert C, Blom J, Becker A, Baumgarth B, Fan B, Pukall R, Schumann P, Spröer C, et al Relationship of Bacillus amyloliquefaciens clades associated with strains DSM 7T and FZB42: a proposal for Bacillus amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens subsp. nov. and Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum subsp. nov. based on their discriminating complete genome sequences. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 61(8): Choudhary DK, Johri BN Interactions of Bacillus spp. and plants with special reference to induced systemic resistance (ISR). Microbiological Research, 164(5): Fan B, Chen XH, Budiharjo A, Bleiss W, Vater J, Borriss R Efficient colonization of plant roots by the plant growth promoting bacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42, engineered to express green fluorescent protein. Journal of Biotechnology, 151 (4): Han JG, Sun L, Dong XZ, Cai ZQ, Sun XL, Yang HL, Wang YS, Song W Characterization of a novel plant growth promoting bacteria strain Delftia tsuruhatensis HR4 both as diazotroph and a potential biocontrol agent against various plant pathogens. Systematic and Applied Microbiology, 28(1): 6676 Hayward AC Biology and epidemiology of bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearum. Annual Review of Phytopathology, 29(1): 6587 Li W, Lu CD Regulation of carbon and nitrogen utilization by CbrAB and NtrBC twocomponent systems in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology, 189(15): Mols M, de Been M, Zwietering MH, Moezelaar R, Abee T Metabolic capacity of Bacillus cereus strains ATCC and ATCC interlinked with comparative genomics. Environmental Microbiology, 9(12): Oh YK, Palsson BO, Park SM, Schilling CH, Mahadevan R Genomescale reconstruction of metabolic network in Bacillus sub

10 762 植物保护学报 44 卷 tilis based on highthroughput phenotyping and gene essentiality data. The Journal of Biological Chemistry, 282: Oku S, Nishiyama M, Takao Y Selective isolation of bacteria from soil with hydrophobic materials. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 27(8): Qian YL, Wang XS, Wang DZ, Zhang LN, Zu CL, Gao ZL, Zhang HJ, Wang ZY, Sun XY, Yao DN, et al The detection of QTLs controlling bacterial wilt resistance in tobacco (N. tabacum L.). Euphytica, 192(2): Rico A, Preston GM Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 uses constitutive and apoplastinduced nutrient assimilation pathways to catabolize nutrients that are abundant in the tomato apoplast. Molecular PlantMicrobe Interactions, 21(2): Robertson AE, Wechter WP, Denny TP, Fortnum BA, Kluepfel DA Relationship between a virulence gene (avra) diversity in Ralstonia solanacearum and bacterial wilt incidence. Molecular PlantMicrobe Interactions, 17(12): Tan SY, Dong Y, Liao HP, Huang JF, Song S, Xu YC, Shen QR. 2013a. Antagonistic bacterium Bacillus amyloliquefaciens induces resistance and controls the bacterial wilt of tomato. Pest Management Science, 69(11): Tan SY, Yang CL, Mei XL, Shen SY, Raza W, Shen QR, Xu YC. 2013b. The effect of organic acids from tomato root exudates on rhizosphere colonization of Bacillus amyloliquefaciens T5. Applied Soil Ecology, 64: 1522 Trigalet A, Trigalet demery D, Feuillade R Aggressiveness of French isolates of Ralstonia solanacearum and their potential use in biocontrol. European and Mediterranean Plant Protection Organization, 28(1/2): Wang HC, Huang YF, Wang J, Wang MS, Xia HQ, Lu HX. 2015a. Phenotypic fingerprints of Ralstonia solanacearum Biovar 3 from tobacco and tomato in China assessed by phenotype microarray analysis. Plant Pathology Journal, 14(1): 3843 Wang HC, Huang YF, Xia HQ, Wang J, Wang MS, Zhang CQ, Lu HX. 2015b. Phenotypic analysis of Alternaria alternata, the causal agent of tobacco brown spot. Plant Pathology Journal, 14(2): Wang HC, Wang J, Xia HQ, Huang YF, Wang MS, Jia MG, Yu ZH. 2015c. Sensitivities of Ralstonia solanacearum to streptomycin, calcium oxide, mancozeb and synthetic fertilizer. Plant Pathology Journal, 14(1): 1322 Wei Z, Yang XM, Yin SX, Shen QR, Ran W, Xu YC Efficacy of Bacillus fortified organic fertilizer in controlling bacterial wilt of tomato in the field. Applied Soil Ecology, 48(2): Wu K, Yuan SF, Xun GH, Shi W, Pan B, Guan HL, Shen B, Shen QR Root exudates from two tobacco cultivars affect colonization of Ralstonia solanacearum and the disease index. European Journal of Plant Pathology, 141(4): Xue QY, Ding GC, Li SM, Yang Y, Lan CZ, Guo JH, Smalla K Rhizocompetence and antagonistic activity towards genetically diverse Ralstonia solanacearum strainsan improved strategy for selecting biocontrol agents. Applied Microbiology and Biotechnology, 97(3): Yang W, Xu Q, Liu HX, Wang YP, Wang YM, Yang HT, Guo JH Evaluation of biological control agents against Ralstonia wilt on ginger. Biological Control, 62(3): Yin XT, Xu L, Fan SS, Xu LN, Li DC, Liu ZY Isolation and characterization of an AHL lactonase gene from Bacillus amyloliquefaciens. World Journal of Microbiology Biotechnology, 26 (8): Zhu Y, Li SN, Yuan HS, Guo XJ, Zhu BC Isolation and identification of the antagonistic strain DM54 of Bacillus amyloliquefaciens against Verticillium dahlia, and optimization of antifungal protein producing condition. Frontiers of Agriculture in China, 3 (1): 1623 ( 责任编辑 : 王璇 )