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1 应用生态学报摇 2010 年 6 月摇第 21 卷摇第 6 期摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇 Chinese Journal of Applied Ecology, Jun. 2010,21(6): * 好氧反硝化菌脱氮特性研究进展 ** 梁书诚摇赵摇敏摇卢摇磊摇赵丽艳 ( 东北林业大学生命科学学院, 哈尔滨 ) 摘摇要摇好氧反硝化菌的发现, 是对传统反硝化理论的丰富与突破. 由于其在脱氮方面的独特优势, 已成为目前废水生物脱氮领域研究的热点. 好氧反硝化菌能够在有氧条件下, 利用有机碳源生长的同时将含氮化合物反硝化生成 N 2 等气态氮化物, 多数还能同时进行异养硝化作用, 将铵态氮直接转化为含氮气体. 本文从电子理论 反硝化酶系等方面对目前已分离出的一些好氧反硝化菌的脱氮特性及其脱氮机理进行探讨, 分析了溶解氧 碳源类型及 C / N 等环境条件对其脱氮作用的影响, 介绍了好氧反硝化菌的筛选方法及应用现状, 对其应用前景和发展方向进行了展望. 关键词摇好氧反硝化菌摇反硝化酶摇脱氮特性摇作用机理摇异养硝化 文章编号摇 (2010) 摇中图分类号摇 Q 摇文献标识码摇 A Research advances in denitrogenation characteristics of aerobic denitrifiers. LIANG Shu 鄄 cheng, ZHAO Min, LU Lei, ZHAO Li 鄄 yan (College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin , China). 鄄 Chin. J. Appl. Ecol.,2010,21(6): Abstract: The discovery of aerobic denitrifiers is the enrichment and breakthrough of traditional denitrification theory. Owing to their unique superiority in denitrogenation, aerobic denitrifiers have become a hotspot in the study of bio 鄄 denitrogenation of waste water. Under aerobic conditions, the aerobic denitrifiers can utilize organic carbon sources for their growth, and produce N 2 from nitrate and nitrite. Most of the denitrifiers can also proceed with heterotrophic nitrification simultaneously, transforming NH 4 + 鄄 N to gaseous nitrogen. In this paper, the denitrogenation characteristics and ac 鄄 tion mechanisms of some isolated aerobic denitrifiers were discussed from the aspects of electron the 鄄 ory and denitrifying enzyme system. The effects of the environmental factors DO, carbon sources, and C / N on the denitrogenation process of aerobic denitrifiers were analyzed, and the screening methods as well as the present and potential applications of aerobic denitrifiers in wastewater treat 鄄 ment were described and discussed. Key words: aerobic denitrifier; denitrifying enzyme; denitrogenation characteristics; action mecha 鄄 nism; heterotrophic nitrification. 摇摇在氮的生物地球化学循环中, 反硝化作用是其 中重要的环节. 传统脱氮理论认为要实现废水生物 脱氮必须是铵态氮经历典型的硝化与反硝化过程, 即废水中的铵态氮首先被氨氧化细菌和亚硝酸盐氧 化细菌在好氧条件下依次氧化为亚硝酸盐氮 硝酸 盐氮, 然后由反硝化细菌在厌氧或兼氧条件下将硝 酸盐氮还原为氮气或氮氧化物 [1]. 传统认识上的反 硝化菌在有氧条件下优先利用氧气作为电子受体, 只有在缺氧条件下硝酸盐才会代替氧气作为最终电 子受体, 进行反硝化作用. 近几年, 新型脱氮生物的 * 国家自然科学基金项目 ( ) 资助. ** 通讯作者. E 鄄 mail: @ 163. com 2009 鄄 09 鄄 29 收稿,2010 鄄 04 鄄 11 接受. 陆续发现, 使人们对于氮循环又有了新的认识. 好氧反硝化菌的发现就是其中之一, 好氧反硝化菌是在有氧条件下, 利用好氧反硝化酶进行反硝化作用的一类脱氮菌 [2]. 它的发现打破了反硝化只能在缺氧或厌氧条件下进行的传统观点, 为新型生物脱氮提供了新思路. 本文从好氧反硝化菌的脱氮特性 作用机理及影响因素等方面对好氧反硝化菌的研究进展和应用现状进行了综述. 1 摇好氧反硝化菌的发现及其脱氮特性关于好氧反硝化菌的研究始于 20 世纪 80 年代,Robertson 和 Kuene [3] 在除硫和反硝化处理系统中首次分离到好氧反硝化菌 Thiosphaera pantotropha

2 1582 应摇用摇生摇态摇学摇报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇 21 卷 ( 现更名为 Paracoccus pantotrophus ) Pseudomonas spp. 及 Alcaligenes faecalis. 之后很多人采用类似的 方法筛选出了此类脱氮菌 [4-5]. 近几年, 随着对好氧 反硝化作用的日益关注, 陆续有很多具有好氧反硝 化能力的新菌株被报道, 如 Klebsiella pneumoniae [6] Comamonas testosteroni [7] Pseudomona sputida [8]. 现 已报道的好氧反硝化细菌大多分布在假单胞菌属 (Pseudomonas) 芽孢杆菌属 ( Bacillus) 和产碱菌属 (Alcaligenes) 等土壤 废水常见菌属中, 其具体脱氮 特性详见表 1. 2 摇好氧反硝化作用机理及影响因素 目前, 关于好氧反硝化菌的作用机理主要是通 过对经典好氧反硝化菌株 Thiosphaera pantotropha 的 研究得到的, 现被大多数学者认同的好氧反硝化机 [27] 理是由 Robertson 等提出的协同呼吸理论. 协同 呼吸意味着在反硝化过程中, 分子氧和硝酸盐同时 作为最终电子受体, 即反硝化菌可以将电子从被还 原的物质传递给氧气, 同时也可以传递给硝酸盐. 在 细胞色素 c 和细胞色素 aa3 之间的电子传递链中的 瓶颈现象冶就可以克服. 因此也就允许电子流同时 传输到反硝化酶以及分子氧中, 反硝化反应就可能 [28] 在好氧环境中发生. 根据 Wilson 等提出的细菌 反硝化过程电子传递模型 ( 图 1) 可以看出,NO 3 - 和 O 2 均可作为电子最终受体, 反硝化菌可将电子从被 还原的物质传递给 O 2, 同时也可通过硝酸盐还原酶 将电子传递给 NO 3 -. 图 1 摇细菌反硝化过程电子传递模型 ( 根据 [28] 更改 ) Fig. 1 摇 Electron transport chain of bacteria denitrification (adapted from [28]). NR: 硝酸盐还原酶 Nitrate reductase;nir: 亚硝酸盐还原酶 Nitrite re 鄄 ductase;nor: NO 还原酶 Nitric oxide reductase;nos: N 2 O 还原酶 Ni 鄄 trous oxide reductase. 2 郾 1 摇好氧反硝化作用酶系 由于 T. pantotropha 好氧反硝化现象发现较早, 因此有关好氧反硝化酶系的研究也主要是围绕此菌 展开. 好氧反硝化过程中主要涉及到的关键酶依次 是硝酸盐还原酶 亚硝酸盐还原酶 一氧化氮还原酶 和氧化亚氮还原酶. 2 郾 1 郾 1 硝酸盐还原酶 (nitrate reductase,nr) 摇在 T. pantotropha 中表达两种异化性硝酸盐还原酶, 即膜 质硝酸盐还原酶 (membrane 鄄 bound nitrate reductase, NAR) 和周质硝酸盐还原酶 ( periplasmic nitrate re 鄄 ductase,nap). 菌体的好氧生长和厌氧生长直接影 响了这两种酶的活性. 在缺氧条件下,NAR 表达占 主导地位, 而且仅仅在厌氧条件下才能发挥作用 ; 在 好氧条件下 NAP 表达占主导地位, 并且在好氧和厌 氧条件下都能发挥作用. 厌氧条件下,NAP 也会有 所表达 [29]. 好氧反硝化的能力被与 NAP 的表达联 系在一起, 代替了厌氧反硝化菌通常表达的 NAR. 氧气被认为通过阻止硝酸盐进入 NAR 的催化中心 而参与调控硝酸盐呼吸作用 [30], 但 NAP 的催化活 性中心在细胞膜外, 因此氧气对硝酸盐鄄亚硝酸盐转 运系统的阻碍作用被解除了. 研究表明 :NAP 由一 个 90 kda 的钼喋呤结合催化亚基 (NapA) 和一个 16 kda 的细胞色素 c552(napb) 构成, 后者含有两个血 红素基团. 与 NAR 相比,NAP 对硝酸根有更高的底 物专一性, 并对叠氮化物的抑制不敏感 [31]. 2 郾 1 郾 2 亚硝酸盐还原酶 (nitrite reductase,nir) 摇亚 硝酸盐还原酶是反硝化途径的关键酶. 亚硝酸盐至 NO 的还原反应是反硝化作用区别于其他硝酸盐代 谢的标志性反应, 该酶的基因也是在反硝化菌功能 基因中被研究最多的, 已经作为反硝化菌的分子标 记而用于其种群结构及多样性的研究 [32]. 亚硝酸盐 还原酶分布于细胞膜外周质中, 有两种类型 : 一种为 含 c 和 d1 型血红素的二聚体, 称为 Cyt cd1 型亚硝 酸盐还原酶, 能将亚硝酸盐转化为 NO 和 NO 2 ; 另一 种为三聚体, 含 Cu 催化中心, 称为 Cu 型亚硝酸盐 [33] 还原酶, 产物是 NO. Moir 等从 P. pantotropha 提 纯了 Cyt cd1 型亚硝酸盐还原酶, 分子量约为 63 kda, 并且推测假天青蛋白在体内作为其电子供体. [34] Fulop 等发现 P. pantotropha 中的细胞色素 cd1 型亚硝酸盐还原酶是一种具有两种截然不同功能的 酶, 这种酶既可以催化亚硝酸盐得到一个电子还原 成 NO, 又可以催化 O 2 得到 4 个电子转化成水. 由于 亚硝酸盐和 NO 可产生活性氮 ( RNS), 会对细胞产 [35] 生毒害. Doi 等通过对耐高浓度亚硝酸盐菌株

3 6 期摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇梁书诚等 : 好氧反硝化菌脱氮特性研究进展摇摇摇摇摇摇 1583 表 1 摇好氧反硝化细菌的脱氮特性 Tab. 1 摇 Nitrogen removal characteristics of aerobic denitrifiers 菌属 Genus 假单胞菌属 Pseudomonas 产碱杆菌属 Alcaligenes 副球菌属 Paracoccus 芽孢杆菌属 Bacillus 菌株 Strain 溶解氧 Dissolved oxygen ( DO) 反硝化速率 Denitrification rate 参考文献 Reference 恶臭假单胞菌 Pseudomonas putida AD 鄄 21 5 郾 0 ~ 6 郾 0 玉 2 郾 9 a [8] 绿脓杆菌 Pseudomonas aeruginosa 1 郾 0 ~ 1 郾 3 玉 1 郾 7 b [9] 施氏假单胞菌 Pseudomonas stutzeri SU2 92% 域 0 郾 032 b [10] 施氏假单胞菌 Pseudomonas stutzeri NS 鄄 2 2 郾 7 芋 0 郾 25 a [11] 假单胞菌属类产碱杆菌 Pseudomonas pseudoalcaligenes ZW23 79% ~ 95% 域 1 郾 55 a [12] 门多萨菌 Pseudomonas mendocina ZW27 79% ~ 95% 域 1 郾 59 a [12] 施氏假单胞菌 Pseudomonas stutzeri TR2 1 郾 24 玉 0 郾 9 e [13] 假单胞菌 Pseudomonas sp 郾 strain K50 1 郾 24 玉 0 郾 03 e [13] 反硝化产碱菌 Alcaligenes denitrificans DCB T25 F 0 郾 092 b [5] Alcaligenes sp 郾 STC1 10% 域 6 郾 67 a [14] 脱氮副球菌 Paracoccus denitrifications DSM % 域 1 郾 38 c [15] Paracoccus sp 郾 DB2 F 0 郾 054 a [16] Bacillus sp 郾 SF35 鄄 1 67% ~ 84% 域 0 郾 062 a [17] 蜡状芽胞杆菌 Bacillus cereus HS 鄄 N25 N 郾 R. 0 郾 556 a [18] 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 30% 域 N. R. [19] 地衣芽孢杆菌 Bacillus licheniformis 30% 域 N. R. [19] 中慢生根瘤菌属中慢生根瘤菌 Mesorhizobium Mesorhizobium sp 郾 strain NH 鄄 14 N 郾 R. N. R. [20] 克雷伯氏菌属肺炎克雷伯菌 Klebsiella Klebsiella pneumoniae F2522 F 1 郾 04 a [6] 克雷伯氏菌 Klebsiella sp 郾 JF35 鄄 1 67% ~ 84% 域 0 郾 088 a [17] 索氏菌属索氏菌 Thauera strain TL1 Thauera N 郾 R. N. R. [15,21] 苍白杆菌属人苍白杆菌 Ochrobactrum Ochrobactrum anthropi T23 F 43 郾 3 g [5] 柠檬酸杆菌属异型枸橼酸杆菌 Citrobacter Citrobacter diversus 5 玉 5 郾 35 b [22] 嗜冷杆菌属静止嗜冷杆菌 Psychrobacter Psychrobacter immobilis DCB T6 2 玉 360 f [5] 红球菌属 Rhodococcus 红球菌 Rhodococcus sp 郾 HN N 郾 R. N. R. [23] 寡养单胞菌属嗜麦芽寡养单胞菌 Stenotrophomonas Stenotrophomonas maltophilia strain X041 3 郾 8 ~ 5 郾 2 玉 0 郾 187 d [24] 海球菌 Marinococcus 海球菌 Marinococcus sp 郾 NCDX 鄄 3 F 0 郾 093 a [25] 微枝杆菌属空气除氮微枝杆菌 Microvirgula Microvirgula aerodenitrificans DS1 F 0 郾 098 a [16] 空气除氮微枝杆菌 Microvirgula aerodenitrificans DB1 F 0 郾 079 a [16] 丛毛单胞菌属睾丸酮丛毛单胞菌 Comamonas Comamonas testosteroni WXZ 鄄 17 66% ~ 92% 域 0 郾 041 a [7] 草螺菌属草螺菌 Herbaspirillum Herbaspirillum sp 郾 WXZ 鄄 14 66% ~ 92% 域 0 郾 020 a [7] 伯克氏菌属洋葱伯克雷尔德氏菌 Burkholderia Burkholderia cepacia NH 鄄 17 N 郾 R 郾 N. R. [26] 代尔夫特菌属代尔夫特菌 Delftia Delftia WXZ 鄄 9 66% ~ 92% 域 0 郾 037 a [7] 德克斯氏菌属德克斯氏菌 Derxia Derxia sp 郾 JF45 鄄 2 67% ~ 84% 域 0 郾 082 a [17] 玉 : 30 益时 DO 的估计值 30 益 estimated value of dissolved oxygen ( mg L -1 ); 域 : 液体中 DO 饱和度 Saturation degree of dissolved oxygen; 芋 : mmol L -1 - ; F: 完全好氧 Absolute aerobic; N. R. : 未提及 Not referred. a) mmol NO 3 鄄 N L -1 h -1 - ;b) mmol NO 3 鄄 N g -1 ( DM) h -1 / mmol - NO 3 鄄 N g -1 (dry cell) h -1 - ;c)mmol NO 3 鄄 N g -1 (pro) h -1 - ;d)mmol NO 2 鄄 N L -1 h -1 ;e) 滋 mol min -1 (540 nm);f)mg N g -1 d -1 ;g)n 2 mmol g -1 (pro) h -1.

4 1584 应摇用摇生摇态摇学摇报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇 21 卷 Ochrobactrum anthropi YD50 郾 2 的研究表明, 其 Cu 型 亚硝酸盐还原酶基因和 NO 还原酶基因成簇分布在 一起, 推断 Nir 鄄 nor 作为一对刺激影响因子会对 RNS 做出快速应答, 以解除其对细胞的毒害作用. 2 郾 1 郾 3 NO 还原酶 (nitric oxide reductase,nor) 摇 NO 还原酶结合于细胞膜上, 由两个亚基构成, 分子量分 别为 34 kda 和 15 kda. 每分子含有两个亚铁血红素 b 和一个亚铁血红素 c, 未发现铜原子. 光谱特性表 明, 其中一个亚铁血红素 b 和亚铁血红素 c 处于 6 配位的低自旋状态, 而另一个亚铁血红素 b 处于 5 配位的高自旋状态, 可以和 CO 反应. 在亚铁细胞色 素 c550 作为电子供体的条件下, 此酶显示出很高的 细胞色素 c 型 NO 氧还酶活性, 并将 NO 转化为了 N 2 O [36]. NO 还原酶对 NO 具有很高的亲和力, 将有 限的电子集中用于 NO 还原, 使 NO 浓度维持在极 低的水平, 避免了 NO 对生物体的毒性影响. 2 郾 1 郾 4 N 2 O 还原酶 (nitrous oxide reductase,nos) 摇 N 2 O 至 N 2 的还原反应是由 N 2 O 还原酶催化的. 好 氧反硝化菌的 N 2 O 还原酶位于细胞膜外周质, 是分 子量 67 kda 的铜型二聚体, 不含血红素基团. Bell [29] 等认为, 在有氧条件下,T. pantotropha 细胞 N 2 O 还原酶具有活性, 能将 NO N 2 O 两种气体同时还原, [37] 但二者会相互抑制. Berks 等从好氧和厌氧生长 的 T. pantotropha 细胞中提纯了 N 2 O 还原酶, 发现 其在分子特性上与从厌氧反硝化微生物中提取的一 氧化二氮还原酶具有相似之处. T. pantotropha 和 Rhodobacter capsulatus 的 N 2 O 还原酶活性并不受氧 抑制, 在有氧情况下,P. pantotropha 能够把 N 2 O 还 原成 N 2 [29]. 由此可见, 只要能获得电子,N 2 O 的还 原反应就能进行. 2 郾 2 摇好氧反硝化菌反硝化的影响因素 溶解氧浓度 (DO) 碳氮比 ( C / N) 温度 ph 值 通常被认为是反硝化作用的关键限制性因素, 但是 不同的菌种 反应器及环境条件使这些因素的影响 效果不尽相同. 近几年的研究成果显示,DO 和 C / N 是影响好氧反硝化活性的主要因素 [22]. 2 郾 2 郾 1 DO 摇根据多年来报道的好氧反硝化菌来看, 不同菌属的好氧反硝化菌对氧气的耐受能力差异显 著. 大部分好氧反硝化菌在 DO 浓度 3 mg L -1 以下 具有反硝化活性 ( 表 1). DO 浓度对反硝化菌的影响 主要有两大类型. 第一种, 在一定范围内, 反硝化速 率不受 DO 值的影响. 但是当 DO 值降低到某个值 时, 反硝化酶系的活性开始急剧上升, 反硝化率随着 DO 值的降低而较大幅度地升高, 这就是所谓的阈 值 [38] [39]. Patureau 等在研究好氧反硝化菌株 Micro 鄄 virgula aerodenitrificans 时发现 : 当 DO 浓度高于 4. 5 mg L -1 时, 对该菌株的反硝化速率没有影响 ; 当 DO 浓度低于 4 郾 5 mg L -1 时, 随着溶氧浓度的下降, 反 [22] 硝化率大幅度的升高. 另一种情况是 Huang 等在 研究好氧反硝化菌 Citrobacter diversus 时发现的, 该 菌株在 DO 为 5 mg L -1 时反硝化速率最高, 溶氧的 降低和升高都会导致反硝化速率和细胞生长速率的 下降. 在阈值以上, 反硝化速率保持在一个较低的水 平, 原因可能是由于在此 DO 浓度以上, 氧气对于反 硝化酶有抑制作用, 因此反硝化酶的合成与活性被 控制在一个较低的水平. 目前关于氧气对硝酸盐还 原的抑制作用方式的研究主要有以下几种结论 : 1) 与硝酸盐竞争电子 ; 2) 阻止反硝化酶的合成 ; 3) 阻 止硝酸盐转移到硝酸盐还原酶作用位点 [28]. 2 郾 2 郾 2 C 源与 C / N 摇目前发现的绝大多数好氧反硝 化菌是异养菌, 很多以有机碳作为能源. 由于代谢机 理 电子传递途径的差异, 所需的碳源和 C / N 呈现 多样性. 一些研究证实, 在一个适当的范围内, 作为 能源的碳源浓度越高, 好氧反硝化速率越快 [3]. Richardson 和 Ferguson [40] 的研究发现, 周质硝酸盐 还原酶的活性很大程度上取决于碳源,T. pantotro 鄄 pha 在以丁酸盐和己酸盐作为碳源时酶活最高, 醋 酸为碳源时次之, 苹果酸盐和琥珀酸盐为碳源时最 [22] 低. Huang 等的研究发现, 以醋酸盐作为碳源, C / N 为 5 时, C. diversus 反硝化速率最大, 并随着 [8] C / N 的增大反硝化速率下降. Kim 等通过对 P. putida AD 鄄 21 的研究发现, 醋酸盐 琥珀酸盐和葡萄 糖都是很好的碳源, 甲醇和乙醇作为碳源时反硝化 活性不高, 在 C / N 为 8 时表现出最高的反硝化活 性. 因为反硝化本身是个氧化还原反应, 碳源氧化还 原电位的不同会对反硝化作用产生不同影响. 另外, 碳源不足会导致菌体的生长受限, 反硝化过程酶系 合成不完全, 造成中间产物的积累使反硝化不彻 底 [41-42]. 3 摇好氧反硝化菌的主要特点 3 郾 1 摇异养硝化 好氧反硝化菌的另一个特点是大多表现出异养 硝化能力. 这种硝化与反硝化作用的偶联意味着铵 态氮在好氧条件下可直接转化成气态产物. T. pan 鄄 totropha 的硝化过程与自养菌不同, 其硝化作用是一 个耗能反应, 硝化速率随着溶解氧降低而增加, 在溶 氧浓度达到空气饱和溶氧浓度的 25% 时达到最

5 6 期摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇梁书诚等 : 好氧反硝化菌脱氮特性研究进展摇摇摇摇摇摇 1585 大 [27]. 因为偶联的异养硝化鄄好氧反硝化产生的能 量要比自养硝化和反硝化产能更少, 因此有人推测 好氧反硝化菌的异养硝化作用在对还原性的碳源进 行氧化的代谢过程中起着驱散多余还原力的作 用 [43]. 参与异养硝化的酶包括氨单加氧酶 (ammonia monooxygenase,amo) 和羟胺氧化酶 ( hydroxylamine oxidase,hao) [44]. 3 郾 2 摇气态产物 好氧反硝化菌较传统反硝化菌的一个特点是产 物主要为 N 2 O [13], 由于 N 2 O 生成的机理很复杂, 目 前对其代谢机制的认识还不够全面. 有观点认为 N 2 O 还原酶对氧气很敏感,N 2 O 在低溶解氧浓度下 会取代 N 2 成为反硝化的最终产物 [45]. 还有研究报 道, 好氧反硝化过程中 C / N 较低 DO 浓度低 SRT ( 污泥停留时间 ) 小都会导致 N 2 O 的累积而使其释 [13] 放量增大. Takaya 等筛选出两株反硝化细菌 TR2 和 K50, 在好氧条件下产生少量的 N 2 O. 刘晶晶 [42] 等通过对一株产生低水平 N 2 O 的好氧反硝化菌 Delftia tsuruhatensis 的研究发现, 对该菌株 N 2 O 气体 的产生影响最大的因素为 C / N, 其次为 DO 和 ph. 如何优化反应条件, 降低中间产物积累, 筛选 N 2 O 产量低的好氧反硝化菌已成为真正意义上实现生物 脱氮的关键所在. 3 郾 3 摇筛选方法 好氧反硝化细菌由于其非典型特性, 在环境中 不易成为优势菌, 因此采用一般筛菌方法不易将其 筛选出来. 3 郾 3 郾 1 驯化摇目前, 好氧反硝化菌的驯化主要采用 间歇曝气法. 大部分研究者认为, 好氧 / 缺氧环境的 频繁转换使得完全好氧菌和厌氧菌不能正常生长, 增加了好氧反硝化菌转变为优势菌的可能性, 另外 高 C / N 有助于好氧反硝化菌的筛选 [7]. Patureau [16] 等利用间歇曝气法对取自不同地点的样品进行 了长期驯化, 分离筛选出了 10 株好氧反硝化菌. [7] Wang 等对 SBR 反应器的活性污泥采用间歇曝气 并增大溶氧浓度 (DO 2 郾 2 ~ 6 郾 1 mg L -1 ) 的方式进 行驯化, 成功实现了好氧反硝化菌的富集. [46] 3 郾 3 郾 2 培养基摇孔庆鑫等通过向反硝化培养基 中加入氰化钾 (KCN), 同时对培养基曝气来筛选好 氧反硝化菌. KCN 可终止呼吸链中电子向氧分子的 传递, 从而抑制利用氧作为电子受体的呼吸反应, 同 时曝气状态下, 氧分子又抑制了厌氧条件下起作用 的酶 ( 如膜质硝酸盐还原酶 ), 在这种条件下, 好氧 [13] 反硝化细菌得到富集. Takaya 等根据反硝化过程 产碱这一特性, 设计了 ph 指示剂培养基, 即通过向 反硝化培养基中加入酸碱指示剂溴百里酚蓝 ( ph 6 郾 2 ~ 7 郾 6; 黄 - 蓝 ), 当培养基颜色由初始的绿色 (ph 7 郾 2) 变为蓝色时即表示可能进行了反硝化作用, 初 步认定为好氧反硝化菌. 4 摇好氧反硝化菌的应用 随着近代生物学的发展和人们对生物技术的掌 握, 脱氮技术已由单纯工艺改革向着以生物学特性 促进工艺改革的方向发展, 从而实现高效低耗. 好氧 反硝化菌凭借其独特的生物学特性而在很多领域得 到重视利用, 一些以之为基础的新型脱氮工艺也应 运而生. 4 郾 1 摇废水处理方面 好氧反硝化菌的发现, 奠定了同步硝化反硝化 工艺 ( simultaneous nitrification and denitrification, SND) 的生物学基础. 所谓的同步硝化反硝化就是在 一个具有好氧条件的反应器内同时完成硝化和反硝 化作用. 在废水处理方面, 同步硝化反硝化相对于传 统的生物脱氮工艺具有明显的优势 [7]. 首先在同一 个反应器内实现硝化反硝化和除碳不仅使得反应器 程序简易 ( 好氧条件较厌氧条件更容易控制 ), 而且 降低了操作难度及运行成本 ; 其次, 反应速率大幅提 高. 硝化过程的产物亚硝酸盐和硝酸盐可以直接作 为反硝化的底物, 避免了硝化产物的累积, 并且如果 能将硝化过程控制在亚硝酸盐阶段, 即硝化作用产 生的亚硝酸盐直接进行反硝化, 就可以实现亚硝酸 型同步硝化反硝化 [47] ; 最后, 稳定反应器的 ph 值. 反硝化过程产碱, 可以部分补偿硝化过程所产的酸, 降低外加碱的费用, 并且减少二次污染 年, [48] Gupta 等用含有 T. pantotropha 混合微生物膜的 生物转盘 ( rotating biological contactor,rbc) 处理不 同浓度的生活污水时, 在有机负荷在 10 郾 0 ~ 32 郾 0 g COD m -2 d -1 和铵态氮负荷在 1 郾 0 ~ 3 郾 35 g N m -2 d -1 的情祝下,COD 和铵态氮去除速率高达 8 郾 7 ~ 25 郾 9 g COD m -2 d -1 和 0 郾 81 ~ 1 郾 85 g N m -2 d -1, 在好氧条件下实现了有机物和氮的同步 [49] 高效去除. Joo 等利用粪产碱菌 (Alcaligenes faeca 鄄 lis) No. 4 在好氧状态下处理高有机负荷 ( COD mg L -1 ) 和高铵态氮负荷 (2000 mg L -1 ) 的 猪舍废水, 铵态氮去除速率达到 30 mg L -1 h -1, 且好氧反硝化率超过 65%. 在控制一定的 C / N 和 ph 值的连续处理状况下,COD 和铵态氮的去除率 [50] 达到 100%. 在 Kshirsagar 等的研究中, 使用两个

6 1586 应摇用摇生摇态摇学摇报摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇 21 卷 操作条件完全相同的氧化沟来处理模拟肥料工业废 水, 比较在有 T. pantotropha 和无 T. pantotropha 时的 脱氮速率, 当进水总凯氏氮 (total Kjeldahl nitrogen, TKN) 的质量浓度为 790 mg L -1 时, 含有 T. pantotro 鄄 pha 的氧化沟系统中硝化段的 TKN 去除效率和反硝 化段的总氮 (total nitrogen,tn) 去除效率分别比对照 系统高出 10% 和 20%, 由此可见 T. pantotropha 在异 养硝化和好氧反硝化方面具有的重要作用. 4 郾 2 摇水产养殖 养殖水体的最大特点是, 铵态氮和亚硝态氮含 量较高, 而这两种氮素对鱼虾的危害最大, 因此铵盐 和亚硝酸盐的有效去除是养殖水体修复的关键. 另 外水产的高密度养殖要求必须连续地充氧以保证水 中溶解氧含量, 实际生产中养殖水体的溶氧浓度一 般应保持在 4 ~ 8 mg L -1 [51]. 基于以上两个特点, 人们将目光转向了好氧反硝化细菌. 好氧反硝化菌 生长速度快, 有氧条件下具备反硝化能力, 并且与传 统的化学自养硝化菌不同, 好氧反硝化菌多数也是 异养硝化菌, 可将氨在好氧条件下直接转换成气态 产物. 另外, 咸水鱼的养殖水体具有一定含盐量, 具 有耐盐特性的好氧反硝化菌株的选育为探寻养殖水 体水质净化提供了新思路, 具有重要社会经济意义. [24] 廖绍安等从养虾池悬浮生物膜中分离的嗜麦芽 寡养单胞菌在溶氧浓度 3 郾 80 ~ 5 郾 12 mg L -1 条件 下, 可在 10 h 内将亚硝酸盐从 26 郾 18 mg L -1 还原 至 0, 同时该菌株在盐度 0 ~ 20 之间显示出较高的 [51] 反硝化活性. 于爱茸等从鱼塘中分离得到一株高 效好氧反硝化芽孢杆菌, 对高浓度亚硝酸盐具有很 [52] 强的降解能力. 张小玲等将分离到的好氧反硝化 菌 H2 投入模拟养殖水体, 脱氮效果明显. 4 郾 3 摇其他 好氧反硝化菌在废气处理 污染物降解方面也 表现出了极大的应用潜力. NO 是一种常见的工业 废气, 并且生产排放的废气中大多含有高浓度的氧 [53] 气,Jiang 等通过向生物滴滤塔引入好氧反硝化 细菌 Pseudomonas putida, 在充足的 O 2 供应条件下 (2% ~ 20% ), 当流入的 NO 浓度为 400 mg m -3 时, 可连续去除 82 郾 9% ~ 92 郾 4% 的 NO. 研究表明, 当氧气和硝酸盐同时作为电子受体时, 芳香烃类污 染物的降解速率会明显提升 [28] [54]. Baek 等分离的 产碱菌 P5 能在好氧条件下以苯酚为有机碳源进行 反硝化作用, 同步高效地去除苯酚和硝酸盐. Suzuki [55] 等从含有聚乙烯醇 (polyvinyl alcohol,pva) 的土 壤中分离出 1 株好氧反硝化假单胞菌 O 3, 然后将其 利用到含有 PVA 的废水处理中, 实现了 PVA 的高 效降解. N 2 O 的排放是土壤氮素气态损失的主要途 径, 而且 N 2 O 是一种公认的温室效应很强的气 体 [56], 关于好氧反硝化菌对其影响的报道并不多. [57] 蒋静艳等对两株好氧反硝化菌 XM1 和 HX2 进 行了研究, 分析其在纯培养条件及不同水分和氮源 条件下产生 N 2 O 的作用, 为深入研究土壤 N 2 O 产生 机制及减排途径提供了科学依据. 5 摇好氧反硝化技术展望 好氧反硝化的研究是对传统脱氮理论的丰富与 突破, 虽然目前仍有很多机理未得到揭示, 对一些现 象的解释也不尽圆满, 但好氧反硝化作用的重要性 日益受到关注. 目前, 关于好氧反硝化菌的应用大都 处于实验室规模的小试阶段. 并且, 对于好氧反硝化 菌的作用机理的研究还不够深入. 今后的研究重点 主要包括以下 3 方面 :1) 筛选分离具有耐高溶氧 耐盐等特点的好氧反硝化菌 ;2) 将分子生物学技术 与微生物技术相结合, 深入研究好氧反硝化的作用 机理, 利用基因重组 基因改组等分子生物学技术构 建高效基因工程菌, 提高生物脱氮的效率 ;3) 研究 以好氧反硝化菌为主体的各种脱氮工艺技术, 指导 其在工程上的应用, 实现废水的高效经济脱氮. 参考文献 [1] 摇 Ahn YH. Sustainable nitrogen elimination biotechnolo 鄄 gies: A review. Process Biochemistry, 2006, 41: [2] 摇 Wang W ( 王摇薇 ), Cai Z 鄄 C ( 蔡祖聪 ), Zhong W 鄄 H ( 钟文辉 ), et al. Research advances in aerobic denitri 鄄 fiers. Chinese Journal of Applied Ecology ( 应用生态学报 ), 2007, 18(11): (in [3] 摇 Robertson LA, Kuenen JG. Thiosphaera pantotropha gen. nov. sp. nov., a facultatively anaerobic, faculta 鄄 tively autotrophic sulphur bacterium. Journal of General Microbiology, 1983, 129: [4] 摇 Frette L, Gejlsbjerg B, Westermann P. Aerobic denitri 鄄 fiers isolated from an alternating activated sludge sys 鄄 tem. FEMS Microbiology Ecology, 1997, 24: [5] 摇 Pai SL, Chong NM, Chen CH. Potential applications of aerobic denitrifiying bacteria as bioagents in wastewater treatment. Bioresource Technology, 1999, 68: [6] 摇 Kim YJ, Yoshizawa M, Takenakas S, et al. Isolation and culture conditions of a Klebsiella pneumoniae strain that can utilize ammonium and nitrate ions simultaneous 鄄 ly with controlled iron and molybdate ion concentrations. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 2002, 66: [7] 摇 Wang P, Li XT, Xiang MF, et al. Characterization of efficient aerobic denitrifiers isolated from two different sequencing batch reactors by 16S 鄄 rrna analysis. Jour 鄄

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