呼吸强度, 耗氧量 酶活性 生物热与其群体的规模成正相关样品中微生物数量多或生长旺盛, 这些指标愈明显, 因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪 微量量热计等设备来测定相应的指标 常用于对微生物的快速鉴定与检测 4. 什么是细菌的生长曲线? 生长曲线有什么特点? 生长曲线 : 细菌接种到定量的液体培养

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1 生长和控制 : 1. 微生物生长与繁殖的定义 微生物生长是细胞物质有规律地 不可逆的增加, 导致细胞体积扩大的生物学过程 繁殖是微生物细胞生长到一定阶段, 由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体, 引起生命个体数量增加的生物学过程 2. 快速生长的细菌里 DNA 复制与细胞分裂是如何协调的? 细菌中 DNA 的复制和细胞分裂两个过程的控制是不连接的 染色体以双向的方式进行连续的复制, 在细胞分裂之前不仅完成了染色体的复制, 而且也开始了两个子细胞的复制 其复制起点附着在细胞膜上, 随着膜的生长和细胞的分裂, 两个未来的子细胞基因组不断的分离开来, 最后到达两个子细胞中 3. 微生物生长的测定方法有哪几种, 各有什么优缺点? 请举例说明 以数量变化对微生物生长情况进行测定 : 通常用来测定细菌 酵母菌等单细胞微生物的生长情况或样品中所含微生物个体的数量 ( 细菌 胞 ( 孢 ) 子 酵母菌 ) 1 培养平板计数法对样品进行适当稀释 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长 繁殖 肉眼可见的菌落 对菌落数目的计数推测样品中的微生物细胞数由于无法保证细菌细胞在分离过程中彻底分开, 因此, 一个菌落可能是多个细胞一起形成, 所以在科研中一般用菌落形成单位 (colony forming units, CFU) 来表示, 而不是直接表示为细胞数 ( 个 ) 1 稀释倒平板法操作较麻烦, 对好氧菌 热敏感菌效果不好! 2 涂布平板法使用较多的常规方法, 但有时涂布不均匀! 采用培养平板计数法要求操作熟练 准确, 否则难以得到正确的结果 : 2 膜过滤培养法菌数低的样品 ( 如水 ) 膜过滤 培养 菌落计数 3 显微镜直接计数法采用细菌计数板或血球计数板, 在显微镜下对微生物数量进行直接计数 ( 计算一定容积里样品中微生物的数量 ) 不能区分死菌与活菌 ; 不适于对运动细菌的计数 ; 需要相对高的细菌浓度 ; 个体小的细菌在显微镜下难以观察 ; 采用特定的染色技术也可分别对活菌和死菌进行分别计数以生物量为指标测定微生物的生长 1 比浊法在一定波长下, 测定菌悬液的光密度, 以光密度 (optical density, 即 O.D.) 表示菌量 实验测量时应控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内, 否则不准确 2 重量法以干重 湿重直接衡量微生物群体的生物量 ; 通过样品中蛋白质 核酸含量的测定间接推算微生物群体的生物量 ; 测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法 3 生理指标法

2 呼吸强度, 耗氧量 酶活性 生物热与其群体的规模成正相关样品中微生物数量多或生长旺盛, 这些指标愈明显, 因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪 微量量热计等设备来测定相应的指标 常用于对微生物的快速鉴定与检测 4. 什么是细菌的生长曲线? 生长曲线有什么特点? 生长曲线 : 细菌接种到定量的液体培养基封闭系统中, 定时取样测定细胞数量, 以培养时间为横座标, 以菌数为纵座标作图, 得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线 一条典型的生长曲线至少可以分为迟缓期, 对数期, 稳定期和衰亡期等四个生长时期 5. 细菌群体生长有哪些不同时期, 各有什么特点? 其产生原因是什么? 1 迟缓期: 细菌数不增加原因 :( 1) 种子老化 (2) 适应新环境的酶系统没有表达 2 对数生长期: 最大生长速率, 对数增加, 平衡生长 3 稳定生长期: 生长速率为零, 活菌数最多原因 : 营养物质耗尽 代谢产物积累 ph 等环境变化引起细菌不宜生长 4 衰亡期 : 代谢活性降低 衰老自溶原因 : 营养物质耗尽, 有毒代谢产物大量积累 6. 概念 : 代时 比生长速率 倍增时间 迟缓时间 代时 (generation time): 每个细菌分裂繁殖一代所需的时间 ; 比生长速率 (specific growth rate): 每单位数量的细菌或物质在单位时间内增加的量 ; 倍增时间 (doubling time): 在群体生长中, 细菌数量增加一倍所需的时间 影响微生物代时的因素 迟缓时间 : 微生物生长过程中, 在实际条件达到对数生长其所需的时间与理想条件 ( 无迟缓时期 ) 下达到对数生长期所需的时间之差 7. 什么是细菌的平衡生长? 当连续培养时, 控制流入培养体系内的营养物质速率使之与细菌在单位时间内消耗的营养物质速率相等. 此时培养体系内细菌数可以维持在一定的水平上, 表明连续培养达到平衡状态. 8. 什么是二次生长曲线? 微生物在同时含有速效碳源 ( 或氮源 ) 和迟效碳源 ( 或氮源 ) 的培养基中生长时, 微生物会首先利用速效碳源 ( 或氮源 ) 生长直到速效碳源 ( 或氮源 ) 耗尽, 然后经过短暂的停滞后, 再利用迟效碳源 ( 或氮源 ) 重新开始生长这种生长或应答为二次生长 二次生长过程中, 菌数随时间的变化曲线称为二次生长曲线 9. 什么是 Quorum sensing? 其生理意义是什么? 群体感应 Quorum sensing: 细菌检测自身种群密度的现象 ; 借助于信号分子, 局部细胞密度提高, 信号分子密度也随之提高 ; 当超过阈值时, 细菌 QS 相关的基因开始表达, 细菌生理发生改变 ; 进入稳定生长期, 次级代谢开始旺盛, 细胞具有新的生理特点 群体感应的生理学意义 : 细菌细胞个体之间的交流, 协同效应 细菌次级代谢的调控机制

3 细菌生物被膜 (biofilm) 形成的控制机制 细菌发光 运动等生理功能的控制机制 细菌毒性及抗性的控制机制 10. 什么是恒化器连续培养 恒浊器连续培养? 如何进行连续培养? 恒化连续培养 : 保持培养基中某营养物质的浓度基本恒定, 使细菌的比生长速率恒 定, 不断 生长 ( 流速恒定 ) 恒浊连续培养 : 保持培养液中菌体浓度保持恒定, 使细菌生长连续进行 ( 流速变 化 ) 培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物是实现微生物连续培养 的基本原则 11. 微生物生长的温度三基点是什么? 温度对微生物生长的影响有哪些? 最适生长温度, 最高生长温度, 最低生长温度. 影响 : (1) 酶活性 ; (2) 细胞质膜的流动性 ; (3) 物质的溶解度 12. ph 对微生物生长的影响是什么? ph 对微生物生长的具体影响 : (1) 代谢反应中各种酶活性 ; (2) 影响细胞膜的透性和稳定性 ; (3) 改变营养物质的离子化程度, 影响其吸收和运输 ; (4) 有害物对微生物的毒害 13. 根据氧与微生物生长的关系可将微生物分为哪几种类型? 氧对微生物有什么副作用, 微 生物是通过哪种机制消除这种副作用? 专性好氧, 兼性好氧, 耐氧, 专性厌氧, 微好氧 产生有毒害作用的代谢产物, 如超氧基化合物和 H 2 O 2 通过 SOD 催化 O 2 - 分解为 H 2 O 2, 然后在 H 2 O 2 酶的作用下生成水 14. 什么是十倍致死时间? 十倍致死时间 : 在单位剂量下, 微生物数量减少 10 倍所需要的时间 15. 干热对微生物的灭菌条件是什么? 湿热对一般营养体和胞 ( 孢 ) 子的杀灭条件是什么? 干 : 烘箱内热空气灭菌 160,2 小时 ; 火焰灼烧湿 : 多数细菌和真菌的营养细胞 : 在 60 左右处理 5-10 分钟 ; 酵母菌和真菌的孢子 : 用 80 以上温度处理 ; 细菌的芽胞 :121 处理 15 分钟以上 ; 16. 常规加压灭菌法中高压灭菌和低压灭菌的条件是什么? 巴氏消毒法的条件是什么? 常规高压灭菌 (autoclaving)121,15 分钟 ;115,30 分钟 ; 巴 :60-85 处理 15 秒至 30 分钟 17. 抗微生物剂根据抗微生物程度分为哪三个类型? 如何用实验区分? 抑菌剂 杀菌剂 溶菌剂待测化学物质 + 对数生长培养物, 定时测定总菌数和活菌数总菌数活菌数

4 抑菌剂 O O 杀菌剂 O - 溶菌剂 通常用于测定抗微生物剂的效率的两种方法 液体培养法 平板培养法 19. 什么是消毒剂 防腐剂? 消毒剂 : 可杀死微生物, 通常用于非生物材料的灭菌或消毒 防腐剂 : 能杀死微生物或抑制其生长, 但对人及动物的体表组织无毒性或毒性低, 可作为外用抗微生物药物 20. 什么是抗代谢物? 一类化合物 : 与必需的代谢物具有相似的结构 ; 可和特定的酶结合 ; 阻碍酶的功能 ; 干扰代谢的正常进行 ; 21. 抗生素的定义是什么? 常用抗生素的杀菌抑菌机制 是由某些生物合成或半合成的一类次级代谢产物或衍生物, 它们在很低浓度时就能抑制或影响它种生物的生命活动, 如杀死微生物或抑制其生长 通过抑制细菌细胞壁合成 破坏细胞质膜 作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化 抑制蛋白质和核酸合成抑制微生物的生长或杀死它们 22. 抗性菌株 耐药性菌株出现的原因是什么? 细胞质膜透性改变, 药物作用靶位点改变 ; 合成了修饰抗生素的酶 ; 抗性菌株发生遗传变异代谢 : 1. 三个基本概念 : 代谢 分解代谢 合成代谢代谢 (metabolism): 细胞内发生的各种化学反应的总称分解代谢 : 细胞将大分子物质降解成小分子物质, 并在这个过程中产生能量合成代谢 : 细胞利用简单的小分子物质合成复杂大分子, 这个过程要消耗能量 2. 什么是生物氧化过程? 与燃烧相比, 生物氧化有什么特点? 产能代谢实际上是物质在生物体内经过一系列连续的氧化还原反应, 逐步分解并释放能量的过程, 这个过程就是生物氧化 生物氧化就是发生在或细胞内的一切产能性氧化反应的总称 与燃烧相比 : 过程是可控的 : 酶的量及活性的控制能量是可储存的 3. 化能异养微生物利用含碳化合物的优先顺序是什么? 糖类优于其他化合物 ; 单糖优于双糖 多糖 ; 己糖优于戊糖 ; 葡萄糖 果糖优于其他己糖 ; 4. 糖酵解有哪些途径? 选用 ED 途径会有哪些优势? (1) EMP 途径 (2)HM 途径 (3)ED 途径 (4) 磷酸解酮酶途径 (HK&PK) 葡萄糖醛酸 果糖酮酸 甘露糖醛酸等都可以先各自转化成 KDPG, 然后进入 ED 途径降解, 扩大代谢底物的范围 5. 什么是生理性发酵? 其意义是什么? 生理性发酵 : 是指微生物细胞将有机物氧化释放的电子直接交给底物本身未完全氧化的某种中间产物, 同时释放能量并产生各种不同的代谢产物的过程 在无氧条件下, 有机物氧化产能的过程 在该氧化过程中释放的电子不通过电子传

5 递链, 而是直接交给本身未完全氧化的某种中间产物, 使之还原成各种不同的有机 代谢产物 6. 什么是酵母的 I 型 II 型 III 型乙醇发酵? 其电子受体和产物是什么? EMP 7. 什么是同型乳酸发酵 异型乳酸发酵? 其电子受体和产物是什么? 同 电子受体 异

6 8. 什么是益生菌? 益生菌系一种对动物有益的细菌, 它们可直接作为食品添加剂服用, 以维持肠道菌群的平衡 9. 什么是呼吸作用? 与发酵的区别是什么? 微生物在降解底物的过程中, 将释放出的电子交给 NAD(P) + FAD 或 FMN 等电子载体, 再经电子传递系统传给外源电子受体, 从而生成水或其它还原型产物并释放出能量的过程, 称为呼吸作用 区别 : 电子载体不是将电子直接传递给底物降解的中间产物, 而是交给电子传递系统, 逐步释放出能量后再交给最终电子受体 10. 细菌电子传递链的特点 11. 什么是无氧呼吸? 其电子受体都有哪些? 某些厌氧和兼性厌氧微生物在无氧条件下进行无氧呼吸 ; 无氧呼吸的最终电子受体不是氧, 而是 NO - 3 NO - 2 SO 2-4 S 2 O 2-3 CO 2 等无机物, 或延胡索酸 (fumarate) 等有机物 12. 为什么自养微生物生长缓慢? 且又在环境中不被竞争淘汰? ( 找不到官方答案 )

7 13. 是比较硝化作用和反硝化作用 硝化作用 : 氨氧化为硝酸 反硝化作用 : 硝酸还原为氮气 NO 3 - NO 2 - NO-->N 2 O N 氧化亚铁硫杆菌的铁 - 硫氧化对环境有什么不好的影响? 如何转变为新的生产力? 在富含 FeS 2 的煤矿中, 氧化亚铁硫杆菌繁殖, 产生大量的硫酸和 Fe(OH) 3, 从而造 成严重的环境污染 在多金属硫化矿床中通常都含有黄铁矿 在有水和空气的条件下 黄铁矿受硫菌的 催化作用生成的 Fe 2 (SO 4 ) 3 的 H 2 SO 4 对某些金属矿物是良好的浸出剂 15. 什么是生物固氮? 根据固氮微生物与高等植物以及其它生物的关系, 可以分为哪几 类? 把氮还原为氨的过程称为生物固氮 16. 根瘤菌与豆科植物之间的共生关系如何体现? # 效率高 # 特殊的分化形式 - 类菌体 (bacteroid) # 抗氧机制 : 豆血红蛋白 # 营养互换 # 宿主专一性 17. 结瘤过程中, 根瘤菌与豆科植物之间的分子对话过程 在根瘤中, 根瘤菌与宿主之间有氨基酸交流, 对共生固氮是必需的 类黄酮植物根瘤菌 结瘤因子根瘤菌植物 18. 什么是次级代谢? 其产物都有哪些? 次级代谢 : 相对于初级代谢而提出的一个概念 指微生物在一定的生长时期, 以初级代谢产物为前体, 合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质的过程 产物 : 次级代谢合成, 大多是分子结构比较复杂的化合物 有人把超出生理需求的过量初级代谢产物也看作是次级代谢产物根据其作用, 可分为 : 抗生素 激素 生物碱 毒素及维生素等类型 19. 试比较次级代谢与初级代谢的特点 1 存在范围及产物类型不同 2 对产生者自身的重要性不同 3 同微生物生长过程的关系明显不同 4 对环境条件变化的敏感性或遗传稳定性上明显不同

8 5 相关酶的专一性不同 6 某些机体内存在的二种既有联系又有区别的代谢类型 遗传 : 1. 证明 DNA 是遗传物质的两个经典实验 Avery 细菌转化实验 ;T2 噬菌体感染实验 2. 朊病毒的特点是什么? 结合 疯 酵母的例子, 解释 折叠密码 的生理意义 特点 : 长度 :254 aa 表达组织 : 中枢神经系统 淋巴系统 存在位置 : 细胞膜 正常 PrP C :a- 螺旋为主,b- 片层 3%, 可溶, 易消化 致病性 PrP Se : b- 片层 45-55%, 不可溶, 抗消化 150 种不同的生理条件 ( 碳源 氮源 ph 温度 酒精胁迫 金属胁迫 ) 和不同遗 传背景的酵母菌检测 PSI + 和 PSI - 的生长差异 其中有 23% 的条件中 疯酵母 PSI + 比野生酵母 PSI - 长得好 基因型相同, 只是因为蛋白质的折叠不同, 导致生命表 象的不同 3. 基因组的定义是什么? 基因组 (genome): 一个物种的单倍体的所有染色体及其所包含的遗传信息的总称 4. 原核生物基因组有哪些特点? 1) 染色体为双链环状的 DNA 分子 ( 单倍体 ); 2) 基因组上遗传信息具有连续性 ; 3) 功能相关的结构基因组成操纵子结构 ; 4) 结构基因的单拷贝及 rrna 基因的多拷贝 ; 5) 基因组的重复序列少而短 ; 5. 细胞内质粒的分子结构通常是什么? 从细胞中分离的质粒的分子结构是什么? 细胞内通常以共价闭合环状 (CCC) 的超螺旋双链 DNA 分子形式存在 ; 从细胞中分离的质粒 DNA 还会有另外两种构型 :OC 型和 L 型 6. 什么是窄宿主范围质粒 广宿主范围质粒和穿梭质粒? 窄 : 复制起点较特异, 只能在一种特定的宿主细胞内复制广 : 复制起点不特异, 可在许多种细菌内复制穿梭 : 具有两个或以上复制起点的质粒, 可在原核和真核细胞内启动复制 7. 什么是质粒的不亲和性? 不亲和是质粒与质粒之间的相斥 两种不亲和的质粒不能同时存在于一种细胞里 不亲和的分子基础是两种质粒的复制和分配机制类似, 互相竞争, 且排斥, 分裂几代以后, 其中一个质粒会丢失 8. 转座子中与转座有关的因子是什么? 转座引起的遗传效应有哪些? 除了与转座有关的基因外, 还携带某些表型基因如抗药性基因转座的遗传学效应 1 插入突变通过转座子插入突变, 进行基因定位 操纵子的极性突变

9 2 产生染色体畸变同处于一个染色体 DNA 的转座子不同拷贝之间发生同源重组, 导致两个转座子之间的宿主染色体 DNA 发生缺失或倒位, 出现染色体畸变 3 基因的移动和重排原来相距很远的基因, 有可能同处一个操纵子 ; 或者完全新的基因出现 9. 从一个菌株的基因型信息中, 判断出哪个氨基酸营养缺陷型 1966 年 M.Demerec 规则 : (1) 每一基因座位用三个小写字母表示 ; 说明这一基因的特性的一个或两 三个英文单词的前面三个字母 ; (2) 产生同一突变表型的不同基因, 加一个大写字母表示 ; (3) 同一基因的不同位点加阿拉伯数字表示 ; (4) 如果突变位点所属的基因还不确定, 大写字母用一短线代替 例子 : his 组氨酸基因 ;hisa hisb 是依次被定位的组氨酸基因 ; trp 色氨酸基因 ;trpa23 trpa46 是不同位点突变的 trpa 基因 这些基因符号在不引起误解的情况下, 也可以用来表示突变型 如果会引起误解, 就加上加号表示野生型, 减号表示突变型 10. 什么是同义突变 错义突变 无义突变 移码突变 回复突变和 suppression? 同义 : 某个碱基的变化没有改变产物的氨基酸序列的密码子的变化错义 : 碱基序列的改变引起产物氨基酸的改变无义 : 某个碱基的改变, 是代表某种氨基酸的移码 : 由于缺失或插入额外的碱基使翻译的阅读框发生改变, 从而导致从改变位置后的氨基酸序列的完全变化回复突变 : 使突变体恢复原来野生型的基因型 Suppression: 突变形中另一位点发生突变可恢复野生型表型 11. 什么是营养缺陷型 野生型和原养型? 营养缺陷性 : 缺乏合成其生存所必需的营养物的突变型, 只有从周围环境或培养基中获得营养或其前体才能生长 ; 野生型 : 没突变的 ; 原养型 : 通过重组获得和野生型一样的表型 12. 自发突变有哪些特性? 如何证明自发突变的非对应性? 1 非对应性 : 突变的发生与环境因子无对应性 2 稀有性 : 突变率定义 自发突变的突变率很低, 一般在 10-6 ~ 规律性 4 独立性 5 遗传和回复 6 可诱变性用噬菌体或药物处理过的实验组和负对照都出现了同样的突变 13. 什么是水平基因转移? 水平基因转移有哪些途径? 自然界的微生物可通过多种途径进行水平方向的基因转移, 并通过基因的重新组合以适应随时改变的环境以求生存, 称为水平基因转移 接合作用 转导 遗传转化 14. 描述发现接合作用的 Lederberg 重组实验和意外发现转导作用的 Lederberg 重组实

10 验 两株多重营养缺陷型菌株只有在混合培养后才能在基本培养及生长出原养型菌落, 而未混合的两亲菌均不能再培养基上生长, 说明长出原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致 U 型管中间隔有滤板, 只允许培养基通过而细菌不能通过, 当两株营养缺陷型菌株分别接种到两臂培养, 没有发现基因交换和重组, 从而证实了重组需要接触 转导 : 用溶源性菌沙门氏菌 LT22A 和另一株非溶源性细菌做 U 型管实验, 发现给体和受体细胞不接触的情况下, 同样出现了原样性细菌 后来经进一步的对可滤过因子的研究和比较发现了转导 15. 普遍性转导和局限性转导的主要区别是什么? 1. 被转导的基因共价的与噬菌体 DNA 连接, 与噬菌体 DNA 一起进行复制 包装以及被导入受体细胞 ; 2. 局限性转导颗粒携带特殊的染色体片段并将固定的个别基因导入受体 16. 自然转化的生理意义是什么? 几乎所有的生活细菌都可向环境中主动分泌或死亡裂解而释放 DNA, 这些 DNA 分子可与固体物结合而得到保护, 免受 DNase 的降解, 从而能长时间地存留于环境中并具有转化的活性 另一方面, 自然感受态作为许多细菌应付不利生活条件的一种调节机制, 在环境中的存在具有普遍性 17. 人工转化有哪些方法? 高浓度氯化钙处理细胞 电穿孔法 基因枪法 18. 什么是基因连锁 共转导和共转化? 基因链锁 : 两对 ( 或两对以上 ) 的等位基因位于同一对同源染色体上, 在遗传时位于同一个染色体上的不同 ( 非等位 ) 基因常常连在一起不相分离, 进入同一配子中 共转化 : 如果两个基因在染色体上是紧密连锁的, 那么他们可以同时被转化共转到 : 两个处在同一转导片段上的基因一起整合进受体染色体中 基因表达调控 : 1. 转录起始过程中依次形成哪些复合体? 闭合复合体 :Close complex 开放复合体 :Open complex 三元复合物 2. 什么是操纵子, 什么是启动子? 原核生物细胞中, 功能相关的基因组成一个操纵子, 这些基因的表达同时受统一调控 操纵子的核心元件是启动子, 它包括 RNA 聚合酶结合位点及其附近的一些顺式作用元件 3. DNA 结合蛋白质有哪些特殊结构? 它们的共同特点是什么? (1) 螺旋 - 转角 - 螺旋结构 (Helix-Turn-Helix) (2) 锌指结构 (zinc finger) (3) 亮氨酸拉链 (leucine zipper) 三种超二级结构的共同点 : (1) 识别 DNA 大沟 ; (2) 依靠 a 螺旋识别 DNA (3) 有稳定 a 螺旋的结构 4. 根据调节蛋白和诱导物作用的不同, 转录调控系统分为哪几类?

11 正控阻遏正控诱导, 负控阻遏负控诱导 5. 什么是顺式作用? 什么是反式作用? 顺式作用 : 由核酸或特定 DNA 序列影响自身基因表达活性的作用, 作用于自身 DNA 区段 (?) 反式作用 : 由调控蛋白及类似物介导的影响位于其他位置或其他 DNA 分子上的调控作用, 作用于非自身 DNA 区段 (?) 6. PTS 系统介导的葡萄糖效应如何影响乳糖操纵子的表达? 信号传递 阻遏作用 激活作用是如何进行的? 大肠杆菌中葡萄糖效应是磷酸烯醇式丙酮酸转运系统 (PTS) 介导的 两个互为独立的调控模式同时发生作用 (1)inducer exclusion 诱导物阻遏借助 LacI 介导的负控诱导系统 葡萄糖代谢的存在阻止 LacI 的诱导物进入细胞里, 使 LacI 持续阻遏 lac 操纵子的转录表达 (2)catabolite repression 分解代谢抑制借助 camp-crp 的正控诱导系统 葡萄糖代谢的存在降低体内 camp 的浓度, 使 camp-crp 复合体不能有效地激活乳糖操纵子 信号如何传递 : 葡萄糖的存在影响 PTS 系统中的磷酸基团分布, 进而影响透过酶活性和腺苷酸环化酶的活性, 引起诱导物阻遏和分解代谢抑制 阻遏 :lac 阻遏蛋白结合在染色体上 lac 操纵子转录起始的位置, 从而阻断转录起始过程 激活 : 当诱导物乳糖分子存在时, 乳糖分子与 LacI 结合, 降低其结合 DNA 能力, 从而解除阻遏 7. TrpR 介导的色氨酸操纵子的调控系统是属于哪种调控系统? 负控阻遏系统 8. 什么是弱化子? 色氨酸操纵子的弱化作用是如何调控操纵子表达? 位于转录起始位点和结构基因之间的特殊序列, 在细胞内某种氨酰 -trna 足够时表 现其终止功能. 当 trp 缺乏时,tRNA trp 也缺乏, 使前导肽不被翻译, 核糖体在两个 相邻的色氨酸密码子处停止, 不能形成茎 - 环终止子结构, 将 RNA 聚合酶放行越过先导区进入结构基因导致操纵子表达. 如果 trp 过量, 则可得到 trna trp, 使核糖体 越过色氨酸密码子的位置导致前导肽被正常翻译, 终止信号出现使转录中断 9. 二组分系统的二组分是什么? 各自有什么功能? 传感蛋白 : 自身磷酸化, 组氨酸激酶 酪氨酸激酶不一定是膜蛋白 应答调节蛋白 : 被磷酸化 / 去磷酸化, 直接参与表达调控不一定是阻遏蛋白 10. 分析大肠杆菌氮调节系统中的基因表达调控, 包含哪几种典型的调控模式? 11. 试比较 Es 70 依赖型启动子和 Es 54 依赖型启动子的转录调控的特点 Es 70 依赖型启动子 : -35/-10 保守识别序列 没有激活蛋白时, 不能形成稳定闭合复合体 闭合复合体可自发形成开放复合体 激活蛋白在近距离起作用 不需要 ATP 水解能量 a 亚基 C 末端参与激活作用

12 Es 54 依赖型启动子 24/-12 保守识别序列没有激活蛋白也能形成稳定闭合复合体 闭合复合体由激活蛋白催化形成开放复合体 激活蛋白在远距离通过 DNA 环起作用 需要 ATP 水解能量 a 亚基 C 末端不参与激活作用 12. 同属一个操纵子的两个基因表达量有显著差异是什么原因造成的? 这种表达调控属于哪种调控? 含稀有密码子多的基因表达效率低而引起的. 属于转录后调控 13. 简述细菌中 small RNA 对基因表达调控的机理 调控机理 :In cis Riboswitch / RNA thermometer 调控机理 :In trans RNA hybridization 调控机理 :In trans protein mediated 基因工程 : 1. 基因工程的基本过程是什么? 其核心技术是什么? (1) 分离或合成基因 ; (2) 通过体外重组将基因插入载体 ; (3) 将重组 DNA 导入细胞 ; (4) 筛选阳性克隆, 进行鉴定或测序 ; (5) 控制外源基因的表达 ; (6) 得到基因产物或转基因动物 转基因植物核心技术 :DNA 的特异切割,DNA 的分子克隆,DNA 的快速测序 2. 寡核苷酸指导的定点突变方法中, 使用尿嘧啶脱糖苷酶缺陷型菌株带来什么益处? 提高突变率 ( 降解模板链并以突变的产物链为模板 ) 3. 重组 PCR 定位突变的具体步骤 在需要诱变的位置合成两个带有变异碱基的互补引物, 分别与 5 引物与 3 引物作 PCR, 得到两个分别带有变异碱基的 PCR 产物. 而后退火使之彼此重叠, 在重叠部分经重组 PCR 即可得到诱变的 PCR 产物

13 4. pko3 质粒系统为例, 说明对细菌染色体进行定点突变的方法 含有突变的目标基因片段的重组质粒的构建 ; 同源重组 : 第一次交换 - 质粒整合到染色体上 ; 第二次交换 - 质粒从染色体上分离 ; ( 突变位点两侧同源序列至少保证 500bp) 筛选含有突变染色体的重组子 ( 蔗糖致死基因 sacb 来自淀粉水解芽胞杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens), 编码果聚糖蔗糖酶 ) 5. 克隆载体的基本要求是什么? 克隆载体的基本要求 : (1) 必须有独立复制功能, 要有独立的复制子 ; (2) 必须有供外源 DNA 片段插入的限制性内切酶位点, 并且这些位点位于载体复制的非必需区 ; (3) 必须有可供选择的遗传标记, 如抗生素抗性基因, 便于对阳性克隆的鉴别和筛选 6. 质粒克隆载体的优点是什么? 在大肠杆菌中稳定复制 ; 拷贝数较高, 每个细胞 25 个拷贝, 加氯霉素处理能达到 个拷贝 ; 有多种限制性内切酶有单一酶切位点 ; 可以插入 5 Kb 左右的外源片段 ; 具有两个抗生素抗性基因可以作为筛选标记 ; 容易转化 ; 安全, 不转移 7. 柯斯质粒载体与噬菌体克隆载体的共同点和不同点是什么? 同点 : 都含有来自 λ 噬菌体粘性末端的 DNA 片段即 cos 位点不同点 : 柯不形成子代噬菌体, 仅以质粒形式存在并复制 ; 噬需要有辅助噬菌体,

14 才会滚环单链复制 8. 什么是多克隆位点? 若干限制酶的单一切点 9. 什么是载体的选择标记? 原核克隆载体和真核克隆载体一般选用什么样的选择标记? 独立或与环境共同作用影响微生物生长的基因, 便于对阳性克隆进行筛选和鉴定抗生素抗性基因原核营养代谢基因真核 10. 什么是限制修饰系统? 利用限制酶降解进入细胞内的外源 DNA, 同时用甲基化酶修饰细菌本身 DNA, 以避免被酶降解 11. 什么是同尾酶 同裂酶? 同裂酶 : 来源不同, 但识别和切割序列相同 同尾酶 : 来源不同, 识别和切割序列也不相同, 但切出来的粘性末端一样 12. 克隆外源 DNA 的宿主的选用需要注意哪些方面? 宿主的基本要求与性质 (1) 能够高效吸收外源 DNA; (2) 具有使外源 DNA 进行高效复制的酶系统 ; (3) 限制修饰系统缺陷 ; (4) 重组缺陷 (RecA - ); (5) 便于进行基因操作和筛选 ; (6) 安全性, 对人 畜 农作物无致病性 13. 什么是 a 互补? 载体基因型与宿主基因型相互补, 便于筛选阳性克隆, 如 a 互补, 质粒上的 a 肽和菌株的 laczdm 举例说明利用插入失活来筛选阳性克隆? 蓝白斑法的原理. 某些载体上携带有 lac Z 基因一段序列, 其编码 β- 半乳糖苷酶的 α 肽, 而宿主细胞为 lac ZΔM15 的突变株. 当将上述载体的转化细胞培养与含有 IPTG-X-Gal 的平板中时, 由于基因内互补作用, 产生有生物活性的 β- 半乳糖苷酶, 将培养基中无色 X-Gal 分解成为半乳糖和蓝色物质使菌落呈蓝色. 如外源 DNA 插入载体上 lac Z 序列, 则会使 α 肽基因失活, 失去 α- 互补作用, 使菌落为无色. 15. 原核表达载体中, 对启动子有什么要求? 足够强, 并且是诱导型的 16. tac 启动子受何种调控?lacI q 是什么? tac 启动子,trp+lac, 受 LacI 调控,IPTG 诱导 ; 常与染色体或质粒编码的 laci q 配搭 laci q 是超表达 LacI 蛋白的突变基因 17. 用 T7 启动子表达外源蛋白的表达载体对宿主有什么要求? 染色体上有 T7 RNA 聚合酶基因 18. 除了启动子以外, 需要考虑的序列元件有哪些? 核糖体结合位点 转录终止子 密码子的偏爱性 19. 酵母表达载体都是穿梭质粒, 其上有哪些针对原核宿主和真核宿主的关键元件? 这样构建的原因是什么?

15 1 启动子诱导型启动子 :GAL PHO5 启动子激活蛋白负调节蛋白诱导物 GAL GAL4 GAL80 半乳糖 ( 激活 ) PHO5 PHO4 PHO80 无机磷 ( 抑制 ) 负调节蛋白与激活蛋白结合, 抑制激活蛋白的激活作用, 每细胞中转录产物少于 1 个 ; 当诱导信号存在时, 如有半乳糖 ( 对 GAL 启动子 ) 或缺乏无机磷 ( 对 PHO5 启动子 ), 负调节蛋白与激活蛋白分离, 激活蛋白行使激活功能, mrna 丰度能达到总 poly A mrna 的 1% 以上 组成性启动子 : mrna 丰度能达到总 poly A mrna 的 1% 以上 ADH1( 乙醇脱氢酶 I) PGK(3- 磷酸甘油酸激酶 ) 2 终止子有终止子提高 mrna 的稳定性及蛋白质表达量 3 复制子 2m 质粒复制子, 每个细胞维持 10~40 个拷贝, 不表现质粒不相容性 4 选择性标记 URA3 LEU2 HIS3 和 TRP1 宿主酵母菌必须是相应营养缺陷突变株 5 有用的蛋白结构域信号肽序列 : 可引导表达产物分泌到细胞外 ; 核定位序列 : 把表达产物转运到细胞核中 ; 抗原决定表位多肽序列 : 可用于免疫性检测和纯化 感觉粗体字是重要的原因是为了在 E.coli 中扩增, 在酵母中表达 20. 比较非融合蛋白表达和融合蛋白表达的优劣 表达非融合蛋白的优缺点优点 : 得到天然的外源蛋白 缺点 : 容易被宿主蛋白酶降解, 降低产量 融合蛋白的表达优点 : 容易高效表达 ;N 端宿主基因产物大多是宿主体内高表达蛋白质 融合蛋白在宿主细胞内比较稳定

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