实验材料

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绿刘
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1 多功能接触镜护理液对溶菌酶活性的影响孔晓牧 1, 李荷楠 1 1,2, 王月丹 1 北京大学医学部基础医学院免疫学系,(100083) 2 北京大学医学部生物医学实验教学中心病原与免疫综合实验室,(100083) immunology@bjmu.edu.cn 摘要 : 研究表明, 近期发生在新加坡和香港等地的角膜真菌感染发病率升高可能与多功能接触镜护理液对角膜免疫微环境的改变有关, 作为角膜免疫微环境的重要组成部分, 溶菌酶在其中的作用是本研究的主要内容本研究采用琼脂平板扩散法探索多功能接触镜护理液对于溶菌酶活性的影响进行研究结果表明, 护理液本身对溶壁微球菌没有杀灭作用, 同时护理液对于溶菌酶的活性没有明显的抑制作用, 而且护理液可以促进溶菌酶发挥更好的杀菌作用鉴此, 多功能接触镜护理液引起角膜免疫微环境的改变并增加眼部对于真菌的易感性可能与其影响溶菌酶的作用无关关键词 : 接触镜护理液 ; 溶菌酶 ; 琼脂平板扩散法 ; 免疫 1. 引言随着佩戴接触镜的人越来越多, 接触镜护理液的使用也越来越普及, 其中多功能接触镜护理液更以其集清洁消毒和去蛋白于一身的优越功能受到广大佩戴人群的青睐今年 2 月, 新加坡香港等地相继发生了与使用多功能接触镜护理液相关的真菌性角膜炎的事件, 有关人士认为这种疾病的发生与护理液引发的真菌耐药性增强或变异有关但是, 多功能接触镜护理液也有可能是通过改变人角膜免疫微环境而引起角膜对真菌易感性增强, 有研究表明, 多功能护理液可以显著地抑制或降低补体对靶细胞的杀伤作用泪液是角膜免疫微环境的重要组成部分, 溶菌酶 (lysozyme) 是泪液中一种主要的蛋白成分, 含量约占泪液总蛋白含量的 1/3 溶菌酶是一种 15kDa 的小分子蛋白质, 具有杀菌作用, 可以通过水解细菌胞壁质中的 N- 乙酰胞壁酸和 N- 乙酰葡萄糖胺中的 β-1,4 糖苷键 [1], 直接溶解多种革兰氏阳性 (G + ) 菌的细胞壁而有些革兰氏阴性 (G - ) 菌在抗体存在细胞壁发生破坏时, 也可以被溶菌酶溶解 [2] 目前, 市场上的接触镜护理液的除蛋白功能大部分是基于去除溶菌酶而设计的 [3] 接触镜护理液可以有效去除镜片表面的溶菌酶 [4], 那么, 接触镜护理液也可能会对泪液中的溶菌酶具有一定的作用有文献显示, 溶菌酶在镜片表面发生变性与护理液成分有关 [3] 在此, 我们对多功能接触镜护理液对溶菌酶活性的影响进行了研究与讨论 2. 材料和方法 2.1 试验菌种溶壁微球菌 (M.Lysodeikticus) 购自中国科学院微生物研究所, 菌种编号

2 2.2 培养基及多功能接触镜护理液增菌用液体培养基 : 蛋白胨 10g/L, 牛肉粉 3 g/l,nacl 5 g/l, 蒸馏水配制, 调 ph 至 7.0,121 高温高压灭菌 20min 增菌用平板培养基: 蛋白胨 10 g/l, 牛肉粉 3 g/l,nacl 5 g/l, 琼脂粉 15 g/l, 蒸馏水配制, 调 ph 至 7.0,121 高温高压灭菌 20min 平板检测培养基 : 葡萄糖 5 g/l, 蛋白胨 5 g/l, 牛肉膏 3 g/l,nacl 5 g/l, 琼脂粉 8 g/l, 蒸馏水配制, 调 ph 至 6.5,121 高温高压灭菌 20min [5] 多功能接触镜护理液: 北京博士伦眼睛护理用品公司产品 ReNu, 购自北京大明城眼镜有限公司 2.3 试验菌的培养及获得将溶壁微球菌置于增菌用液体培养基中,28 温箱中恒温培养 24h, 继代一次, 以激活冷冻干燥的菌继而将继代菌接种于增菌用平板培养基上, 置于 28 温箱中恒温培养 48h, 产生大量可供实验所用的试验菌用少量灭菌 NS 将试验菌的菌苔从平板上洗脱, 收集并离心 (1min,12000rpm), 弃上清再用灭菌 NS 洗涤 3 次, 收集菌体, 用少量灭菌 NS 制成菌液, 冷存于 4 冰箱中待用时, 再加入少量生理盐水, 吹打混匀 2.4 溶菌酶液制备及其梯度准确称取蛋清溶菌酶 (Amresco 0663, 购自北京拜尔迪生物公司 ) 2 份,16mg/ 每份其中一份用灭菌 NS 稀释为 16 mg ml -1 (2 4 mg ml -1 ) 的酶液, 室温放置 30min, 再用同样的 NS 将其倍比稀释为 :8(2 3 ) 4(2 2 ) 2(2 1 ) 1(2 0 ) 0.5(2-1 ) 0.25(2-2 ) 0.125(2-3 ) (2-4 ) (2-5 ) (2-6 ) (2-7 ) (2-8 ) (2-9 ) (2-10 ) (2-11 )mg ml -1 实验中用到了 4 mg ml -1 及以下的浓度另一份用护理液稀释为 16 mg ml -1 (2 4 mg ml -1 ) 的酶液, 室温放置 30min, 再用护理液将其倍比稀释为 :8(2 3 ) 4(2 2 ) 2(2 1 ) 1(2 0 ) 0.5(2-1 ) 0.25 (2-2 ) 0.125(2-3 ) (2-4 ) (2-5 ) (2-6 ) (2-7 ) (2-8 ) (2-9 )mg ml 测试平板的制备菌悬浮液的制备 : 将冷存的溶壁微球菌的菌液取出部分, 用适量 NS 吹打混匀成均匀的菌悬浮液测试平板的制备 : 将一定量的平板检测培养基融化, 冷却至 50~60, 将菌悬浮液以 1% 的比例加入其中, 迅速摇匀浇灌事先灭菌并置于水平台面的玻璃平皿上, 均匀摊布, 凝固后制成厚度约为 4mm 的试验菌平板测试平板打孔 : 用直径约 2mm 的已灭菌铜管打孔器在试验菌平板上打孔, 孔距为 23mm 2.6 琼脂平板扩散法分别测定两种不同方式处理的溶菌酶活力随机化 : 将所打孔编号后, 用专用统计学软件 EpiCalc 2000 进行随机分组, 抽取每种样品 (NS 和护理液分别处理并稀释后的不同浓度的溶菌酶 ) 要加的 2-3 个复孔点样 : 取样 7μL, 分别加在相应孔中, 每个稀释度 3 个复孔此外随机设有一定数目的对照孔, 包括 NS 和护理液的对照培养 : 将点样完毕的平板盖好玻璃盖, 并置于 28 温箱中, 恒温培养 20h 左右抑菌环测量 : 培养结束后, 取出平板, 用游标卡尺 ( 北京量具刃具厂产品 ) 对各个抑菌环大小分别进行测量, 精确度为 0.02 毫米, 并将每个稀释度的 2-3 个复孔求平均值 2.7 统计学分析曲线绘制 : 以抑菌圈直径平均值为横坐标, 酶浓度对数为纵坐标, 用 Excel 分别对两种方法处理过的酶进行一元线性回归得到相应直线方程 y=ax+b 和相关系数 R 统计检验 : 对 NS 和护理液处理后的溶菌酶抑菌环直径的数据进行配对 t 检验以确定所得两组数据间差异的显著性 2

3. 结果 3.1 琼脂平板扩散法测定单个浓度的经由不同处理后溶菌酶产生的抑菌环比较将经过 NS 和护理液处理后的同一浓度梯度的溶菌酶点样于同一平板, 各制作 3 个复孔, 并设有 NS 和护理液对照 NS 和护理液对照组均未产生明显的抑菌环 ( 图 1) 所有经过护理液处理后的溶菌酶的抑菌环直径都大于经过 NS 处理的溶菌酶, 抑菌环直径数据如表 1 所示图 1.

001953125 处理方式抑菌环直径 /mm 第一孔第二孔第三孔平均 NS 处理后 26.14 24.72 24.26 25.04 护理液处理后 25.82 24.62 25.28 25.24 NS 处理后 22.50 23.74 23.18 23.14 护理液处理后 23.20 23.80 22.78 23.26 NS 处理后 20.30 21.58 19.90 20.

3 3. 结果 3.1 琼脂平板扩散法测定单个浓度的经由不同处理后溶菌酶产生的抑菌环比较将经过 NS 和护理液处理后的同一浓度梯度的溶菌酶点样于同一平板, 各制作 3 个复孔, 并设有 NS 和护理液对照 NS 和护理液对照组均未产生明显的抑菌环 ( 图 1) 所有经过护理液处理后的溶菌酶的抑菌环直径都大于经过 NS 处理的溶菌酶, 抑菌环直径数据如表 1 所示图 1. 生理盐水 (NS) 及护理液对溶菌酶溶菌作用的影响左图为 NS 对溶菌酶的作用, 其中心的孔为仅加入 NS 的对照孔, 右图为护理液对溶菌酶的作用, 其中心的孔为仅加入护理液的对照孔表 1 经 NS 与护理液处理后的溶菌酶特定浓度下抑菌环大小数据溶菌酶浓度 /mg ml 处理方式抑菌环直径 /mm 第一孔第二孔第三孔平均 NS 处理后护理液处理后 NS 处理后护理液处理后 NS 处理后护理液处理后 NS 处理后护理液处理后 NS 处理后护理液处理后 NS 处理后护理液处理后琼脂平板扩散法测定分别经由浓度梯度 NS 和多功能接触镜护理液处理后的溶菌酶活性分析结果的统计学分析分别用 NS 和多功能接触镜护理液处理后的浓度梯度为 2(2 1 ) 1(2 0 ) 0.5(2-1 )

4 (2-2 ) 0.125(2-3 ) (2-4 ) (2-5 ) (2-6 ) (2-7 ) (2-8 ) (2-9 )mg ml -1 的溶菌酶随机点样于同一平板上, 各制作 2 个复孔, 并设有 NS 和护理液对照, 对照组均未产生明显的抑菌环用琼脂平板扩散法测定所得的抑菌环数据, 由此绘出溶菌酶浓度对数 - 抑菌环直径曲线如图 2 所示酶浓度对数 y = x R 2 = y = x R 2 = 抑菌环直径 /mm NS 处理后的溶菌酶护理液处理后的溶菌酶线性 (NS 处理后的溶菌酶 ) 线性 ( 护理液处理后的溶菌酶 ) 图 2 NS 与护理液分别处理后的溶菌酶浓度对数 - 抑菌环直径曲线经 NS 处理后的溶菌酶的浓度对数 - 抑菌环直径曲线拟合方程为 y=0.2058x , 相关系数 R=0.9921; 经护理液处理后的溶菌酶的浓度对数 - 抑菌环直径曲线拟合方程为 y=0.2417x , 相关系数 R= 经过护理液处理的溶菌酶产生的抑菌环直径在测量的浓度梯度范围内大于经过 NS 处理的溶菌酶产生的抑菌环直径, 但这种差异随着溶菌酶浓度的升高是逐渐减小的使用 Excel 配对 t 检验后, 得到 t 值为 , 显示两组数据具有统计学上的显著差异 4. 讨论溶菌酶是眼睛表面免疫防御机制的重要组成部分, 它在保护眼睛不受外来病原微生物感染方面发挥着至关重要的作用有文献报道, 其发挥活性最理想的条件是 ph6.0~7.0,25, 而 [6] 食盐 ( 主要成分 NaCl) 可以对其起到活化的作用在接触镜佩戴过程中, 泪液蛋白质会因为各种原因沉积于镜片表面, 其中以溶菌酶在镜片沉淀物中所占的比例较高在生理的 ph 条件下, 泪液中溶菌酶带有较多的正电荷 [7], 与带负电的镜片材料亲合力较大, 能以同源二聚体的形式沉积于镜片 [8] 接触镜护理液对镜片表面蛋白质沉淀中的溶菌酶成分有较强的去除作用 [4] 接触镜护理液可以有效去除镜片表面的溶菌酶聚合物, 而使用过程中, 其成分亦有可能使溶菌酶发生变性, 从而降低其杀菌活性 [3] 在本研究中, 发现护理液对溶菌酶的活性基本没有影响, 经过护理液处理的溶菌酶对溶壁微球菌的杀灭能力可以有轻微的促进作用这提示护理液成分可能对溶菌酶具有一定的有激活作用本研究结果表明, 多功能接触镜护理液的一些成分可能对溶菌酶的杀菌过程有辅助或激活作用, 其改变角膜免疫微环境并增加真菌感染机会的原因可能与溶菌酶的作用无关所以, 有 4

5 关多功能接触镜护理液改变角膜免疫微环境从而引发真菌性角膜炎的机制, 仍然有待于进一步的研究参考文献 [1] 楼善贤, 苗德林. 溶菌酶的研究进展. 中国肿瘤临床.1994,21(9):709~711. [2] 荣晓花, 凌沛学. 溶菌酶的研究进展. 中国生化药物杂志.1999,20(6):319~320. [3] 刘毅. 隐形眼镜镜片上的沉淀物及其相关因素. 国外医学眼科学分册.1998,22(6):333~338. [4] Jung J, Rapp J. The efficacy of hydrophilic contact lens cleaning systems in removing protein deposits. CLAO J, 1993, 19:47-9. [5] 冯惠勇, 徐亲民, 孙国志. 溶菌酶的生物测定方法研究. 食品与发酵工业.2002,28(4). [6] 贾向志, 李元, 马文煜. 溶菌酶研究进展. 生物技术通讯.2002,13(5). [7] Sack RA, Jones B, Antignani A, et al. Specificity and biological activity of the protein deposited on the hydrogel surface. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1987, 28: [8] Cheng KH, Kok JHC, van Mil C, Kijlstra A. Selective binding of a 30-kilodalton protein to disposable hydrophilic contact lenses. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1990, 31:

6 Study for the Effect of Multiple-Purpose Contact Lenses Care Solution s on Lysozyme Activity Kong XiaoMu 1 Li HeNan 1 Wang YueDan 1,2 1 Department of Immunology, School of Basic Medicine, Peking University 2 Lab for Immunology and Microbiology, BioMedical Education Center, Peking University Health Science Center Abstract To study the role of lysozyme in multiple-purpose contact lenses care solution associated mycotic keratitis, in this study, agar plate diffusion method was used to find out whether contact lenses care solution could affect the activity of lysozyme. The results showed that multiple-purpose care solution did not inhibit the activity of lysozyme. On the contrary, treatment with care solution may slightly promote the function of lysozyme. In conclusion, the multiple contact lenses care solution may not have any negative effect on lysozyme activity. Keywords: contact lenses care solution, lysozyme, agar plate diffusion method, immunity 6

材料方法

材料方法生物技术通报陆敏许黎明吴宏宇张继恩李国栋黄青山溶葡萄球菌酶是一种能高效裂解葡萄球菌细胞壁的肽链内切酶已有研究表明其能够有效预防和去除奶牛乳腺中葡萄球菌的感染但该酶在牛奶中的性质研究还缺少详细的研究数据现对重组溶葡萄球菌酶在牛奶中的一些性质进行研究检测了加入溶葡萄球菌酶后牛奶性状的变化和重组溶葡萄球菌酶在牛奶中的酶活的稳定性以及溶葡萄球菌酶在牛奶中的抑杀菌活性结果显示重组溶葡萄球菌酶未改变牛奶的外观性状