李小曼等溶菌酶与 05 二钠的协同抑菌作用优势开发利用新型天然抗菌剂是当前抗菌药物研 # 发的热点? 溶菌酶又名胞壁质酶或 ( 乙酰胞壁质聚糖水解酶是目前应用最为广泛的天然抑菌剂之一溶菌酶作为一种抑菌免疫蛋白存在于人的鼻黏液泪液唾液乳汁及部分细菌和噬菌体中溶菌酶化

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某柏
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1 89:(;9,16(:(6$65;5$.6(.$'*#(', 论著溶菌酶与.12* 二钠的协同抑菌作用李小曼王晓燕高学军北京大学口腔医学院口腔医院牙体牙髓科北京摘要目的研究溶菌酶与乙二胺四乙酸二钠 /*" )"))++)+!' %!)*05 二钠对粪肠球菌和牙髓卟啉单胞菌的协同抑菌作用方法分别培养粪肠球菌和牙髓卟啉单胞菌并调整菌液浓度至菌落形成单位 +'*'"-'"%".,: ; 配制终浓度为和 ; 的单纯溶菌酶抑菌液以及添加浓度为 ; 的 05 二钠的混合抑菌液将菌液与抑菌液作用 " 加入水溶性四唑盐 )!'*%*)'*%3$5 工作液染色酶标仪测定光密度值计算细菌活性结果单纯溶菌酶抑菌液浓度 < ; 对两种细菌的抑菌作用随溶菌酶浓度的升高而增强且对粪肠球菌的抑菌作用更显著 05 二钠与溶菌酶有协同抑菌作用与溶菌酶浓度相关溶菌酶浓度为 < ; 时 05 二钠协同溶菌酶作用于粪肠球菌可使其抑菌作用提高约 < 倍溶菌酶浓度为 < ; 时 05 二钠协同溶菌酶作用于牙髓卟啉单胞菌可使其抑菌作用提高约 < 倍当溶菌酶浓度大于 ; 时加入 05 二钠对细菌均没有明显的协同抑菌作用 E 结论对于粪肠球菌及牙髓卟啉单胞菌在溶菌酶较低浓度时 05 二钠有协同抑菌作用在溶菌酶较高浓度时 05 二钠无协同抑菌作用关键词胞壁质酶依地酸药物协同作用抗菌药中图分类号文献标志码文章编号!" '!#$&!!&$$8!.12*9" '"'"&!#""& ;6)')" 3()')" 9%%" 0&)"'-.)'*')" "''"'*' 12 ":"!$+/''*)" '!& )*'-$')'*' 4"./ ") *2+*203!&! 5')*%)/!"!+)")+)*-+!'-*!'/ /*" ) "))++)+!' %!)*05() '" + #+$# )" %&! " " #$" " #)!$ +$#)" $" " #+%*% )" )%! '.,:;5/" )" ;'-*!'&&) / '" ) )" /*!'!'*%'"!= / ;'-05()!&+*5/)+))" *!'!'/ /'%05() ")+ -' " /" )!'*%* )'*%3$5 '2 "!'*%'" )!) )" /)+'-/)+))!+)*+%*) )!%"'&+)*"!!)# ")" "/ +'&*)!&+'&/''+!$$ ) "/ &%*!'-' ;' ; '+$#)" $" " # "/ /" / +'"+")'" '-*!')!/ /!&+)*-'+$#5/)!!"!+-+'-*!' / 05()'" )")+)*)+ / +/ )!*) '/+'"+")'" '-*!'9" +$ # /)")+)*)+'-*!'/ 05())!? -'*!/)" /&%*!' /" /+'"+")'" '-*!')!? ; )" '" $" " # /)")+ )*)+'-*!'/ 05())!? -'*!/)" /&%*!' /" /+'"+")'" '-*!')!? ; 3/" /+'"+")'" '-*!')! / //)" ; 05() "'!/'!"!+-+'" /)")+)*)+E '&$','+$#)" $" " # )*' +'"+")'" '-*!'/ 05()!/'!" -+)"!"!+)")+)*)+ / *)/ / +'"+")'" '-*!'/ 05 () "' -.,/0+1 %))! +)+ 0%!"! ")+)*)"! 根管冲洗是根管预备过程中的重要环节目前临床常用的次氯酸钠与乙二胺四乙酸二钠 / *" )"))++)+!' %!)*05 二钠冲洗剂存在刺激性大易对牙本质造成损伤等不足? 因此需要寻找更为理想的根管冲洗剂天然抑菌剂来源于自然界具有生物相容性高等独特基金项目国家自然科学基金资助 $%&&' /()'")*()%)*$+"+,'%")'" '-./ ").'!&'" ")%/'!)* )"=)')"&2%!%%+" 网络出版时间 # 网络出版地址 / & +"2 "2+!)*#/*

2 李小曼等溶菌酶与 05 二钠的协同抑菌作用优势开发利用新型天然抗菌剂是当前抗菌药物研 # 发的热点? 溶菌酶 *!';@ 又名胞壁质酶或 ( 乙酰胞壁质聚糖水解酶是目前应用最为广泛的天然抑菌剂之一溶菌酶作为一种抑菌免疫蛋白存在于人的鼻黏液泪液唾液乳汁及部分细菌和噬菌体中溶菌酶化学性质稳定对热也极为稳定在 & < 的溶液中溶菌酶结构几乎不变且在 & < 范围内其活性最强在 < 范围内随着作用温度的升高酶的活性增强 () 对其活性有轻微激活作用? 溶菌酶主要通过水解细菌肽聚糖主链上的 # 糖苷键抑制细菌革兰氏阳性菌细胞壁外层为肽聚糖层因此溶菌酶对大多数革兰氏阳性菌都有较好的抑菌效果革兰氏阴性菌的肽聚糖层位于细胞内壁层其外层覆盖着大量的脂多糖因此溶菌酶对大多数革兰氏阴性菌的抑菌效果并不理想近年来研究发现可以通过加入细胞膜干扰剂如 05 乳铁蛋白乳酸等与细胞表面的脂多糖之间盐桥二价阳离子螯合使细菌的细胞膜失去稳定性? 从而调节部分细菌对溶菌酶的耐受性本研究选取难治性根尖周炎中最常检出的革兰氏阳性菌粪肠球菌 + # 和革兰氏阴性菌牙髓卟啉单胞菌 %&! " " # 作为实验菌株配制不同浓度的溶菌酶和 05 二钠混合抑菌液观察 05 二钠与溶菌酶对粪肠球菌和牙髓卟啉单胞菌的协同抑菌作用材料与方法菌种与试剂实验菌种与试剂包括粪肠球菌 5.. 首都医科大学口腔医学院赠送牙髓卟啉单胞菌 5..# 北京中原公司蛋清溶菌酶高铁血红素维生素美国 $ ) 公司 05 二钠美国!+' 公司脑心浸液培养基 )" /) "-%!'"46 美国 40 公司胰蛋白胨大豆肉汤培养液 &+!''/5$4 琼脂酵母提取物英国 9=' 公司新鲜羊血中国北京动物饲养场微生物活性检测试剂盒 3$5# 日本同仁公司抑菌药液配制用去离子水配制终浓度分别为和 ; 的单纯溶菌酶抑菌液采用析因设计配制混合抑菌液用去离子水配制溶菌酶终浓度分别为 ; 共个水平与 05 二钠终浓度分别为 ; 共 # 个水平的种混合抑菌液过滤除菌封口待用细菌复苏及培养粪肠球菌的复苏及培养取冻存的粪肠球菌菌株蘸取菌液划线接种于含 ;46 和 ; 琼脂的培养皿中孵育 # / 后挑取乳白色单克隆菌落置于 46 浓度为 ; 培养液中扩增传代进行抑菌实验前调整稀释菌液浓度至.,:;.,:+'*'"-'"%" 菌落形成单位牙髓卟啉单胞菌的复苏及培养取冻存的牙髓卟啉单胞菌菌株加入含 ;5$4 ; 酵母提取物 ; 维生素和 ; 氯化血红素的培养液中使菌株溶解并涂布于血平皿含 ; 5$4 ; 酵母提取物 ; 琼脂 ;; 羊血 ; 维生素和 ; 氯化血红素上使用厌氧产气系统英国 0'" 3/ *$+"+ 公司制造厌氧环境孵育 # / 后挑取黑色单克隆菌落置于 5$4 培养液中扩增传代进行抑菌实验前调整稀释菌液浓度至.,:; 水溶性四唑盐染色法测定抑菌作用取 ; 抑菌液与 ; 菌液在孔板中混合并于培养箱内作用 " 分别配制革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌水溶性四唑盐 )!'*%* )'*%3$5 工作液并各孔加入 ; 进行染色培养箱内作用 # " 酶标仪 *= 美国 4' 52 公司测定各样本 # " 检测波长及 " 参比波长处的光密度值 * 同时将 ; 去离子水与 ; 菌液混合作为阴性对照组加入 3$5 工作液测定 * 值每组抑菌液均重复次细菌活性 ) * F* = * 其中 * = 为实验组 * # "?* " * 为阴性对照组 * # "? * " 数据处理与统计所有数据的统计分析由 $1$$ 软件完成采用双因素多水平析因设计资料的方差分析对溶菌酶和 05 二钠的交互作用进行统计分析并使用单因素方差分析 9")(9 5%2 检测方法进行多组间两两比较为差异有统计学意义结果单纯溶菌酶对粪肠球菌和牙髓卟啉单胞菌的抑菌作用单纯溶菌酶抑菌液浓度在 < ; 时对

3 # 89:(;9,16(:(6$65;5$.6(.$'*#(', 两种细菌的抑菌作用随溶菌酶浓度的升高而增强同一浓度溶菌酶对粪肠球菌的抑菌作用显著高于牙髓卟啉单胞菌当溶菌酶浓度大于 ; 时达到对粪肠球菌的最大抑菌能力当溶菌酶浓度小于 ; 时对牙髓卟啉单胞菌几乎无抑菌能力图图单纯溶菌酶溶液对两种细菌的抑菌作用 #!5/)")+)*) *'-&%*!'!'*%'" ' +$#)" $" " # 不同配比混合抑菌液对粪肠球菌的抑菌作用同浓度配比溶菌酶 05 二钠混合抑菌液对粪肠球菌的抑菌作用见图双因素多水平析因设计资料的方差分析结果显示 05 二钠与溶菌酶存在交互作用 05 二钠与溶菌酶交互项 F # 进一步固定溶菌酶浓度水平运用单因素方差分析得出 05 二钠可促进溶菌酶抑制粪肠球菌且与溶菌酶浓度相关溶菌酶浓度为 < ; 时加入 05 二钠对粪肠球菌有协同抑制作用可使其抑菌作用提高约 < 倍当溶菌酶浓度大于 ; 时加入 05 二钠没有明显的协同抑制作用 E ;05 二钠与 ;05 二钠所产生的协同抑菌作用在各组中差异均没有统计学意义 E 但与 ;05 二钠所产生的协同抑菌作用在溶菌酶 < ; 各组中差异均有统计学意义 $ ;05'%& K $ ;05'%& 图混合抑菌液对粪肠球菌的抑菌作用 #!5/)")+)*) *'-*!')" 05()!'*%'" '+$# 不同配比浓度药液对牙髓卟啉单胞菌的抑菌作用不同浓度配比溶菌酶 05 二钠混合抑菌液对牙髓卟啉单胞菌的抑菌作用见图双因素多水平析因设计资料的方差分析结果显示 05 二钠与溶菌酶存在交互作用 05 二钠与溶菌酶交互项 F 进一步固定溶菌酶浓度水平运用单因素方差分析得出 05 二钠可促进溶菌酶抑制牙髓卟啉单胞菌且与溶菌酶浓度相关溶菌酶浓度为 < ; 时加入 05 二钠可对牙髓卟啉单胞菌起到协同抑制作用可使其抑菌作用提高约 < 倍当溶菌酶浓度大于 ; 时加入 05 二钠没有明显的协同抑制作用 E ;05 二钠与 ; 05 二钠所产生的协同抑菌作用在各组中差异均无统计学意义 E 但与 ;05 二钠所产生的协同抑菌作用在溶菌酶 ; 组中差异有统计学意义讨论本研究选用了生物相容性好易分解对组织无刺激的天然抑菌剂溶菌酶探讨其对于根管内粪肠球菌革兰氏阳性菌以及牙髓卟啉单胞菌革兰氏阴性菌的抑菌作用结果表明单纯溶菌酶抑菌液在一定浓度范围内 < ; 均可抑制两种细菌的生长并且随着溶菌酶浓度增高其抑菌作用

4 李小曼等溶菌酶与 05 二钠的协同抑菌作用增强相同浓度溶菌酶对于粪肠球菌的抑菌作用更加明显溶菌酶对粪肠球菌和牙髓卟啉单胞菌作用效果的差异与两类细菌菌壁构造差异有关粪肠球菌作为革兰氏阳性菌其细胞壁外层含有 # 层肽聚糖层因此溶菌酶对其有较好的抑菌效果而牙髓卟啉单胞菌作为革兰氏阴性菌其肽聚糖层位于细胞内壁层其外层覆盖着大量的不对称双分子层脂多糖使得溶菌酶难以作用于肽聚糖层而且存在部分肽聚糖层的修饰因此溶菌酶对其抑菌效果不理想 # $ ;05'%& K $ ;05'%& 图混合抑菌液对牙髓卟啉单胞菌的抑菌作用 #!5/)")+)*) *'-*!')" 05()!'*%'" '$" " # 对于提高溶菌酶抑菌能力的研究表明可通过改变溶菌酶的构象如对酶干热变性处理利用还原剂还原二硫键将酶水解成小分子多肽段等方法使处理后的溶菌酶易于穿透细胞壁进入细胞而发挥抑菌活性运用超高压匀质等物理方法处理细胞使细胞形态发生变化减小外膜阻碍力便于溶菌酶进入肽聚糖层添加其他化学物质与溶菌酶协同作用提高溶菌酶的抑菌活性如 05 二钠乳铁蛋白等? 本研究还探讨了不同配比浓度的溶菌酶 05 二钠混合抑菌液对于两种细菌的抑制作用结果表明在溶菌酶浓度较低时添加 05 二钠可显著增强溶菌酶的抑菌能力其他研究已证实 05 二钠通过螯合作用可去除细胞膜表面的阳离子如.) () 等从而影响膜表面酶的活性激活及膜局部的完整性破坏细胞膜的结构和功能利于溶菌酶的渗入尤其对于革兰氏阴性菌来说 05 二钠还可以溶出细胞表面的一部分脂多糖片段促进磷脂迁移到外膜的外层磷脂取代丢失的脂多糖磷脂的失去进一步导致脂质从质膜转运以补充磷脂从而使细胞膜变得不稳定? 本研究结果还显示在溶菌酶浓度较高时添加 05 二钠并不能够起到协同增强溶菌酶的抑菌作用可能是因为一方面高浓度溶菌酶已具有较强的抑菌能力 05 二钠的协同作用不明显另一方面 05 二钠的螯合作用需要适宜的离子质子强度及匹配的结合位点与电化学构象等较高浓度的溶菌酶一定程度上不利于 05 二钠与细胞膜充分地接触和作用从而削弱了其协同抑菌能力本研究结果显示 05 二钠协同溶菌酶作用于革兰氏阳性菌粪肠球菌可使其抑菌作用提高 < 倍尤其是当溶菌酶浓度较低时其他学者也证实溶菌酶 05 二钠对李斯特菌,! &' 粪肠球菌魏斯氏菌 -# " 有明显的协同抑菌作用本实验观察了溶菌酶 05 二钠对革兰氏阴性菌牙髓卟啉单胞菌的协同抑菌作用研究结果表明溶菌酶浓度较低时 05 对牙髓卟啉单胞菌的协同抑制作用最高可增强约 < 倍但总体抑菌作用较弱仅可抑制约 7 <#7 的细菌生长对于革兰氏阴性菌已有研究表明溶菌酶 05 二钠的协同抑菌作用与菌种和培养条件有关? 另外有学者报告溶菌酶 05 二钠在营养丰富条件下对乳酸杆菌,# 李斯特菌金黄色葡萄球菌.%&# 等革兰氏阳性菌无协同作用各学者所得结论的差异可能与不同细菌细胞外膜或脂多糖层结构及修饰程度不同有关也可能与实验时选用的细菌所处生长状态不同存在一定关系综上所述本研究结果表明对于粪肠球菌及牙

5 89:(;9,16(:(6$65;5$.6(.$'*#(', 髓卟啉单胞菌溶菌酶浓度较高时的抑菌作用较强 05 二钠无显著的协同抑菌作用溶菌酶浓度较低时 05 二钠有显著的协同抑菌作用但对牙髓卟啉单胞菌的总体抑菌作用较弱对粪肠球菌的总体抑菌作用较强参考文献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尹金凤史锋王小元蛋清溶菌酶与渗透剂对大肠杆菌的协同抑菌作用 8 食品科学? ' "'"+), 6!)* )* /*" )" ))+))" *!' &'!)"+' )*)+!'-'' )"!-" ))"!+%% #9 81'%*$+ #?## # 收稿本文编辑赵波

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材料方法生物技术通报陆敏许黎明吴宏宇张继恩李国栋黄青山溶葡萄球菌酶是一种能高效裂解葡萄球菌细胞壁的肽链内切酶已有研究表明其能够有效预防和去除奶牛乳腺中葡萄球菌的感染但该酶在牛奶中的性质研究还缺少详细的研究数据现对重组溶葡萄球菌酶在牛奶中的一些性质进行研究检测了加入溶葡萄球菌酶后牛奶性状的变化和重组溶葡萄球菌酶在牛奶中的酶活的稳定性以及溶葡萄球菌酶在牛奶中的抑杀菌活性结果显示重组溶葡萄球菌酶未改变牛奶的外观性状