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1 第 42 卷第 3 期 2015 年 北京化工大学学报 ( 自然科学版 ) Journal of Beijing University of Chemical Technology ( Natural Science) Vol. 42, No 辅酶 A 依赖的丙醛脱氢酶基因的克隆 表达及其对宿主菌生长的影响 * 范如婷摇赵摇鹏摇田平芳 ( 北京化工大学生命科学与技术学院, 北京摇 ) 摘摇要 : 辅酶 A 依赖的丙醛脱氢酶 (PduP) 是以甘油为底物催化合成聚 3 鄄羟基丙酸的关键酶 本研究从鼠伤寒沙门氏菌基因组中 PCR 扩增了 pdup 基因, 构建表达载体后转化肺炎克雷伯氏菌, 得到重组菌 K. p( pet 鄄 pk 鄄 pdup) SDS -PAGE 显示 PduP 实现了高效表达 生长曲线表明重组菌延迟进入平稳期, 生物量较空质粒对照菌提高了 24 郾 68%,1,3 鄄丙二醇和 2,3 鄄丁二醇的产量分别达到 16 郾 58 g / L 和 15 郾 68 g / L, 甘油转化率比空质粒对照菌和原代菌分别提高了 40 郾 62% 和 34 郾 02% 上述结果表明, 过表达 pdup 重排了代谢流量, 促进了菌体生长 关键词 : 丙醛脱氢酶 ; 鼠伤寒沙门氏菌 ; 肺炎克雷伯氏菌 ; 生物量 ; 甘油中图分类号 : Q933 引摇 言 1 摇实验部分 聚 3 鄄羟基丙酸 (P[3HP]) 是生物相容性良好的 可降解新材料 [1] 在生物体内以甘油为底物催化 合成 P[3HP] 涉及 3 个关键酶 : 甘油脱水酶 辅酶 A 依赖的丙醛脱氢酶 ( PduP) 以及聚羟基脂肪酸合成 酶 [2] 肺炎克雷伯氏菌不仅含有天然的甘油歧化 途径, 而且存在刚性的 dha 调节子 [3], 能够协调甘 油的氧化和还原代谢 [4], 是构建 P[3HP] 工程菌的 理想宿主菌 甘油代谢的中间产物 3 鄄羟基丙醛具 有毒性, 能引起细胞死亡, 因此在很大程度上制约着 生物量和目的产物的积累 [5] PduP 可高效转化 3 鄄 羟基丙醛生成 3 鄄羟基丙酰辅酶 A [6], 接下来参与胞 内三羧酸循环 丙酸 茁鄄丙氨酸 聚羟基脂肪酸等代 谢过程, 除此之外, 在某些生物体内还有碳固定的作 用 [7] 迄今约有 47 种辅酶 A 依赖的丙醛脱氢酶, 来源于不同的微生物 本实验克隆了来自鼠伤寒沙 门氏菌 ( Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2) 的 pdup 基因 [8], 并在肺炎克雷伯氏菌中高效 表达, 研究 PduP 对宿主菌生长和代谢流量的影响, 为今后构建 P[3HP] 高产菌株奠定基础 1 郾 1 摇材料 1 郾 1 郾 1 摇菌株与载体 肺炎克雷伯氏菌 ( Klebsiella pneumoniae MGH78578), 中国科学院微生物所菌种保藏中心 ; 鼠伤寒沙门氏菌 LT2(Salmonella enterica serovar Ty 鄄 phimurium LT2), 美国模式培养物集存库 ( ATCC); 质粒载体 pet 鄄 pk 为本实验室保存 ( 用肺炎克雷伯氏 菌中甘油脱水酶基因 dhab 的启动子 pk 替换 pet 鄄 28a 原有 T7 启动子 ); 大肠杆菌感受态细胞 DH5 琢, 博迈德生物技术有限公司 1 郾 1 郾 2 摇主要试剂 限制性核酸内切酶 T4 DNA 连接酶,New Eng 鄄 land Biolabs (Beijing) 有限公司 ;DNA 分子量 Mark 鄄 er 蛋白质分子量 Marker, 大连宝生物工程有限公 司 ;DNA 聚合酶 高纯质粒小提试剂盒和 PCR 产物 回收试剂盒, 博迈德生物技术有限公司 ; 其余试剂为 国产分析纯 1 郾 1 郾 3 摇培养基 LB(Luria 鄄 Bertani) 培养基 ( g / L): 胰蛋白胨 10, NaCl 10, 酵母提取物 5 固体培养基需加琼脂至终收稿日期 : 浓度 15 g / L 抗生素培养基需加入硫酸卡那霉素至基金项目 : 国家自然科学基金 ( / ) 第一作者 : 女,1990 年生, 硕士生终浓度 50 滋 g / L * 通讯联系人基本发酵培养基 ( g / L): ( NH 4 ) 2 SO 4,4 郾 0; K 2 E 鄄 mail: tianpf@ mail. buct. edu. cn HPO 4 3H 2 O,3 郾 4;MgSO 4 7H 2 O,0 郾 5;KH 2 PO 4,1 郾 3;
2 78 北京化工大学学报 ( 自然科学版 ) 摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇 2015 年 CaCO 3,0 郾 1; 酵母提取物,3 郾 0; 甘油,40; 微量元素, 1 郾 25 ml / L 微量元素 (g / L):MnCl 2 4H 2 O 0 郾 1,ZnCl 2 0 郾 07, NiCl 2 6H 2 O 0 郾 025, FeSO 4 7H 2 O 1, CoCl 2 2H 2 O 0 郾 2,CuCl 2 2H 2 O 0 郾 02,Na 2 MoO 4 2H 2 O 0 郾 035, 硼酸 0 郾 06, 饱和盐酸 4 ml / L 1 郾 2 摇实验方法 1 郾 2 郾 1 摇培养条件菌种活化 :15 mm 伊 150 mm 试管装 4 ml LB 液体培养基, 接种量为 1% ( 体积分数 ),37 益 200 r / min, 震荡培养 12 h 摇瓶发酵 :250 ml 锥形瓶装基本发酵培养基 100 ml, 棉塞封口, 接种量为 1% ( 体积分数 ),37 益 150 r / min 震荡培养 24 h, 每 3 h 取样测定 1 郾 2 郾 2 摇目的基因 pdup 的扩增根据 GenBank 公布的 S. enterica serovar Typhi 鄄 murium LT2 辅酶 A 依赖的丙醛脱氢酶基因 ( pdup) 序列设计引物, 以 S. enterica serovar Typhimurium LT2 基因组 DNA 为模板, 进行聚合酶链式反应, 扩增其基因 pdup 上 下游引物酶切位点分别为 EcoR I Hind III, 以下划线部分标注 ( 见表 1) 表 1 摇引物序列 Table 1 摇 Primer sequences 编号序列 P1 5 忆 GAGTACCG GAATTCATGAATACTTCTGAACTCGACCT 3 忆 P2 5 忆 CCC AAGCTTGAGTACCTTCTCTTAGCGAATAGAACGT 3 忆 摇摇 PCR 反应参数 :94 益, 4 min;94 益, 1 min,58 益, 40 s,72 益, 90 s, 重复 30 个循环 ;72 益, 10 min; 16 益保存 1 郾 2 郾 3 摇重组菌 K. p(pet 鄄 pk 鄄 pdup) 的构建用 PCR 产物回收试剂盒纯化回收基因 pdup, 用试剂盒提取质粒 pet 鄄 pk, 二者分别于 37 益以 EcoR 砖和 Hind III 同时酶切 2 h, 之后 65 益 10 min 失活 T4 DNA 连接酶 16 益连接 1 h, 连接液转化感受态细胞 E. coli DH5 琢, 涂布含有硫酸卡那霉素的固体平板筛选阳性克隆 挑取单菌落培养并提取质粒进行双酶切鉴定, 将重组质粒 pet 鄄 pk 鄄 pdup 电转化 K. pneu 鄄 moniae 获得重组菌 K. p(pet 鄄 pk 鄄 pdup) 1 郾 2 郾 4 摇重组菌的发酵将重组菌 K. p( pet 鄄 pk 鄄 pdup) 进行发酵, 以 K. pneumoniae 野生菌 ( K. p1st) 和含有空质粒 pet 鄄 pk 的 K. pneumoniae( K. p( pet 鄄 pk)) 为对照组 将 3 株菌在 LB 培养基中活化, 之后转接基本发酵培养基, 每 3 h 取样测吸光度 OD 600 绘制生长曲线, 测定甘油剩余量 1,3 鄄丙二醇和 2,3 鄄丁二醇产量, 并于 24 h 取样做 SDS 鄄 PAGE 测定 PduP 酶活以分析蛋白表达情况 1 郾 2 郾 5 摇 PduP 酶活测定方法取 24 h 发酵液 10 ml,12000 r / min 离心收集菌体, 用 5 ml PBS 缓冲液 ( ph7 郾 0) 重悬菌体, 超声破碎细胞, 工作条件为 80 W, 工作 3 s, 间隔 2 s, 循环 80 次, 即得粗酶液 酶活反应体系为 2 ml, 包括 150 mmol / L 正丙醛 200 滋 L,20 mmol / L NAD 滋 L, 粗酶液 200 滋 L,26 mmol / L 辅酶 A 200 滋 L,PBS 缓冲液 (ph7 郾 0)1 郾 2 ml 37 益水浴 5 min, 通过检测 340 nm 处吸光值的增量来确定反应体系中 NADH 的生成量 酶活单位定义 :37 益下, 每 min 催化生成 1 滋 mol NADH 的酶量即为一个酶活力单位 之后用 5 ml 考马斯亮蓝 G250 试剂标定 200 滋 L 粗酶液中的总蛋白含量, 得到重组酶的比活力 2 摇结果与讨论 2 郾 1 摇重组菌 K. p(pet 鄄 pk 鄄 pdup) 的构建以 S. enterica serovar Typhimurium LT2 基因组 DNA 为模板, 利用引物 PCR 扩增 pdup 基因, 在接近 1500 bp 附近有条带 ( 如图 1a), 与目的基因 pdup (1395 bp) 的大小相同 基因片段与质粒载体酶切连接后转化感受态细胞 E. coli DH5 琢, 抗性平板涂布后, 挑取 14 个单菌落进行菌落 PCR 鉴定, 对鉴定结果正确的 5 个单菌落培养保存, 提取质粒双酶切鉴定, 得到质粒载体 ( 约 5500 bp) 和 pdup 基因 ( 约 1500 bp), 表明重组质粒 pet 鄄 pk 鄄 pdup 构建成功 ( 如图 1b) 将重组质粒电转化 K. pneumoniae 获得重组菌 K. p ( pet 鄄 pk 鄄 pdup) 2 郾 2 摇重组菌蛋白表达及 PduP 酶活重组菌 K. p(pet 鄄 pk 鄄 pdup) 对照菌 K. p1st( 野生菌 ) 和 K. p( pet 鄄 pk) 的蛋白表达情况如图 2 所示 SDS 鄄 PAGE 表明, 重组菌辅酶 A 依赖的丙醛脱氢酶 ( PduP) 得到了高效表达, 大小为 51 郾 43 KDa 为进一步考察重组酶的表达情况, 对重组菌和对照菌进行了 PduP 的酶活测定, 结果如图 3 所示 重组菌 24 h PduP 酶活力相比于野生菌和空质 粒对照菌分别提高了 7 郾 58 倍和 5 郾 31 倍, 酶活数据
3 第 3 期摇摇摇摇摇摇范如婷等 : 辅酶 A 依赖的丙醛脱氢酶基因的克隆 表达及其对宿主菌生长的影响 79 M DNA 分子量标记 ( DL2000);pduP PCR 产物 ;1 5 双酶切鉴定 图 1 摇基因 pdup 与重组质粒 pet 鄄 pk 鄄 pdup 双酶切电泳图 Fig. 1 摇 Electrophoretograms of pdup and digested pet 鄄 pk 鄄 pdup M 蛋白质 Marker; 1 重组菌 K. p(pet 鄄 pk 鄄 pdup); 2 对照菌 K. p(pet 鄄 pk); 3 野生菌 K. p1st 图 2 摇重组菌与对照菌的 SDS 鄄 PAGE 图 Fig. 2 摇 SDS 鄄 PAGE analysis of protein expression in recombinant strains 图 3 摇重组菌和对照菌 PduP 酶活 Fig. 3 摇 PduP activity of different strains 证明重组菌 PduP 蛋白确实高效表达且具有生物活性 2 郾 3 摇重组菌的生长情况为考察 PduP 的过表达对宿主菌生长代谢的影响, 将重组菌和对照菌分别进行 24 h 发酵, 测定菌体浓度 重组菌 K. p ( pet 鄄 pk 鄄 pdup), 对照菌 K. p1st K. p(pet 鄄 pk) 的生长曲线如图 4 所示 重组菌 K. p( pet 鄄 pk 鄄 pdup) 的生物量与原代菌 (K. p1st) 基本持平, 但相比于带有空质粒载体的对 图 4 摇重组菌的生长曲线 Fig. 4 摇 Growth curves of recombinant strains 照菌却增长很多, 并且相对较晚进入平稳期,9 h 以后, 生物量比空质粒对照菌提高约 24 郾 68% 对照菌 K. p( pet 鄄 pk) 与重组菌 K. p( pet 鄄 pk 鄄 pdup) 相比, 后者由于过表达 pdup 基因, 且 PduP 酶活性较高, 在一定程度上能高效转化 3 鄄羟基丙醛 ( 具有细胞毒性 ), 降低了细胞毒性, 推测是菌体生物量提高的原因之一 2 郾 4 摇重组菌甘油消耗及代谢产物对重组菌 K. p(pet 鄄 pk 鄄 pdup) 对照菌 K. p1st K. p(pet 鄄 pk) 进行发酵, 每 3 h 取样, 气相色谱检测甘油 1,3 鄄丙二醇 2,3 鄄丁二醇含量, 如图 5 所示 重组菌甘油消耗量介于野生菌和携带空质粒对照菌之间, 相差不大 发酵后期 1,3 鄄丙二醇和 2,3 鄄丁二醇的产量分别达到 16 郾 58 g / L 和 15 郾 68 g / L, 均超过空质粒对照菌, 甚至超过野生菌 ; 甘油总转化率分别比空质粒对照菌和野生菌提高了 40 郾 62% 和 34 郾 02% 在肺炎克雷伯氏菌中, 甘油经氧化代谢首先生成丙酮酸进而转化为 2,3 鄄丁二醇 ; 甘油的还原代谢产物则为 1,3 鄄丙二醇和 3 鄄羟基丙酰辅酶 A 由于具有天然的刚性 dha 调节子 [3,9], 甘油的氧化还原代 [10 - 谢应保持相对平衡 11] 过表达 pdup 基因增强了甘油还原途径的代谢流量, 同时 2,3 鄄丁二醇产量也有较大提高, 说明在 dha 调节子作用下, 氧化途径也 [12 - 得到了相应增强 13], 从而促进胞内能量和物质代谢, 是生物量提高的另一重要因素 3 摇结论 (1) 用 PCR 方法克隆了鼠伤寒沙门氏菌的 pdup 基因, 构建重组载体后转化肺炎克雷伯氏菌并成功表达 (2) 与携带空质粒的对照菌相比, 过表达 PduP
4 80 北京化工大学学报 ( 自然科学版 ) 摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇 2015 年 [2] 摇 Andree 茁 en B, Lange A B, Robenek H, et al. Conversion of glycerol to poly (3 鄄 hydroxypropionate) in recombinant Escherichia coli[j]. Applied and Environmental Microbi 鄄 ology, 2010, 76(2): [3] 摇 Zheng P, Wereath K, Sun J, et al. Overexpression of genes of the dha regulon and its effects on cell growth, glycerol fermentation to 1, 3 鄄 propanediol and plasmid sta 鄄 bility in Klebsiella pneumoniae [ J]. Process Biochemis 鄄 try, 2006, 41(10): [4] 摇 Wei D, Wang M, Jiang B, et al. Role of dihydroxyace 鄄 tone kinases I and II in the dha regulon of Klebsiella pneu 鄄 moniae[ J]. Journal of Biotechnology, 2014, 177: [5] 摇 Luo L H, Kim C H, Heo S Y, et al. Production of 3 鄄 hydroxypropionic acid through propionaldehyde dehydro 鄄 genase PduP mediated biosynthetic pathway in Klebsiella pneumoniae [ J ]. Bioresource Technology, 2012, 103 (1): 1-6. [6] 摇 Sabet 鄄 Azad R, Linares 鄄 Past 佴 n J A, Torkelson L, et al. Coenzyme A 鄄 acylating propionaldehyde dehydrogenase (PduP) from Lactobacillus reuteri: Kinetic characteriza 鄄 tion and molecular modeling[ J]. Enzyme and Microbial Technology, 2013, 53(4): [7] 摇 Teufel R, Kung J W, Kockelkorn D, et al. 3 鄄 hydroxypropionyl 鄄 coenzyme A dehydratase and acryloyl 鄄 coenzyme A reductase, enzymes of the autotrophic 3 鄄 hydroxypropionate / 4 鄄 hydroxybutyrate cycle in the Sul 鄄 folobales[ J]. Journal of Bacteriology, 2009, 191 (14): [8] 摇 Leal N A, Havemann G D, Bobik T A. PduP is a coen 鄄 图 5 摇 甘油剩余及主要代谢产物产量 zyme 鄄 a 鄄 acylating propionaldehyde dehydrogenase associat 鄄 Fig. 5 摇 Glycerol residue and major metabolite production ed with the polyhedral bodies involved in B 12 鄄 dependent 的重组菌较晚进入平稳期, 生物量提高了 24 郾 68%, 1, 2 鄄 propanediol degradation by Salmonella enterica sero 鄄 与野生菌基本持平 表明 PduP 的过表达不会对宿 var Typhimurium LT2 [ J ]. Archives of Microbiology, 主菌生长造成负荷 2003, 180(5): (3) 发酵后期重组菌 1,3 鄄丙二醇和 2,3 鄄丁二醇产量分别达到 16 郾 58 g / L 和 15 郾 68 g / L, 均超过空质粒对照菌, 甘油转化率分别比空质粒对照菌和野生 [9] 摇 Maervoet V E T, De Maeseneire S L, Soetaert W K, et al. Unraveling the dha cluster in Citrobacter werkmanii: comparative genomic analysis of bacterial 1, 3 鄄 propane 鄄 diol biosynthesis clusters[ J]. Bioprocess and Biosystems 菌提高了 40 郾 62% 和 34 郾 02%, 表明在 dha 调节子作 Engineering, 2014, 37(4): 用下, 甘油氧化还原途径的代谢流量得到了重排 [10] Sun J, van den Heuvel J, Soucaille P, et al. Comparative genomic analysis of dha regulon and related genes for an 鄄 参考文献 : aerobic glycerol metabolism in bacteria [ J]. Biotechnology [1] 摇 Wang Q, Yang P, Liu C, et al. Biosynthesis of poly (3 鄄 hydroxypropionate) from glycerol by recombinant Esche 鄄 richia coli[ J]. Bioresource Technology, 2013, 131: Progress, 2003, 19(2): [11] Dobson R, Gray V, Rumbold K. Microbial utilization of crude glycerol for the production of value 鄄 added products 551. [ J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology,
5 第 3 期摇摇摇摇摇摇范如婷等 : 辅酶 A 依赖的丙醛脱氢酶基因的克隆 表达及其对宿主菌生长的影响 , 39(2): [12] Ashok S, Raj S M, Ko Y, et al. Effect of puuc overex 鄄 pression and nitrate addition on glycerol metabolism and anaerobic 3 鄄 hydroxypropionic acid production in recombi 鄄 nant Klebsiella pneumoniae 驻 glpk 驻 dhat [ J]. Metabolic Engineering, 2013, 15: [13] Kumar V, Sankaranarayanan M, Jae K, et al. Co 鄄 pro 鄄 duction of 3 鄄 hydroxypropionic acid and 1, 3 鄄 propanediol from glycerol using resting cells of recombinant Klebsiella pneumoniae J2B strain overexpressing aldehyde dehydro 鄄 genase [ J ]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 96(2): Cloning and expression of CoA 鄄 dependent propionaldehyde dehydrogenase in Klebsiella pneumoniae and its influences on cell growth FAN RuTing 摇 ZHAO Peng 摇 TIAN PingFang * ( College of Life Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology, Beijing , China) Abstract: CoA 鄄 dependent propionaldehyde dehydrogenase (PduP) is a key enzyme in glycerol 鄄 based biosynthesis of poly 鄄 3 鄄 hydroxypropionic acid. In this study, the pdup gene from Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2 was amplified by the polymerase chain reaction (PCR) and cloned into Klebsiella pneumoniae, resulting in a recom 鄄 binant strain named K. p(pet 鄄 pk 鄄 pdup). Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS 鄄 PAGE) analysis showed a high level of PduP expression. In contrast to the control strain K. p(pet 鄄 pk) which harbored an empty vector pet 鄄 pk, the strain K. p(pet 鄄 pk 鄄 pdup) entered a stationary phase later and the biomass increased by 24 郾 68% after fermentation for 24 h. Moreover, this recombinant strain produced 1,3 鄄 propanediol at a concentration of 16 郾 58 g / L and 2,3 鄄 butanediol at a concentration of 15 郾 68 g / L. Compared with K. p(pet 鄄 pk) and wild type, the total glycerol conversion rate of K. p ( pet 鄄 pk 鄄 pdup) increased by 40 郾 62% and 34 郾 02%, respectively. Overall these results indicate that the PduP overexpression reallocated the metabolic flux and thus stimulated cell growth. Key words: propionaldehyde dehydrogenase; Salmonella enterica serovar Typhimurium; Klebsiella pneumoniae; bi 鄄 omass; glycerol
材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析
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