研究论文 7b lentiviral vector and Anti-rno-miR-let-7b Inhibitor vector were transfected into rat bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. The experime

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岩窦
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1 8-6-7 :: 中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 8, (7): DOI:.8/cjcb mir-let-7b 慢病毒载体促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化周雪颖李双月曲淑贤曲宴慧邵颖孙经淞 * 朴丰源 * ( 大连医科大学公共卫生学院, 大连 6; 大连医科大学肿瘤干细胞研究院, 大连 6; 大连医科大学附属第二医院, 大连 6; 大连医科大学附属第一医院, 大连 6) 摘要微小 RNA 在生命体生长衰老的过程中起着重要的作用, 参与骨髓间充质干细胞 (MSCs) 重要的生物学进程, 包括增殖分化信号转导和死亡等该文探讨了 mir-let-7b 对 MSCs 来源神经细胞的调控作用体外分离扩增大鼠 MSCs, 通过细胞形态学观察表面标志物的流式细胞仪检测进行鉴定将 MSCs 分为组组和对照组, 分别转染 mir-let- 7b 慢病毒载体 Anti-rno-miR-let-7b Inhibitor 载体及不进行任何转染操作, 实时荧光定量 PCR(RTqPCR) 检测各组细胞 mir-let-7b 的表达水平, 确认转染情况多因子联合法诱导各组 MSCs 向神经细胞分化, RT-qPCR 检测神经细胞标志物 MAP- 的表达, 免疫细胞化学染色检测神经原特异性烯醇化酶 (NSE) 的表达和各组 MSCs 的神经细胞分化率分离培养的 MSCs 在镜下呈长梭形或成纤维细胞样, CD9 CD 阳性表达率均大于 9%, CD5 的表达不足 %, 证实得到的细胞即为 MSCs RTqPCR 结果显示, 与对照组相比, 组的 mir-let-7b 表达水平升高, 组几乎未检测到 mir-let-7, 提示 mir-let-7b 载体及 mir-let-7b Inhibitor 载体均成功转染了 MSCs 经诱导分化后, 与对照组相比, 组神经细胞标志蛋白 SIM Gap MBP 和 NSE 与对照组相比表达水平显著升高 (P<.5); 组 SIM Gap MBP 和 NSE 表达水平与组相比具有明显差异 (P<.5) 结果提示, mir-let-7b 可以促进 MSCs 向神经细胞分化, 通过控制 mir-let-7b 的水平可以调控 MSCs 的神经细胞分化率关键词骨髓间充质干细胞 ; MiR-let-7b; 神经元 ; 诱导分化 ; 慢病毒 mir-let-7b Lentiviral Vector Promote the Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Nerve Cells Zhou Xueying, Li Shuangyue, Qu Shuxian, Qu Yanhui, Shao Ying, Sun Jingsong *, Piao Fengyuan * ( The Department of Public Health, Dalian Medical University, Dalian 6, China; Tumor Stem Cell Research Institute of Dalian Medical University, Dalian 6, China; The Second Affiliated Hospital Of Dalian Medical University, Dalian 6, China; The First Affiliated Hospital Of Dalian Medical University, Dalian 6, China) Abstract MicroRNAs play an important role in the process of growth and senescence of living organisms, and participate in the important biological processes of MSCs, including proliferation, differentiation, signal transduction and death. To understand the effect of mir-let-7 family members on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into neurons can promote stem cell transplantation. To investigate the role of mir-let- 7b in promoting the differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells into nerve cells. The rat mir-let- 收稿日期 : 7-- 接受日期 : 8-- * 通讯作者 Tel: , @qq.com Received: December, 7 Accepted: April, 8 *Corresponding author. Tel: , @qq.com

2 研究论文 7b lentiviral vector and Anti-rno-miR-let-7b Inhibitor vector were transfected into rat bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. The experiment was divided into control group (MiR-let-7b lentiviral) and group (transfected with Anti-rno-miR-let-7b Inhibitor). Furthermore, the effects of all-trans retinoic acid (RA), basic fibroblast growth factor (bfgf) and epidermal growth factor (EGF) were used to induce bone marrow. The expression of mir-let-7b in three groups of cells was compared by Real-time quantitative PCR (RT-qPCR). The expression of NSE was detected by immunocytochemical staining. The expression of MAP- mrna was detected by RT-PCR. The expression of CD9 and CD was more than 9% and the expression of CD5 was less than %. The results showed that the cells were MSCs. RT-qPCR results showed that the mir-let-7b expression level in the group was higher than that in the control group, and mir-let-7 was hardly detected in the mir-let-7bgroup, suggesting that mir-let-7b vector and mir-let-7binhibitor vector were successfully transfected with MSCs. The expression of SIM, Gap, MBP and NSE protein in group was significantly higher than these in control group (P<.5). Meanwhile, The expression of SIM, Gap, MBP and NSE protein had significantly difference in the groups with or without mir-let-7 (P<.5). The results suggest that mir-let-7b can promote the differentiation of MSCs into neurons and regulate the differentiation rate of MSCs by controlling the level of mirlet-7b. Keywords bone marrow mesenchymal stem cells; MiR-let-7b; neurons; differentiation; slentivirus 高度特化的神经细胞是神经系统的基本结构和功能单位一旦大脑或脊髓中的神经细胞损伤或 [] 缺失便会引起一系列的神经系统疾病骨髓间充质干细胞 (marrow mesenchymal stemcells, MSCs) 是一类具有多分化潜能的干细胞, 在细胞移植组织工程基因治疗等领域具有十分重要的应用前景, 为神经退化性疾病缺氧缺血性脑损伤自身免疫性疾病等疾病的治疗提供了新的思路 MSCs 向神 [-] 经细胞分化已经成为干细胞研究的热点之一微小 RNA(micro RNA) 是一类由内源基因编码的长度约为个核苷酸的非编码单链 RNA 分子, 可通过转录水平转录后水平和表观遗传学水平等方式调控靶基因的表达, 从而在干细胞分化中 [5-6] 发挥重要作用有报道指出, mir-6a 类似物 [7] 可促进间充质干细胞向脂肪细胞的分化陈冬 [8] 梅等报道, 转染慢病毒反义寡核苷酸抑制 mir- a 的表达后, 胎盘间充质干细胞向内胚层的分化率显著降低大量研究已经证实, mir-let-7 家族成员在脑组织和神经细胞中表达, 并在神经系统 [9] 中呈现明显的组织表达特异性 Marson 等对比了不同细胞的 mirna 表达水平, 结果显示, 在神经前体细胞中 mir-let-7b 的表达占主导地位, 且明显高于其他来源细胞本文通过大鼠 mir-let-7b 慢病毒载体转染 MSCs 探讨其在 MSCs 向神经细胞分化中的作用材料与方法. 实验动物雄性健康清洁级 Sprague-Dawley(SD) 大鼠只 [(8±5) g], 清洁级 ~5 周龄 SD 大鼠 ( 约 g), 均由大连医科大学动物实验中心提供 [ 许可证号 SCKK( 辽 )-]. 主要试剂及仪器 LG-DMEM 培养基购于美国 Gibco 公司胎牛血清 (FBS) 购于澳大利亚 NQBB 公司 NSE 胰酶青霉素链霉素双抗溶液来自于美国 Sigma 公司 mir-let-7b 慢病毒 Anti-rno-miR-let-7b Inhibitor 载体购于上海吉玛公司 bfgf EGF 购于美国 Peprotech 公司细胞培养皿孔培养板购于美国 Corning 公司 FITC-CD 抗体 PE-CD5 抗体 PE-CD9 抗体均购于美国 e-bioscience 公司 RNA 提取试剂盒 SYBR Green PCR 试剂盒引物购于日本 TaKaRa 公司流式细胞仪购于德国 Partec 公司 MCO-5AC 型 CO 孵育箱购于日本 SANYO 公司 IX-7 型倒置显微镜购于日本 Olympus 公司电镜购于德国 Leica, Mannheim 公司. 大鼠 MSCs 的分离培养将 ~ 周龄大鼠脱颈处死, 75% 酒精浸泡 min 后转移至超净工作台, 在无菌环境下分离胫骨股骨并暴露骨髓腔, 用 PBS 冲洗骨髓腔, 将细胞悬液吹打成单个散在细胞, 目筛网过滤至 5 ml 离心管

3 周雪颖等 : mir-let-7b 慢病毒载体促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化中, r/min 离心 5 min, 弃上清液用含 % 胎牛血清的 DMEM 培养液重悬细胞, 以 9 细胞 /cm 接种于培养皿, 置于 7 C 5% CO 恒温培养箱中培养, 7 h 后首次换液, 以后每天换液次原代细胞达 8%~9% 融合时,.5% 胰酶消化并传代, 利用差速贴壁法逐步纯化扩增 MSCs 显微镜下观察细胞形态并拍照. 流式细胞术检测第代 MSCs 融合至 8%~9% 时, 去除培养基, PBS 缓冲液清洗细胞次, 加入.5% 胰蛋白酶室温消化 ~ min, 终止消化后, r/min 离心 5 min, 收集细胞, 用 PBS 缓冲液制成 6 细胞 /μl 的单细胞悬液分别加入 CD9 CD9 和 CD5 一抗, 充分混匀, 使细胞均匀接触抗体, 7 C 避光孵育 min, r/min 离心 5 min, 过滤后进行流式细胞仪检测.5 mir-let-7b 在 MSCs 感染复数将 MSCs 接种在 96 孔板上, 当细胞融合度为 5% 以上时, 每种慢病毒载体均取感染复数 (MOI) 值为 5 五个梯度, 在完全培养基中加入不同的慢病毒载体上清, 以及终质量浓度为 5 mg/l 的凝聚胺 h 后将培养基上清吸除, 更换新鲜培养基, 感染天后在荧光显微镜下观察并拍照结果发现, MOI 为时, 细胞的荧光表达量最高, 细胞存活率最高, 故选取 MOI 值为的感染复数进行下游的转染实验.6 MSCs 的转染及分组取 mir-let-7b 慢病毒载体 Anti-rno-miR-let- 7b Inhibitor 载体以最适 MOI 值为的感染复数转染 MSCs, 置于 7 C 5% CO 培养箱内孵育, 根据转染情况将 MSCs 分为 : 对照组 ( 未行感 / 转染组 ) mirlet-7b+ 组 ( 感染 mir-let-7b 慢病毒 ) 及组 ( 转染 Anti-rno-miR-lett-7b Inhibitor) 用 RT-PCR 检测各组 mir-let-7b 的表达情况, 评价细胞感染成功与否.7 体外诱导 MSCs 分化为神经细胞将各组 MSCs 接种于 6 孔板, 生长密度达到 6% 时, 换成诱导培养基 (DMEM+% FBS+ μmol/l ATRA+ ng/ml bfgf+ ng/ml EGF), 7 C CO 饱和湿度下静置培养 7 h 后进行检测.8 免疫细胞化学染色法各组细胞 PBS 洗次, 预冷丙酮固定 5 min, PBS 洗次,.5% Triton X- 孵育 min, PBS 洗次, 山,( 5 抗体( 羊血清封闭 min, 弃去血清, 加入 NSE 7 C 孵育 h, PBS 洗次, 滴加二抗, 7 C 孵育 5 min 后 DAB 显色, 显微镜下观察镜下随机选取个视野, 计数阳性细胞.9 RT-qPCR 采用 RNAiso Plus 提取总 RNA, 分光光度法测定计算提取的总 RNA 含量及浓度, RNA 样本的 D 6 /D 8 介于.8~. 之间时继续进行检测使用反转录试剂盒将 RNA 反转录为 cdna 利用 SYBR Green PCR Kit 进行 RT-PCR 检测, 使用 TP8 Realtime PCR Detection 系统 mir-let-7b 的反转录发夹引物 : 5 -GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GT- ( 正向引物 ), 5 -ATT CGC ACT GGA TAC GAC GGG AAG- ( 反向引物 ) U6 特异发夹引物 : 5 -GCG CAC CCC CAG CGC AAA ATA TGG- 反应条件为 : 55 C s, 95 C s, 7 C s, 个循环. Western blot 检测收集细胞, 加入 RIPA 裂解液重悬, 冰浴 min 后, 离心收集蛋白并定量加入浓缩的 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液, 煮沸充分变性蛋白等量上样后, 进行 SDS 凝胶电泳, PVDF 膜转膜, 用含有 5% 脱脂牛奶的 TBST 室温封闭 h 后, 加入轴突和髓鞘成分蛋白 SIM Gap MBP 抗体 ( 5 ) 和 GAPDH 抗体 ) ) C 孵育过夜, TBST 洗膜次, 每次 min, 加入辣根过氧化物酶标记的二抗, 室温孵育 h, TBST 洗膜次, 每次 min, ECL 化学发光显影并拍照用凝胶成像分析系统测定条带灰度值, 并取其与 GAPDH 的比值作为相对表达量. 统计学分析运用 SPSS 7. 统计软件进行分析, 多组间比较采用单因素方差分析 (ANOVA), 组间两两比较采用最小显著性 P<.5(LSD 法 ) 结果. MSCs 的形态学观察骨髓细胞刚接种于培养皿时, 细胞大小不一, 呈圆形, 大多悬浮于培养液中 ; 6~8 h 后悬浮的细胞开始贴壁, h 后细胞基本完成贴壁 ( 图 A) 在清除未贴壁的细胞后可见细胞分散分布并开始贴壁生长, 呈梭形或多角形 ~5 天后可见细胞呈集落排列并伸出粗细长短不一的突起, 细胞质较丰富, 核仁清晰可见 ( 图 B) 天后可见细胞间隙变窄, 开始相互融合, 并按照胞体长轴有序地排列, 整体呈螺

mir-let-7b 慢病毒感染 MSCs 的情况用 let-7b let-7b Inhibitor 的过表达慢病毒载体 ( 终浓度为 nmol/l) 转染 MSCs, 转染 7 h 后, RTqPCR 检测三组细胞 mir-let-7b 的表达量与对照组相比, 组的 mir-let-7b 表达量显著升高, 组的 mir-let-7b 表达量显著降低 (P<.

4 研究论文旋形或旋涡状 ( 图 C) 进行稳定传代后, 可见细胞的形态和生长速度没有明显的改变, 此时细胞多呈不规则的梭形或多角形, 细胞核为圆形或椭圆形 ( 图 D). MSCs 表面标志物检测流式细胞仪检测结果显示, 在培养的第 ~5 代大鼠 MSCs 中, CD 和 CD9 的阳性表达率均大于 9%, 而 CD5 的表达率不到 %, 通过对 MSCs 细胞表面标志物应用流式细胞仪检测后, 得知其表达结果与 MSCs 细胞表面标志物一致 ( 图 ). mir-let-7b 慢病毒感染 MSCs 的情况用 let-7b let-7b Inhibitor 的过表达慢病毒载体 ( 终浓度为 nmol/l) 转染 MSCs, 转染 7 h 后, RTqPCR 检测三组细胞 mir-let-7b 的表达量与对照组相比, 组的 mir-let-7b 表达量显著升高, 组的 mir-let-7b 表达量显著降低 (P<.5) ( 图 ) mir-let-7b 的含量升高说明 MSCs 慢病毒感染成功. 神经元特异性 NSE 表达检测 MSCs 诱导分化 7 h 后, 与对照组相比, mir-let- 7b+ 组 NSE 阳性细胞数明显增多, 细胞形成双极或多极的细胞体, 细胞质以细胞核为中心收缩, 周围的胞质收缩形成细胞的突起, 细胞间存在突触联系与对照组相比, 组细胞保持长梭形和多角形, 未见 NSE 阳性细胞出现这表明, 在通过转染 mir-let-7b 后, MSCs 细胞被诱导生成大量的神经细胞, 与未转染 mir-let-7b 相比差异明显 ( 图 ).5 神经元标志蛋白表达含量的检测如图 5 所示, MSCs 诱导分化 7 h 后, 与对照组相比, 组的神经元标志蛋白 SIM A B C D µm µm µm µm A: 原代 MSCs 培养 h, 细胞基本贴壁 ; B: 原代 MSCs 培养 5 天, 细胞出现粗细长短不一的突起 ; C: 原代 MSCs 培养天, 细胞融合生长, 有序排列 ; D: 第代 MSCs, 细胞为多角形梭形 A: the primary MSCs were cultured for h, and the cells were basically adherent to the wall; B: the original MSCs were cultured for 5 days, and the cells showed different thickness and length of protuberances; C: the original MSCs were cultured for days, and the cells were fused and grown in an orderly manner; D: the third generation of MSCs, cells are polygonal, spindle shaped. 图 MSCs 形态学特点 Fig. Morphological characteristics of MSCs (A) (B) (C) Count CD5-PE CD9-PE CD-PE A: CD5 流式细胞检测结果表达 ; B: CD9 流式细胞检测结果表达 ; C: CD 流式细胞检测结果表达 A: the expression of CD5 flow cell detection results; B: expression of CD9 flow cell detection results; C: CD flow cell detection results were expressed. 图 MSCs 表面标志物的流式检测 Fig. Flow detection of surface markers

5 compared with the control group. 图 RT-PCR 检测各组 MSCs 的 mir-let-7b 表达情况 Fig.

5 周雪颖等 : mir-let-7b 慢病毒载体促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化 5 mir-let-7b expression * Gap 和 MBP 水平明显升高, 差异有统计学意义 (P<.5) 组的神经元标志蛋白 SIM Gap 和 MBP 水平无明显变化, 表明 mir-let-7b 的转染极大地提高了 MSCs 细胞中神经元标志蛋白的含量, 其中包括轴突和髓鞘的标志蛋白, 通过含量的变化, 说明 mir-let-7b 诱导 MSCs 细胞向神经细胞分化, 与组差异有统计学意义 (P<.5) trol *P<.5, 与对照组相比较 *P<.5 compared with the control group. 图 RT-PCR 检测各组 MSCs 的 mir-let-7b 表达情况 Fig. mir-let-7b expression of MSCs in each group was detected by RT-PCR 讨论 MSCs 取材方便可塑性较强, 能跨胚层分化为神经细胞, 分化的目的细胞具有可移植性, 对于脊髓损伤帕金森病多发性硬化缺血性脑损伤等神经系统疾病的治疗具有重要意义前期的研究发现, 在体外给予特定的环境后可以促进 MSCs 分化为神经元样的细胞 [-] mirna 是一类具有调控功能 A B C µm µm µm A 组 : 不添加任何诱导剂的对照组 ; B 组 : 加入 mir-let-7b 诱导分化 7 h 组 ; C 组 : 未加入 mir-let-7b 诱导分化 7 h 组 A: control group without any inducer; B: mir-let-7b was added to induce the differentiation of group for 7 h. C: the differentiation of the group for 7 h was induced without mir-let-7b. 图免疫细胞化学染色法检测 NSE 表达情况 Fig. The expression of NSE was detected by immunocytochemical staining 的内源性非编码 RNA, 参与 MSCs 一系列重要的生物学进程, 包括早期发育增殖分化细胞凋亡信 [] 号转导等 mirna 的发现及相关研究揭示了一种 [] [5] 新的调控 MSCs 的方式 Simmons 等已经证实, mir-let-7b 可以通过激活 WNT 通路来促进神经干细胞的增值和分化, 预示其促进 MSCs 分化为神经元样 [6] 细胞成为可能徐玉生等通过检测 mir-let-7b 修饰后的骨髓间充质干细胞后发现, mir-let-7b 在体内可以明显提升大鼠脊髓 NF 的含量和降低 GFAP 的表达水平 SIM Gap 和 MBP 的构成神经元胞体和轴突髓鞘的重要组成部分, 在维持神经功能方面有着重要作用和意义, 在前期体外观察细胞 [7] 分化神经元的检测中可作为重要的指标本实验通过采用 mir-let-7b 过表达和抑制慢病毒载体转染 MSCs, 观察其促 MSCs 向神经细胞分化中的作用结果显示, 与对照组相比, MiR-let-7b+ 组中 SIM Gap MBP 和 NSE 的表达明显升高, 组中 SIM Gap MBP 和 NSE 的表达显著低于组, 说明过表达 let-7b 的 MSCs, 更加容易向神经元细胞分化, 而抑制 let-7b 表达的 MSCs 则不利于向神经元细胞分化 let-7b 如何调控 MSCs 向神经细胞分化的机制尚不十分清楚研究显示, Lin8 可以阻断 mir-let7 的成熟, 从而靶向性下调 Let-7 的功能 Lin8 也能作为 mir-let7 的 [8-] [] 靶基因被其下调, 形成 Lin8/Let-7 轴 Zhu 等在研究葡萄糖代谢的过程中发现, Lin8/miR-let-7 能够抑制 Insulin-PIK/mTOR 通路, 并通过此通路在 MSCs 的增殖神经分化过程中发挥了重要的作用据此, 本课题组接下来将研究 mir-let-7b 是否通过此通路促进 MSCs 向神经细胞分化

6 研究论文 (A) (B) SIM Gap GAPDH GAPDH a Relative Expression of SIM b Relative Expression of Gap a b (C) MBP GAPDH Relative Expression of MBP 5 a b A: SIM 在各组中蛋白表达的对比 ; B: Gap 在各组中蛋白表达的对比 ; C: MBP

6 6 研究论文 (A) (B) SIM Gap GAPDH GAPDH a Relative Expression of SIM b Relative Expression of Gap a b (C) MBP GAPDH Relative Expression of MBP 5 a b A: SIM 在各组中蛋白表达的对比 ; B: Gap 在各组中蛋白表达的对比 ; C: MBP 在各组中蛋白表达的对比, a P<.5, 与对照组相比较 ; b P<.5, 与组相比较 A: comparison of protein expression of SIM in each group; B: comparison of protein expression of Gap in each group; C: comparison of protein expression of MBP in each group; a P<.5 compared with the control group; b P<.5 compared with the group. 图 5 Western blot 检测各组神经元标志蛋白 (SIM Gap 和 MBP) 表达水平 Fig.5 The expression levels of neuronal marker proteins (SIM, Gap and MBP) in each group detected by Western blot 综上所述, 本研究采用慢病毒感染技术, 通过建立 mir-let-7b 过表达和抑制模型发现, mir-let-7b 对 MSCs 向神经细胞分化起调控作用, 通过提高 mirlet-7b 的表达可以促进 MSCs 向神经细胞分化参考文献 (References) 安秀峰, 黄汉昌, 姜招峰. 骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化. 生命科学 (An Xiufeng, Huang Hanchang, Jiang Zhaofeng, Differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into nerve cells. Chinese Bulletin of Life sciences) ; 5(): 8-9. Uccelli A, Laroni A, Freedman MS. Mesenchymal stem cells for the treatment of multiple sclerosis and other neurological diseases. Lancet Neurol ; (7): Yanjie J, Jiping S, Yan Z, Xiaofeng Z, Boai Z, Yajun L. Effects of Notch- signalling pathway on differentiation of marrow mesenchymal stem cells into neurons in vitro. Neuroreport 7; 8(): -7. Ren G, Chen X, Dong F, Li W, Ren X, Zhang Y, et al. cise review: mesenchymal stem cells and translational medicine: emerging issues. Stem Cells Transl Med ; (): 5-8.

7 周雪颖等 : mir-let-7b 慢病毒载体促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化 7 5 徐小隔, 张静, 龚哲, 赵绍云, 何霞, 王天舒, 等. Let-7d 慢病毒载体体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经细胞. 中国组织工程研究 (Xu Xiaoge, Zhang Jing, Gong Zhe, Zhao Shaoyun, He Xia, Wang Tianshu, et al. Let-7d lentivirus vector in vitro induces the differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells into nerve cells. Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research) ; 8(): 周燕, 陈奎生, 高剑波, 韩瑞, 鲁晶晶, 彭涛, 等. mir- - 促进大鼠骨髓间充质干细胞神经分化的实验研究. 中国当代儿科杂志 (Zhou Yan, Chen Kuisheng, Gao Jianbo, Han Rui, Lu Jingjing, Peng Tao, et al. Experimental study on the neurodifferentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells induced by mir--. Chinese Journal of temporary pediatrics) ; (): 叶勖, 王兴兵, 汪健, 明静. MicroRNA-6a 对人骨髓间充质干细胞分化能力的影响. 中国实验血液学杂志 (Ye Xun, Wang Xingbing, Wang Jian, Ming Jing. Effect of microrna- 6a on the differentiation ability of human bone marrow mesenchymal stem cells. Chinese Journal of Experimental Hematology) 6; (): 陈冬梅, 马海滨, 刘淑丹, 王立斌, 李玉奎, 魏军. MicroRNA- a 促进人胎盘间充质干细胞向内胚层细胞的分化. 细胞与分子免疫学杂志 (Chen Dongmei, Ma Haibin, Liu Shudan, Wang Libin, Li Yukui, Wei Jun. Microrna-a promotes the differentiation of human placental mesenchymal stem cells into endodermal cells. Journal of cell and molecular immunology) ; 9( ): Marson A, Levine SS, Cole MF, Frampton GM, Brambrink T, Johnstone S, et al. necting microrna genes to the core transcriptional regulatory circuitry of embryonic stem cells. Cell 8; (): 5-. Ankeny DP, Mctigue DM, Jakeman LB. Bone marrow transplants provide tissue protection and directional guidance for axons after contusive spinal cord injury in rats. Exp Neurol ; 9(): 7-. Chopp M, Zhang XH, Li Y, Wang L, Chen J, Lu D, et al. Spinal cord injury in rat: treatment with bone marrow stromal cell transplantation. Neuroreport ; (): -5. Chen J, Deng S, Zhang S, Chen Z, Wu S, Cai X, et al. The role of MiRNAs in the differentiation of adipose-derived stem cells. Curr Stem Cell Res Ther ; 9(): Shi Y, Zhao X, Hsieh J, Wichterle H, Impey S, Banerjee S, et al. MicroRNA regulation of neural stem cells and neurogenesis. J Neurosci ; (5): 9-6. Ding XC, Slack FJ, Grosshans H. The let-7 microrna interfaces extensively with the translation machinery to regulate cell differentiation. Cell Cycle 8; (9): Simmons A, Whitehead RP, Kolokohsov AA. Use of recombinant lentivirus pseudotyped with vesicular stomatitis virus glycoprotein G for efficient generation of human anti-cancer chimeric T cells by transduction of human peripheral blood lymphocytes in vitro. Virol J 6; : 8. 6 徐玉生, 崔浩, 张松, 王培松, 朱海洋, 钟斌, 等. mirna let-7b 修饰的骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后脊髓 NF- GFAP 表达的影响. 郑州大学学报 ( 医学版 )(Xu Yusheng, Cui Hao, Zhang Song, Wang Peisong, Zhu Haiyang, Zhong Bin, et al. Effects of mirna let-7b modified bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on the expression of spinal nf- and GFAP after spinal cord injury in rats. Journal of Zhengzhou University, Medical Edition) 5; : 何佳, 鄢波. 转染胶质细胞源性神经营养因子诱导神经干细胞分化. 中国组织工程研究 (He Jia, Yan Bo. Transfected glial cytogenic neurotrophic factor induces differentiation of neural stem cells. Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research) 5; 9(5): Viswanathan SR, Daley GQ, Gregory RI. Selective block of microrna processing by Lin8. Science 8; (587): Rybak A, Fuchs H, Smirnova L, Brandt C, Pohl EE, Nitsch R, et al. A feedback loop comprising lin-8 and let-7 controls pre-let-7 maturation during neural stem-cell commitment. Nat Cell Biol 8; (8): Wright JE, Ciosk R. RNA-based regulation of pluripotency. Trends Genet ; 9(): Zhu H, Shyh-Chang N, Segrè AV, Shinoda G, Shah SP, Einhorn WS, et al. The Lin8/let-7 axis regulates glucose metabolism. Cell ; 7(): 8-9.

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环球中医药 2016 年 5 月第 9 卷第 5 期摇 Global Traditional Chinese Medicine, May 2016,Vol 郾 9, No 郾 5 摇 557 两种电针对脊髓损伤 14 天后大鼠运动功能神经元及 MEK2 p 鄄 ERK1 表达的影响论著宋良玉摇吕威摇景泉凯摇莫雨