免疫佐剂

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1 免疫载体与佐剂 任洪林 1 冯小丽 2 1. 吉林大学人兽共患病研究所 ;2. 中国科学院昆明动物研究所 1891 年提出 抗体 这一术语,1900 年前后开始抗原与抗体的研究, 并指出抗原可诱导特异抗体产生 1971 年 Mitchison 发现半抗原载体现象, 提出 B 细胞识别半抗原决定簇 (hapten determinants) 和 T 细胞识别载体决定簇 (carrier determinants) 的理论 上个世纪 80 年代后将 B 细胞识别半抗原决定簇重新命名为 B 细胞表位, 而 T 细胞识别载体决定簇重命名为 T 细胞表位 1975 年单克隆抗体的成功制备, 大大促进了免疫化学的发展和抗体的临床应用 理论上, 机体可产生特异的抗体与任何合成分子 蛋白 核酸 糖 脂蛋白等抗原物质发生特异性结合反应 但并不是所有的异已或自身抗原都可以刺激机体产生特异的抗体, 这与抗原自身性质密切相关, 作为一个完全抗原必须同时具备 B 细胞表位和 T 细胞表位 通常, 抗原被分为两类, 一类为固有完全抗原, 另一类为必需与免疫载体偶联后才能引发机体免疫反应的半抗原, 如小分子的药物 毒物 激素等 免疫载体和免疫佐剂是协助抗原激发机体产生特异性抗体的重要免疫应答伴侣物质 进入机体的免疫原能否有效激发机体产生抗体, 对系统免疫反应的建立至关重要, 也是疫苗发挥保护作用的物质基础 因此, 免疫载体和免疫佐剂的研究一直是高保护性疫苗研制领域的重要研究内容 第一节免疫载体 一 免疫载体免疫载体是指与抗原分子共价结合, 并可增强抗原免疫原性和刺激机体产生抗原特异性抗体的大分子物质 一般免疫载体的分子量较大, 同时具有 B 抗原表位和 T 抗原表位, 与抗原或半抗原物质较易形成共价连接 抗原分子一般都具有可被 B 细胞识别的表位 但只具有 B 细胞表位不足以激发机体产生抗体 对于一个抗原来说,T 细胞表位与主要组织相容性复合体 Ⅱ(Major histocompatibility complex class Ⅱ,MHCⅡ) 相关 T 细胞受体相结合, 是激发机体产生抗原特异性抗体的关键 完全抗原同时具有 B 细胞表位和 T 细胞表位, 可以刺激机体产生特异性抗体 而半抗原 (hapten) 是一类缺乏 T 细胞表位, 但具有 B 细胞表位的不完全抗原, 一般表现出与免疫应答效应物 ( 如抗体或细胞因子等 ) 结合的反应原性, 1

2 却不具有刺激机体产生免疫应答的免疫原性, 如药物 毒物 激素 杀虫剂等就属于此类半抗原 理论上讲, 这些半抗原都具有与抗体特异性结合的能力 随着单克隆抗体和免疫分析技术的发展, 对半抗原完全化技术的需求越来越迫切 半抗原完全化就是指使半抗原不但具有与抗体结合的反应原性, 还具有刺激机体产生特异性抗体的免疫原性 目前, 使用合适的免疫载体与半抗原偶联, 使其具有刺激机体产生抗体的能力, 是半抗原完全化的一种重要方法 免疫载体的主要特点是, 具有较大的分子量, 并可提供较多的 T 细胞表位, 具有很强的活化 T 细胞和刺激机体产生免疫应答的能力, 免疫载体与半抗原分子通过化学键连接在一起, 成为一个完全抗原, 才具有免疫原性 二 免疫载体的种类与应用 ( 一 ) 直接偶联的蛋白类载体使用最广的蛋白载体就是一些直接通过化学反应与目标物 ( 通常是小分子半抗原 ) 偶联的蛋白载体, 如钥孔戚血蓝蛋白 (keyhole limpet hemocyanin, KLH) 牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA) 卵清蛋白(ovalbumin, OVA) 人血清蛋白(human serum albumin, HSA) 鸡免疫球蛋白(chicken immunoglobulin) 动物的丙种球蛋白(gamma globulin) 甲状腺球蛋白 (thyroglobulin) 破伤风类毒素(tetanus toxoid) 人工合成的多聚赖氨酸(poly- L-lysine) 纯化蛋白衍生物(purified protein derivative, PPD) 等 这一类分子量较大的半抗原偶联蛋白, 含有大量的且容易发生反应的氨基 (-NH 2) 羧基 (-COOH) 和巯基 (-SH), 并以它们作为偶联基团, 与半抗原活性基团通过共价键连接, 为半抗原提供完全抗原的结构, 合成过程中不需要复杂的仪器, 而且可以灵活地选择活性偶联基团, 一直是实验室首选的半抗原完全化方法 目前小分子化合物的蛋白偶联多采用这种蛋白载体 一般先将小分子化合物进行活泼化学基团的修饰, 如用氨基或羧基修饰 经修饰后的小分子化合物便可在比较温和的条件下与载体蛋白偶联, 一般使用的半抗原与载体蛋白的偶联比为 10:1 这类蛋白偶联载体可以给半抗原提供 T 细胞表位, 从而制备人工偶联抗原, 使半抗原完全化 由于人工偶联抗原, 具备 MHCⅡ 类分子的 T 细胞受体结合位点, 因而可以引发一系列特异性免疫应答, 最终产生针对特异抗原的抗体 通常所用的这类蛋白载体, 一般只刺激机体发生免疫反应, 没有免疫佐剂的作用 但现在趋向于使用具有免疫佐剂效应的偶联载体, 既可以使半抗原完全化, 又可以增强机体的免疫应答, 如 PPD 传统理论认为, 偶联载体与受试动物的亲缘关系越远越容易引起强烈的免疫应答 目前有研究显示受试动物自身的蛋白同样可以作为小分子免疫偶联载体, 为小分子提供 T 细胞表位, 而且不产生针对载体的干扰性抗体 最常用的传统动物源性免疫载体是牛血清白蛋白 (BSA), 它是牛血清中的主要成份之一, 物理性质 2

3 稳定 不易变性 且价格便宜 它的分子量为 68 kd, 由 581 个氨基酸残基组成, 其中有 35 个半胱氨酸残基组成 17 个二硫键和一个自由巯基, 在第 34 位可以与多种离子或小分子物质结合 KLH 也是一种大分子蛋白载体, 分子量较大, 含有较多的活性组氨酸基团, 易与半抗原连接, 有较高的免疫活性, 非常适合作为免疫载体 其价格相对 BSA 较高, 并且由于它的平均分子量较大, 用普通 SDS-PAGE 蛋白电泳分析半抗原分子量变化时, 比较难判断半抗原与载体的偶联状态 另一种常用的蛋白载体 OVA, 是卵清蛋白中的主要成份, 约占卵清蛋白总量的 65%, 分子量约为 40.5 kd N 末端为乙酰化的甘氨酸,C 末端为脯氨酸 ( 二 ) 基因工程融合的蛋白载体有一类蛋白载体, 本身具有很强的免疫原性, 可以刺激机体发生很强的免疫反应, 为抗原或半抗原提供 T 细胞表位, 促进抗体的产生 这类载体一般通过基因工程的方式与目标免疫原蛋白基因相连接, 通过基因工程表达系统, 融合表达具有免疫原结构和蛋白载体结构的基因工程融合蛋白, 这种蛋白既可以提供免疫原特异性的 B 细胞表位, 又可以提供蛋白载体的 T 细胞表位, 增强机体免疫反应, 诱导机体产生针对目标抗原的特异性抗体 目前此类载体研究较多的是乙肝病毒核心抗原 (heptits B core protein, HBcAg) 和 Ⅱ 型主要组织相容性复合体分子的恒定链 (invariant chain,,ii) 近年来, 乙肝病毒核心抗原作为基因工程融合免疫载体的研究相对较多 乙肝病毒核心抗原是由乙肝病毒重要结构核心蛋白组成 乙肝病毒核心蛋白是一个分子量为 21 kd 的多肽,240 个这种多肽自发组装成一个 27 nm 的粒子结构 乙肝核心抗原粒子具有高度的溶解性, 核心蛋白二聚体沿长的垂直 α- 螺旋轴组成粒子亚单位 4 个 α- 螺旋束状二聚体组成核壳, 并在核壳表面产生刺突 乙肝病毒核心抗原在原核和真核系统里均可高效表达, 并装配成球形粒子 许多研究表明, 在乙肝病毒核心抗原的 N 端 C 端和主要免疫原区 (MIR) 均可插入外源的肽段, 且保持肽段的构象, 并增强其免疫原性和抗原性, 具有免疫载体和免疫佐剂的双重作用 目前研究表明, 在 N 端插入的最大外源肽段为 50 个氨基酸残基, 插入后较少暴露于粒子表面 C 端多在 和 156 位氨基酸处插入, 可插入 100 多个氨基酸残基, 一般暴露或部分暴露于粒子表面 虽然这种融合乙肝病毒核心抗原的加强型重组抗原可以显著提高目标外源肽段的免疫原性和反应原性, 但也保留很强的乙肝病毒免疫原性, 因此在应用此类免疫增强型疫苗时, 常会因为机体内 ( 特别是人体内 ) 抗乙肝病毒抗体的存在, 导致免疫原性和正确折叠装配能力的下降 在乙肝病毒核心抗原 MIR 区或刺突尖区插入外源片段, 不但可以使外源片段暴露于粒子表面, 还很好地解决了机体已有乙肝抗体对重组抗原免疫原性不利的影响 刺突尖区作为乙肝病毒核心抗原首选外源蛋白的插入点, 其 位的两个氨基酸残基之间对 HBcAg 自我装配并 3

4 非必需, 而且可以插入多至 238 个氨基酸残基的肽段, 并保证外源肽段暴露于表面, 增强其免疫原性 同时, 因为去掉了 HBcAg 的 位的氨基酸残基, 可去除 HBcAg 的免疫原性, 从而解决机体自身抗乙肝病毒抗体对重组抗原免疫原性的不利影响 [1] ( 三 ) 疫苗用细菌载体 1. 细菌菌蜕 (bacterial ghost) 菌蜕 ( 又称 菌影 ) 是革兰氏阴性菌被噬菌体 PhiX174 裂解基因 E 的可调控表达裂解后, 形成的完整细菌空壳 细菌菌蜕的优势在于保留了与活菌一样的细胞膜结构和相关抗原蛋白, 并可在壳内携带外来基因 由于其保留细菌膜含有的完整膜蛋白 菌毛及其它刺激成分如脂多糖 肽聚糖等, 可被树突状细胞和巨噬细胞的相关膜受体识别, 并被有效地吞噬, 进而激发相关免疫效应, 诱导细胞因子的产生 [2] 细菌菌蜕本身就是很好的免疫佐剂, 这也是细菌菌蜕作为基因疫苗运载系统的最大特点 Ebensen [3] 等通过体外实验发现携带质粒 pefgp-n1 的 Manneimia hacmolytia 菌蜕能有效地将目的基因传递给抗原递呈细胞 (APC), 并具有 52%-60% 的转化效率 将携带质粒 pcmvb( 含有编码 β- 半乳糖甘酶的基因 ) 的 Manneimia hacmolytia 菌蜕以真皮内或肌内方式注射给小鼠, 能刺激小鼠产生较强的抗原特异性体液免疫反应和细胞免疫反应 (CD4 + 和 CD8 + ), 同时该细菌菌蜕诱导以 Th2 为主导的特异性体液免疫反应, 而 裸 DNA 疫苗只能诱导 Th1/ Th2 混合均衡的体液免疫反应 细菌 [4] 菌蜕能特异性地刺激树突状细胞, 促进其成熟并活性增强 细菌菌蜕尤其适合作为粘膜免 [5] 疫的疫苗运载系统, 口服途径也可激发体液和细胞免疫应答 目前有研究报道的菌蜕疫苗运载系统主要有霍乱弧菌菌蜕 (Vibrio cholera ghost,vcg) [6] 大肠杆菌菌蜕(Escherichia coli ghost) [5] 幽门螺杆菌菌蜕(Helicobacter pylori ghost) [7] 及重组菌蜕 (recombinant bacterial ghost,rbg) [8 9] [6] 等 研究表明使用菌蜕疫苗运载系统可提高抗原特异性抗体产生水平和 [4 疫苗保护率 7] 菌蜕既可用作常规疫苗用于免疫, 还可将更多的外源抗原展示在菌蜕上, 使之成为外源抗原的载体 例如, 表达沙眼衣原体主要外膜蛋白的重组霍乱弧菌菌蜕 (VCG) [8], 可诱导高效的抗沙眼衣原体感染黏膜 T 细胞反应, 同时为构建抗衣原体多价重组亚单位疫苗提供技术平台 2. 减毒活菌疫苗运载系统目前一些减毒活菌应用于疫苗运载系统应用研究中 用沙门氏菌减毒活疫苗预防沙门菌病和作为载体传递外源抗原, 能诱导机体产生粘膜免疫 细胞免疫和体液免疫应答, 是疫苗开发策略中很有潜力的手段 在沙门菌疫苗载体研究领域中最为重要的研究是重组减毒鼠伤寒沙门菌 (St) [10] 重组卡介苗(rBCG) 是牛结核分支杆菌的减毒疫苗 自 1948 年以来全 4

5 球已有 30 亿人接种卡介苗, 其安全性已被证实 它的特点有 :1 可在出生后任何时候接种, 不受母体抗体的影响 ;2 一次接种即可产生持久免疫力, 效力长达 5-50 年 ;3BCG 本身是一种强免疫剂 ;4BCG 是最耐热的活疫苗 ;5BCG 价格低廉, 易于保存, 其产品不需纯化, 可直接用于免疫, 便于生产 同时可将几种外源基因导入 BCG 中, 依靠 BCG 在宿主细胞内的复制和表达, 诱导多种特异性体液免疫和细胞免疫, 进一步扩大了 BCG 的应用范围 志贺菌作为疫苗载体可以有效地逃避内体的作用而直接进入到宿主细胞的胞质 结肠粘膜的淋巴组织为其天然的作用位点, 有可能携带外源抗原刺激机体的全身免疫和粘膜免疫 [11] 乳酸杆菌不仅有多种生理功能, 如控制肠内感染 抗肿瘤活性等, 还能促进小肠局部细胞免疫和体液免疫 乳酸杆菌又是人和动物胃肠中正常存在的菌群, 作为活疫苗抗原递送载体具有很好的安全性 因此, 乳酸杆菌是一种理想的口服基因工程苗的表达载体 乳酸杆菌进入机体的免疫途径不同, 对动物产生的免疫反应也不同, 表达 TTFC 的植物乳酸杆菌经鼻腔免疫和口服免疫均可诱导特异性 TTFC 免疫应答 但鼻腔免疫产生的抗体效价比口服免疫的高 乳酸杆菌研究的新领域之一是利用乳酸杆菌作为口服疫苗的载体 乳酸杆菌将成为口服基因工 [12 程苗的表达载体 13] [14] [15] 此外, 单核细胞增多性李斯特菌 小肠结肠炎耶尔森氏菌 百日咳杆菌等也被用于减毒活菌疫苗运载系统的应用研究中 ( 四 ) 基因疫苗的免疫载体基因疫苗又称核酸疫苗, 包括 DNA 疫苗和 RNA 疫苗, 是将编码某种抗原蛋白的外源基因 (DNA 或 RNA) 直接导入动物体细胞内, 并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白, 诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答, 以达到预防和治疗疾病的目的 因此基因疫苗载体分为 DNA 载体和 RNA 载体 1. DNA 载体常用于构建 DNA 疫苗的载体主要有以下几种 : (1) pcdna3.1/zeo(+/-) 该载体约 5.0 Kb, 能使外源基因在哺乳动物细胞中获得瞬时或稳定表达, 它带有 Zeocin 选择标记, 比 G418 选择标记经济快捷, 具有如下特点 :1 增强子和启动子序列为 CMV, 已证实可获得高水平的表达 ;2 来自于牛生长激素基因的 Poly(A) 尾巴和转录终止序列, 可以增强 mrna 的稳定性 ;3SV40 的病毒复制子可表达 SV40 大 T 抗原 ;4T7 启动子 便于 RNA 转录和外源基因测序 ;5 抗性基因和 ColE1 复制原点使载体可在大肠杆菌中复制 5

6 (2) pbudce4 该表达载体常用于表达融合蛋白, 它带有 CMV 和 EF-1 α 双启动子, 可分别使第一个插入基因和第二个插入基因高水平表达, 高效选择稳定细胞系的 Zeocin 抗性基因, 并在 C 端有两个编码 c-myc 和 V5 表位的融合标签及一个多聚组胺酸序列, 便于重组蛋白的快速检测和纯化 (3) prc/cmv2 和 prc/rsv prc/cmv2 与 pcdna3.1 具有很多相似之处 具有 CMV 启动子 源于 BGH 的转录终止信号 SV40 复制原点 T7RNA 启动子 挽救突变和单链测序的 f1 复制原点, 及在大肠杆菌中选择性扩增的氨苄抗性和 ColE1 复制原点 与 prc/cmv2 不同的是增强子 - 启动子元件为劳氏肉瘤病毒的长末端重复序列 (RSVLTR) 转入哺乳动物细胞中的外源基因表达蛋白水平的高低与许多因素有关, 包括 DNA 拷贝数 转录效率 mrna 加工及其稳定性 转译效率 蛋白质加工, 以及启动子与基因的匹配性 启动子与宿主细胞的匹配情况等 能够高效表达某一抗原基因的表达载体对另一抗原基因的表达也许并不合适 因此必须根据实际情况, 选择合适的表达调控元件, 构建适合的表达载体, 以达到提高基因疫苗的免疫作用 2. RNA 载体最近兴起的 RNA 复制子疫苗, 利用源自 RNA 病毒能够自主复制的 RNA, 实现抗原基因的高水平表达 RNA 复制子的结构蛋白基因由外源抗原基因取代, 保留了非结构蛋白 (RNA 复制酶 ) 基因 RNA 复制酶可使 RNA 载体在细胞质中高水平复制, 从而使外源抗原基因可以高水平表达, 同时诱导细胞免疫和体液免疫应答 大量双链 RNA 可诱导被感染细胞凋亡, 宿主细胞凋亡有利于免疫系统识别外源抗原 将 RNA 病毒基因组结构加以改造, 构建成 RNA 载体, 制备基因疫苗, 可激发比传统 DNA 疫苗更高效的免疫应答 常用于开发 RNA 复制子疫苗的 RNA 病毒载体包括 : 甲病毒 黄病毒 小 RNA 病毒 副粘病毒和杯状病毒等 甲病毒核酸疫苗载体相对研究较多 为了提高甲病毒载体的安全性和稳定性, 根据甲病毒转录 复制和包装特点, 以及原核和真核细胞表达外源蛋白的特点, 现已构建多种形式的甲病毒载体用于目的蛋白的表达 根据表达外源蛋白的方式不同, 可以将甲病毒载体分成三类 : 复制 - 包装型载体 ( 复制型载体 ) RNA 复制子载体 ( 复制缺陷型载体 ) 以及 DNA- RNA 载体 1 复制 - 包装型载体携带编码病毒结构蛋白的亚基因组启动子, 感染宿主细胞后可产生子代病毒颗粒 目的基因插在全长的甲病毒基因组中, 在病毒复制过程中获得表达 有复制能力的病毒颗粒感染宿主细胞后可产生明显的病毒复制 ;2 RNA 复制子载体携带病 6

7 毒非结构蛋白基因 ( 复制酶基因 ) 和外源基因, 与携带病毒结构蛋白基因的辅助载体共同包装成甲病毒颗粒, 由此构建成的甲病毒颗粒具有感染宿主细胞的能力 由于病毒的结构蛋白基因不能表达, 不能产生子代病毒颗粒, 因此只能获得短暂的外源基因表达, 此种复制缺陷性载体又被称之为 自杀性载体 ;3 DNA-RNA 可以将携带病毒复制酶基因和外源基因的重组质粒载体直接转染宿主细胞, 然后由 RNA 聚合酶 Ⅱ 表达序列启动自我复制 RNA 载体的转录, 在宿主细胞内完成外源基因的高效转录与表达 使用这种技术, 甲病毒载体重组质粒 DNA 可被直接用于转染和表达的研究 [16] ( 五 ) 靶向树突状细胞 (Dendritic cell, 简称 DC) 的疫苗载体在感染时,DC 是诱导免疫应答的关键因素 所以疫苗与 DC 之间的作用是决定疫苗免疫效果的重要因素 为防止疫苗与其他不相关细胞结合产生副作用, 疫苗上的 DC 识别分子必须具有 DC 特异性 遗憾的是 DC 特异性识别分子非常少, 而且 DC 细胞的表面受体 (C 型凝集素 清道夫受体 TLRs 和 FcR 等 ) 特异性较差, 识别他们的配体非常广泛 因此, 特异性靶向树突状细胞的疫苗载体的研究为提高疫苗免疫应答和保护性具有重要意义 1. 抗体介导的 DC 靶向最简单的靶向 DC 分子是针对 DC 表面受体的特异性抗体 鼠类模型中已经有几种针对 DC 表面受体的特异性抗体 靶向最多的受体为 DEC-205, 将抗此受体的抗体与抗原交联并加入 DC 成熟刺激因子, 从而实现 DC 靶向, 增加抗原的吞噬, 增强细胞免疫和体液免疫 但是, 在没有 DC 成熟刺激因子的情况下,DC 诱导产生的 T 细胞向 Treg 细胞 ( 调节性 T 细胞,Regulatory cell) 分化, 从而引起机体对交联抗原的免疫耐受 利用这一现象, 有研究使用自身抗原和 DEC-205 抗体交联治疗自身免疫性疾病 唾液酸免疫球蛋白凝集素 (Siglecs) 可以识别多种病原体表面的糖链结构, 促进细胞对病原的吞噬作用 已有多种 Siglecs 被鉴定出来 靶向小鼠的 Siglec-H 和人的 Siglec-5 的抗体可以增强 DC 的吞噬作用 2. 配体介导的 DC 靶向作为抗体靶向的替代品,DC 表面受体的配体也可以介导 DC 靶向 细菌细胞壁上的甘露聚糖可以被 DC-SIGN(DC 特异性细胞间粘附分子 ) 识别, 并增强 DC 对抗原的吞噬 除甘露聚糖外, 其类似物也可以被 DC-SIGN 和甘露糖受体 (CD206) 识别 因此, 甘露糖及其类似物可以作为介导 DC 靶向的物质 甘露糖化的脂质体可以有效的靶向 DC 的 C 型凝集素 实验证明, 加入甘露糖化脂质体的疫苗与单独抗原相比更能促进 DC 的成熟和抗原特异性 T 细胞的产生 最近, 在噬菌体文库中发现一种特异性识别 DC 的短肽 将分泌 DC 特异性短肽与炭疽融合蛋白的重组乳酸杆菌, 口服给药即可引起强有力的免疫应答反应, 保护 7

8 小鼠免受炭疽杆菌的致死性感染 这种短肽配体在 DC 上的受体仍不清楚, 可能与 DC 的吞噬作用有关 3. Fcγ 受体作为潜在的 DC 靶向分子大量的体内外研究证明, 针对 Fcγ 受体 (FcγR) 的靶向抗原可增强体液免疫和细胞免疫应答 但其体内 Fcγ 靶向作用增强细胞递呈和体液免疫的机制仍不十分清楚 在体外实验中, 抗原抗体复合物更能刺激 DC 吞噬抗原, 这种增强作用受 IgG 亚型 抗原效价以及 DC 表面 FcγR 数量的影响 抗原抗体复合物与 FcγR 识别以后可促进 DC 的成熟, 提高 MHC 和 T 细胞共刺激分子的表达量, 增强 CD4 + 和 CD8 + T 细胞的抗原递呈作用 除了增强抗原的摄取能力以外,FcγR 靶向对抗原的处理 递呈及胞内运输可能也具有促进作用 ( 六 )T 细胞疫苗载体 T 细胞疫苗 (TCV) 是用于治疗某些引起自身免疫疾病的 T 淋巴细胞或病毒性疾病的细胞毒 T 淋巴细胞 (CTL) 也就是将引起自身免疫性疾病的自身反应性 T 细胞或导致同种移植排斥反应的同种反应性 T 细胞活化并灭活后作为疫苗, 可诱导机体产生针对致病性 T 细胞或同种反应性 T 细胞的免疫应答, 从而消除或减轻这些细胞的致病作用 研究发现去除 CD25 + 调节性 T 细胞或者中和抗原特异性调节性 T 细胞分泌的免疫抑制性细胞因子可以增强体内外病原特异性反应, 还能加快体内病原的清除 [17] 在注射 Ⅰ 型单纯胞疹病毒的 DNA 或多肽疫苗之前, 用抗 CD-25 的抗体先去除天然调节性 T 细胞可以增强 CD8 + [18] 细胞对病毒的反应 去除 CD25 + 细胞还会促进 IFN-γ 的产生及增强疟疾疫苗对小鼠 [19] 的保护作用 此外, 注射利士曼原虫疫苗前, 用抗 IL-10 受体的抗体处理可以增强该疫苗 [20] 的保护性 这些研究证明调控调节性 T 细胞及其产物可以有效控制天然宿主体内的免疫抑制效应 因此,T 细胞疫苗载体为 T 细胞疫苗的应用提供保障, 但目前研究相对较少 ( 七 ) 其它载体非动物源性免疫载体以其与免疫动物亲缘关系远 水溶性强 价格适中等特点, 一直被尝试用来替代 BSA KLH 人血白蛋白等常规免疫载体 非动物源性免疫载体主要分为植物蛋白和微生物蛋白, 以及非动物源性的大分子多糖或多聚物 目前尝试用于免疫载体的非动物源性分子主要有伴刀豆球蛋白 A 脂蛋白 脂质体 羧甲基纤维素钠 尼龙 聚丙烯酰胺 葡聚糖 聚蔗糖 聚赖氨酸等, 其中聚丙烯酰胺和尼龙膜及 PVDF 膜作为蛋白的固相支持物, 常常与低含量的蛋白一起免疫动物, 可引起机体较强的免疫反应, 在科研领域较多的用在微量蛋白抗血清制备过程中 此外, 一些来源于微生物的蛋白酶类, 之前一直用于催化 8

9 生化反应, 现在也逐渐应用于免疫载体的研究中 但相对而言, 更多微生物来源的分子, 如 脂多糖 类毒素等, 具有较高的增强免疫应答的作用, 而且多数是通过与抗原制成混悬液后 注射入机体, 往往被用于免疫佐剂 第二节免疫佐剂 一 免疫佐剂佐剂 (adjuvant) 一词来源于拉丁语, 原为辅助之意 在免疫学和生物制品学上称为免疫佐剂 (immunologic adjuvant) 传统概念是指当一种物质先于抗原或与抗原混合同时注入机体内, 能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答, 发挥辅佐作用 佐剂的出现, 是因为许多疫苗不能刺激机体产生良好的免疫应答, 有时需要将抗原物质与一类大分子共同使用, 以增强免疫反应 以前, 应用天然蛋白质 糖 脂类复合物及核酸来制备相应的抗体 然而, 现在使用化学合成 生物合成和核酸技术生产的合成抗原, 大部分由于缺乏先天免疫刺激作用, 只具有较弱的免疫原性 因此, 需要与免疫佐剂共同作用, 以刺激机体 [21] 产生较强的免疫应答, 从而确保高质高产及长效的抗体反应 一般情况下佐剂与抗原物质通过物理方式进行混合分散, 共同施用于机体 使用佐剂增强疫苗的免疫反应已有近 80 年的历史 早在 1925 年,Ramon 发现疫苗中加入木薯淀粉 蛋黄素 琼脂 面包屑 白油 化脓性细菌等均可加强白喉 破伤风抗毒素的血清水平 Glenny 发现明矾淀粉可诱导机体对白喉毒素产生较好的免疫作用, 这为铝佐剂的开发应用奠定了基础 二 免疫佐剂的功能与作用 [22] 免疫佐剂可明显增强多糖或多肽等抗原性较弱的物质诱导机体产生特异性免疫应答, 协助抗原以最少量和最少接种次数刺激机体产生足够的免疫应答和高滴度的抗体, 并在血流或粘膜表面维持较长时间, 发挥持久刺激作用 其作用主要表现在可改变正常机体的免疫机能, 吸引大量巨噬细胞吞噬抗原, 并改变抗原构型, 使其降解, 增强其免疫原性 同时, 还可以延长组织内抗原的储存时间, 延缓其降解, 达到缓释作用 还可以促进免疫细胞间的协同作用, 如巨噬细胞与 T 细胞之间,T 细胞与 B 细胞之间相互协同吞噬抗原并产生抗体 免疫佐剂增强免疫应答可能的作用机制主要包括三个方面 : 第一, 抗原递呈 (antigen presentation), 指抗原分子被递呈给 T 细胞的方法 抗原递呈对免疫应答的实质和强度有重要影响 佐剂与疫苗的联合使用, 有助于抗原物质的胞内加工, 使其易被 MHC 分子特异性 9

10 结合 保护 运输, 并递呈给效应细胞 ; 第二, 抗原寻的 (antigen targeting), 指抗原传递给免疫系统中适当效应细胞的效率 免疫佐剂对抗原寻的影响涉及一系列机制, 包括吸引巨噬细胞到达组织部位 活化吞噬细胞 促进抗原与细胞受体的结合等 ; 第三, 免疫调节 (immune modulation), 是指任何可以修饰的免疫效应细胞对抗原或表位进行加工的机制 通过这种机制, 可以改变特异性免疫应答的本质或强度 T 细胞有 Th1 和 Th2 两个亚类 同一抗原和不同佐剂一起使用时, 能够引起不同的免疫反应 因此, 通过筛选特定的佐剂, 可以达到诱导正确免疫应答的目的 三 免疫佐剂的类型由于许多免疫佐剂具有多样的或相似的生物学活性, 还有许多免疫佐剂是多种成分混合制成, 因此佐剂的分类没有明显的界限 例如, 按佐剂物理性质可分为颗粒型佐剂和非颗粒型佐剂 ; 按佐剂的生物学性质, 可分为微生物及其组分与非微生物物质 ; 按佐剂体内存留时间, 则可分为储存型 (depot type adjuvant) 和非储存型 (non-depot type adjuvant) 佐剂 ; 而按出现时间的早晚, 又可分为常规佐剂和新型佐剂 颗粒型佐剂多数属于储存型佐剂, 包括盐类佐剂 油水乳佐剂 免疫刺激复合物佐剂 蜂胶佐剂 脂质体佐剂等 非颗粒型佐剂大多属于非储存型佐剂, 包括肽类佐剂 表面活性分子佐剂 核酸及其衍生物佐剂 含硫复合物佐剂 碳水化合物高分子佐剂 细胞因子佐剂 脂质分子佐剂等 其中铝盐佐剂 油水乳佐剂和蜂胶佐剂等比较常用, 属于常规佐剂 而细胞因子类佐剂 CpG DNA 基因工程减毒毒素 免疫刺激复合物佐剂 脂质体佐剂及 MF59 佐剂等是目前研究的热点, 有些已经开始用于生产实际, 属于新型免疫佐剂 ( 一 ) 常规佐剂 1. 铝盐佐剂 [23] 铝盐佐剂是一类含铝 (Al) 离子的无机盐佐剂, 主要有氢氧化铝胶 明矾和磷酸三钙 氢氧化铝胶, 又称为铝胶 研究表明, 氢氧化铝佐剂能够激活补体, 并提高 MHCⅡ 类分子和共刺激分子的表达, 这些共刺激分子可引起外周单核细胞提高 IL-4 的 mrna 转录水平和 IL-1 TNF 和 IL-6 的表达 铝盐佐剂主要诱导体液免疫应答, 抗体以 IgG1 为主, 刺激产生 Th2 型反应 此外铝盐佐剂可刺激机体迅速产生持久的高水平抗体, 也比较安全 2. 油乳佐剂油乳佐剂作为疫苗佐剂使用已经有几十年历史, 包括矿物油佐剂 非矿物油佐剂 人们最熟悉的矿物油佐剂是弗氏完全佐剂 (FCA) 和弗氏不完全佐剂 (FIA), 它们可以同时诱导体液免疫和细胞免疫 FCA 是在矿物油和乳化剂组成的 W/O 乳液中加入灭活分枝杆菌, 10

11 是强效佐剂, 但毒性较大 不加入分枝杆菌的 FCA 就是 FIA FIA 活性不如前者, 但其毒性较小, 副作用只出现在注射部位 除矿物油外, 其它油脂也可制成油乳佐剂 比较常用的有植物油 ( 如花生油 ) 角鲨烯和角鲨烷等 比较受人们关注的角鲨烷和角鲨烯乳液均是有效的佐剂, 可以提高体液和细胞免疫反应 若添加某些共聚物或胞壁酰二肽等免疫调节剂, 可增强其活性, 并且没有显著的副作用 目前已经研制出一些具有良好理化性质, 且无显著系统或局部副作用的乳剂佐剂, 如 MF59 SAF 和 MontanideISA720 等 3. 蜂胶佐剂蜂胶是蜜蜂采自植物幼芽分泌的树脂, 并混入蜜蜂上腭分泌物 蜂蜡 花粉及其它有机物的一种天然物质, 含有多种酮类 酸类 醇类 酚类 脂类 烯烃和萜类等化合物, 以及多种氨基酸 酶 多糖 脂肪酸 维生素和多种无机化学元素, 是天然的免疫增强剂和刺激剂, 可增强机体免疫功能和促进组织再生, 具有广泛的生物学活性 将其单独或配合抗原注入机体, 既能引起特异性免疫应答, 又能启动非特异性防御机制, 能激活免疫系统和增强免疫球蛋白活性, 增加抗体产量, 增强补体活性和吞噬细胞的吞噬能力 4. 多糖 糖苷及复方中药佐剂目前, 普遍认为多糖是一种良好的生物反应调节剂和无细胞毒性的免疫促进剂 它不仅能激活 T 细胞 B 细胞 巨噬细胞 NK 细胞 TL 细胞等免疫细胞, 还能促进巨噬细胞分泌 IL-1 肿瘤坏死因子(INF) 和 T 淋巴细胞产生 IL-2, 激活白细胞产生干扰素 (IFN), 通过不同途径激活补体系统和网状内皮系统等 黄芪多糖与兔出血症灭活冻干苗合用, 能迅速激活体液免疫和细胞免疫, 并且能长时间维持较高的水平 枸杞多糖 香菇多糖等可增强 T 细胞功能, 当归免疫活性多糖 灵芝多糖等可增强 B 细胞功能 此外, 牛膝多糖不但能增强脂多糖诱导巨噬细胞分泌 TNF-A 的能力, 还能促进腹腔巨噬细胞产生 NO 和提高 NO 合成酶 NOS 的活性 5. 微生物佐剂某些菌体及其组分 代谢产物等均能起到佐剂作用, 这类佐剂有革兰氏阴性菌的脂多糖 革兰氏阳性菌的脂磷壁酸 短小棒状杆菌 分枝杆菌及其组分 酵母菌的细胞壁 白色念珠菌提取物 细菌的蛋白毒素 ( 霍乱毒素 破伤风毒素 ) 等 脂多糖 (lipopolysaccharide,lps) 是革兰氏阴性菌细胞壁的成分, 由多糖和脂质 A 组成 脂质 A 是 LPS 的活性分子, 可促进多克隆 B 细胞的有丝分裂, 还可促进巨噬细胞分泌单核因子 ( 如 IL-1), 并调节巨噬细胞表面免疫相关抗原 (Ia) 的表达 大量实验证明 LPS 具有增强 11

12 机体对细菌 病毒 真菌 寄生虫等的抵抗力和延长体液免疫的作用 LPS 可以单独使用, 也可以结合脂质体使用 脂质 A 去掉一个磷酸基, 形成单磷酸酰脂质 A(MPL),MPL 受体介导激活的抗原呈递细胞可促进单核因子分泌, 抑制 Th2 细胞, 选择性地诱导 Th1 增殖, 分泌 IL-2 和 INF-γ, 并选择性产生 IgG 2 抗体亚类, 降低 LPS 的毒性 霍乱毒素 (CT) 和大肠杆菌不耐热肠毒素 (LT) 是细菌蛋白毒素家族的成员, 它们都是由 A B 两个亚单位组成, 单独的一个亚单位没有活性, 只有结合在一起才具有全毒素的生物学和化学特征 CT 和 LT 都具有较强的黏膜免疫原性和黏膜免疫佐剂效应 短小棒状杆菌为专性厌氧革兰氏阳性小杆菌, 经灭活后可作为佐剂 它能非特异性地刺激淋巴样组织增生, 使单核吞噬细胞系统的吞噬活力加强, 促进 IL-1 IL-2 等细胞因子产生, 增强溶酶体酶的作用, 从传统途径和旁路途径激活补体 分枝杆菌经化学和物理方法处理, 可获得具有佐剂活性的片段, 包括磷壁酰二肽 (MDP) 磷壁酰三肽 (MTP) 蜡质 D 等, 其中对 MDP MTP 的研究较多 MDP 是从分枝杆菌细胞壁提取的一种免疫活性成分, 可刺激免疫细胞如 T 细胞的增殖, 调节及活化单核巨噬细胞, 吸引吞噬细胞, 并增强吞噬细胞和淋巴细胞的活性, 使其易于捕获抗原,MDP 单独使用也可激活机体的非特异免疫防御系统 ( 二 ) 新型免疫佐剂 1. 细胞因子佐剂细胞因子是机体免疫系统受到抗原和各种免疫佐剂激活而产生的一类应答性免疫调节物质, 具有明显的免疫佐剂效应 它们在体内缓慢而持久地释放, 可增强病毒 细菌 寄生虫疫苗的保护效果 细胞因子分为两类, 一类为经典的细胞因子, 包括淋巴毒素 肿瘤坏死因子 (TNF) 干扰素(INF) 等 ; 另一类为对体液免疫和细胞免疫具有调节作用的因子, 例如白细胞介素 (IL) 和集落刺激因子 (CSF), 它们可以促进或抑制免疫应答 在抗原递呈过程中, 粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 将树突状细胞指引到局部输出淋巴结和脾进行抗原加工和递呈 研究表明, 同时服用重组禽痘病毒癌胚抗原 (CEA) 和 GM-CSF, 可以显著提高宿主对 CEA 的特异性免疫应答 此外, 在增强 DNA 疫苗的体液免疫应答方面, IL-12 质粒和粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 质粒表现出佐剂协同效应 2. CpG 佐剂 CpG DNA 是含有非甲基化 CpG( 胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸 ) 基序的脱氧核糖核酸 DNA 在动物体内能诱发强烈的免疫反应, 具有诱导机体非特异性免疫应答 增强抗原特异性免疫应答及调控免疫应答类型 (Th1 或 Th2 型 ) 等作用 12

13 胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸 - 寡聚核苷酸 (Cytosine-phosphate-guanosine oligodeoxynucleotide, CpG-ODN) 是以 CpG 为核心结构的 6 碱基脱氧核糖核酸人工合成结构 研究发现,CpG-ODN 能够显著促进机体特异性及非特异性免疫应答, 是一种高效的 Thl 型疫苗佐剂 它通过膜受体 TLR9 直接激活 DC 和 B 细胞, 上调辅助刺激因子并诱生多种细胞因子, 进而间接活化其它免疫细胞, 并能诱导产生长期效应, 增强免疫记忆功能 3. 补体佐剂补体 C3 是机体补体激活的三大途径 ( 经典途径 替代途径以及甘露聚糖结 - 凝集素途径 ) 交汇点的中心成分, 是宿主免疫防御系统的重要分子 C3d 是补体 C3α 链, 不能被蛋白酶再裂解, 但仍保留与抗原共价连接的最小片段结构 若干 C3d 片段与抗原相连可大大增加免疫原性, 具有分子佐剂作用 4. 脂质体 [24] 脂质体 (LIP) 是由双分子层的单层磷脂或多层可溶性物质分隔而成的具有同心圆结构的人工合成微环体脂质小囊, 可包裹各种物质及疫苗 主要由磷酸类脂 胆固醇 硬脂胺等组成单层或多层双分子夹水结构 在体内趋向于沉积在肝 脾 淋巴结等网状内皮系统中 由于其膜结构致密, 抗原不易漏出能持久的将抗原传递给免疫细胞, 促进抗原对抗原提呈细胞的定向作用 LIP 既无毒性, 又无免疫原性, 在体内可降解, 不会引起类似弗氏佐剂导致的副作用, 是一种优良佐剂 5. 共刺激分子抗原递呈是免疫过程的关键步骤, 需要细胞间相互接触和一系列辅助分子的参与, 以稳定和协调细胞间相互作用 一种相互作用分子是 B 细胞上的 B7-1(CD80) 或 B7-2(CD86) 与 T 细胞上的 CD28/CTLA4 相互作用, 使 T 细胞获得共刺激信号 ; 另一种相互作用分子是 B 细胞表达的 CD40 与活化 T 细胞表达的 CD40 L 相互作用, 介导 T 细胞对 B 细胞的辅助作用, 促进 B 细胞活化 其中 B7-1 B7-2 CD40 为共刺激分子 在 DNA 免疫过程中导入 CD86 能增强 Th 和 CTL 应答,CD80 可适度增加免疫应答水平 6. 超抗原超抗原 (SAg) 是一类特殊的抗原分子, 主要是一些细菌毒素和逆转录病毒基因产物, 不需要抗原提呈细胞的加工处理, 而以完整蛋白质的形式直接与胞膜上的 MHCⅡ 类分子结合形成复合物, 识别 TCR 的 Vβ 片段, 激活 T 细胞并释放大量细胞因子, 对靶细胞产生细胞毒作用 超抗原不需要抗原递呈, 即能激活 CD4 + T 细胞, 其对 T 细胞的激活方式与普通抗原显著不同, 激活 T 细胞的数量显著高于普通抗原 13

14 7. 免疫刺激复合物免疫刺激复合物 [15] (immunostimulating complex,iscom) 是由抗原物质与一种由皂树皮提取的糖苷 Quil A 和胆固醇按 1:1:1 混合后, 自发形成的一种具有较高免疫活性的脂质小泡 ISCOM 是一种全新的抗原递呈系统, 增强机体免疫功能, 具有佐剂和抗原递呈的双重功效 8. 纳米佐剂纳米颗粒通常是大小在 nm 之间的单晶或多晶颗粒 从免疫学观点来看, 纳米佐剂均匀性好, 其包裹或吸附的抗原颗粒正是巨噬细胞 (Mφ) 和 DC 的首选吞噬目标, 为实现机体有效免疫反应完成重要的一步 而且纳米佐剂与多肽抗原或 DNA 疫苗连接后, 可以避免发生常规佐剂的载体效应, 保护抗原, 而且与其他佐剂联用, 效果更好 9. 分子伴侣分子伴侣是指能结合和稳定其他蛋白质, 自身具有不稳定构象异构体的一组蛋白质 通过在体内的结合和释放, 可协助其它蛋白质正确组装 折叠 跨膜转运, 以及降解错误折叠的蛋白质 研究表明, 分子伴侣 HSP70 家族, 伴侣素家族,HSP90 家族等, 除与细胞抗损伤 修复和热耐受等生理过程相关外, 也与免疫反应的抗原递呈和活化有重要关联, 也可用 [25, 26] 做免疫佐剂 10. 抗体作为天然佐剂从 19 世纪 90 年代开始就有报道称抗体可以调节与其形成复合物抗原的抗体反应 所有类型的抗体除了 IgD, 都具有免疫调节功能 IgM IgE IgA 可以增强抗体反应, 而 IgG 具有双重效应, 它可以增强蛋白的抗体反应, 而抑制红细胞的抗体反应 目前研究表明 IgM 和 IgG3 主要依赖补体活化实现它们的佐剂效应, 而 IgG1, IgG2a, IgG2b 和 IgE 主要依赖 FcRs (1)IgM 增强抗体反应 20 世纪 60 年代, 研究发现特定的 IgM 具有增强红细胞抗体反应的能力 小量的 IgM 与亚适量的绵羊红细胞 (SRBC) 共同免疫小鼠导致 SRBC 特定的初级反应和记忆反应增强 IgM 主要增强大分子抗原的抗体反应, 如红细胞 疟原虫和钥孔戚血蓝素 (KLH) [27], 对小 [28] 分子量蛋白如卵清白蛋白 (OVA) 的抗体反应很难增强 (2)IgG 调节的抗体抑制反应 IgG 与红细胞共同免疫, 可以完全抑制红细胞的初级抗体反应, 而辅助性 T 细胞的启动却没有受到影响 [29] 注射抗原后几天再注射 IgG 可以完全终止初级抗体反应 14

15 (3)IgG1, IgG2a, IgG2b 调节的抗体增强反应早期研究表明高免血清, 可能主要包含 IgG 能增强初级抗体反应并诱导免疫记忆反应 因此,IgG 除了作为免疫抑制剂也能增强抗体反应 IgG 调节的免疫反应取决于与 IgG 形成的免疫复合物的抗原结构 一种特定的 IgG 与红细胞共同免疫可以抑制红细胞特定的抗体反应, 而当同种抗体与蛋白共同免疫时可以增强蛋白的抗体特异性反应 IgG 抗体的佐剂效应主要针对蛋白类抗原, 包括 KLH 等 (4)IgG3 调节的抗体增强反应 IgG3 可以增强小分子量蛋白的抗体反应如 OVA 和 BSA [30, 31], 和 IgG1, IgG2a, IgG2b 类似,IgG3 也具有双重效应并能抑制 SRBC 的抗体反应 IgG3 调节体内 CD4 + T 细胞增殖效应非常温和, 体外不能诱导 CD4 + T 细胞增殖 [31] (5)IgE 调节的抗体增强反应 [32, 33] 尽管 IgE 可以导致过敏性疾病, 它的生物学功能也许能防御寄生虫和毒素 IgE 的免疫调节作用最早被发现是因为当特定的 TNP IgE 抗体与 TNP-BSA 共同免疫小鼠诱导产生更高的 BSA 特异的 IgG 反应 抗体反应增强了 100 多倍, 并且初级抗体反应和记忆反应的启动都受到了影响 IgE 可以上调 BSA OVA 及破伤风类毒素的抗体反应, 但对 KLH 或 SRBC 却没有效果 11. 鞭毛蛋白用带有鞭毛的细菌如鼠伤寒沙门氏菌进行免疫发现, 鞭毛蛋白具有活化宿主免疫系统的潜力, 可以作为鸡用疫苗的佐剂 重组疫苗中使用鞭毛蛋白可以激发更强的免疫反应 Chaung [34] 等人研究了沙门氏菌鞭毛蛋白作为 H5N2 禽流感疫苗的佐剂对鸡的免疫保护效果 结果表明免疫后的鸡体内禽流感病毒特异性抗体滴度增大 同样, 用鞭毛蛋白作为空肠弯曲 [35] 菌的佐剂免疫禽类, 结果表明 Ig 的水平明显升高, 而且降低了带菌量 此外, 鞭毛蛋白 [36] 也可用作艾美球虫的佐剂, 预防寄生虫感染 12. SA-4-1BBL 4-1BB(CD137) 受体最早在活化的 CD4 + 和 CD8 + 细胞中发现, 后来发现在多种固有性 适应性及调节性免疫细胞中都能表达 4-1BB 受体 而 4-1BB 的配体 4-1BBL 只在抗原递呈 [37] 细胞如 DC 巨噬细胞和 B 细胞中表达 SA-4-1BBL 是将 4-1BBL 与经过修饰的核心链霉素 (SA)C 末端融合构建而成 据报道,SA-4-1BBL 可以同时促进体外 CD4 + T 细胞和 CD8 + T 细胞的增殖 [38] 而且这种共刺激效应不仅仅局限于体外系统,SA-4-1BBL 作为佐剂用于 OVA 疫苗中可以促进 OVA 特异性 OT-I CD8 + T 细胞及 OT-II CD4 + T 细胞的增殖 [39] 目前, 15

16 SA-4-1BBL 正作为一种新型佐剂用于癌症疫苗的研究中 在小鼠宫颈癌临床模型中, 将 SA- 4-1BBL 与 E (E7 是重要的肿瘤相关抗原 CD8 + T 细胞表位 ) 共同免疫, 可以获得更好的治疗效果 另外, 当 SA-4-1BBL 作为生存素 ( 一种自身肿瘤相关抗原 ) 的佐剂时, 可以更好地治疗表达生存素的 3LL 肺腺癌 [40, 41] 13. 具有佐剂效应的药物红霉素可提高质粒 DNA 免疫小鼠的抗原特异性, 生成 IgG 2a 抗体, 并刺激抗原特异性 CD4 + T 细胞产生 IFN-C 和 CTL 应答 甲红霉素可诱导 NK 细胞杀伤活性和提高 CD8 + 细胞的细胞毒性, 具有诱导 Th 细胞亚群平衡分化的作用 左旋咪唑对鼠感染布鲁氏菌具有免疫增强作用, 它具有拟胸腺激素作用, 可加强白细胞和巨噬细胞的吞噬作用 维生素 E 作为一种细胞内抗氧化剂, 能促进 IgG 的合成, 从而提高机体的抗病能力 因此, 一些具有免疫刺激和免疫增强作用的药物, 与抗原联合用于动物体, 具有增强机体产生免疫应答, 提高抗体滴度的作用, 也被用于免疫佐剂的开发应用中 四 免疫佐剂的应用不同类型的佐剂各具优缺点, 因此其应用也有所不同 例如, 铝盐类佐剂成本低廉, 使用方便, 安全性较好, 已被广泛用做兽用疫苗 乙肝 白喉等重组疫苗的佐剂 其缺点是有轻度局部反应, 可形成肉芽肿, 个别形成局部无菌性脓肿 ; 而且铝胶疫苗怕冻, 冻后铝胶易变性 ; 有可能对人 畜神经系统有影响 ; 主要激活 Th2 免疫细胞, 诱导体液免疫应答, 而诱导细胞介导的免疫应答作用不明显 因此只适用于以抗体为主要保护性免疫的疾病疫苗, 如白喉 破伤风 乙肝 麻疹等 铝盐佐剂中的氢氧化铝胶, 不仅是兽用生物制品最广泛应用的佐剂, 而且还是目前 FDA 唯一批准的可用于人类疫苗的佐剂 弗氏佐剂具有其他佐剂难以比拟的高活性, 所以广泛应用于科学研究中 但其剧烈的副反应限制它的临床应用, 除少数疫苗外, 很少被用于临床医学 与矿物油佐剂相比, 以角鲨烯和角鲨烷为油相的新型油乳佐剂表现出良好的免疫效果和较低的不良反应, 已经成为目前应用研究的焦点 但是, 由于其原料价格较高, 而且 MF59 等佐剂已获得专利, 造成疫苗成本比传统矿物油佐剂疫苗高很多, 也限制了新型佐剂在动物疫苗中的应用 相对而言, 蜂胶和一些中药佐剂, 由于是天然产物, 且本身具有激活机体免疫系统, 提高免疫力的功效, 是一种安全 有效 稳定的候选佐剂, 具有很好的应用研究价值 微生物组分具有良好的免疫应答增强作用, 被广泛用作加强疫苗保护性的佐剂 分枝杆菌在兽用疫苗中应用较为广泛, 如牛分枝杆菌卡介苗, 弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂免疫增强效应的差别主要来自于分枝杆菌成分, 胞壁酰三肽 (MTP) 已应用于疟疾疫苗中并取得了 16

17 良好免疫效果 此外, 霍乱毒素 (CT) 和大肠杆菌不耐热肠毒素 (LT) 与核酸疫苗一起使用, 二者可明显增强针对多种病毒抗原的 Th1 型和 Th2 型免疫应答, 且 LT 的作用强于 CT 双歧杆菌细胞壁的 A3a 肽聚糖可以明显提高鱼用疫苗的保护性效果, 是一种良好的免疫佐剂 CpG-DNA 与犬瘟热病毒灭活疫苗联合应用, 诱导的抗体效价比蜂胶佐剂高 5 倍, 比铝胶佐剂高 7 倍 且诱导产生的免疫效应具有种属差异, 即相同的 CpG-ODN 序列对不同动物的免疫刺激效应不同 补体 C3d 片段能增强抗原免疫应答反应, 降低免疫反应的活化阈值, 使没有免疫原性或者免疫原性较弱的抗原能够刺激机体产生较强的免疫应答反应 因此, C3d 被认为是基因疫苗的有效分子佐剂 但在体内 C3d 分子能否引起炎症反应, 以及 C3d 片段与偶联抗原的最适比例和偶联方式等问题还有待于临床研究的进一步证实 脂质体 (LIP) 与禽多杀性巴氏杆菌荚膜多糖抗原制成的疫苗比用油乳佐剂, 明矾及金黄色葡萄球菌免疫复合物为佐剂的效果好 脂质体与弗氏佐剂或氢氧化铝胶混合使用, 佐剂效果更好 目前, 脂质体和 ISCOM 被认为是制备亚单位疫苗的理想载体和免疫佐剂 ISCOM 已应用于多种细菌 病毒和寄生虫病的疫苗, 且兽用 ISCOM 疫苗已在国外投入市场销售和使用 它具有产生 全面 免疫应答的效力, 可长期增强特异性抗体应答 免疫载体和免疫佐剂是增强抗原物质的免疫原性和机体免疫应答反应, 产生特异性抗体, 提高疫苗保护力的重要辅助成分 就其功能来看, 免疫载体与免疫佐剂既不同又相同, 而且还有交叉 许多分子既可以做为免疫载体, 也可以做为免疫佐剂 一般免疫载体多数与用来免疫的物质通过化学键连接成为一个新的 分子量较大的抗原, 做为一个整体分子施用于机体, 以确保抗原具有免疫原性 即偶联后的抗原做为一个整体才具有完整的免疫原性, 免疫载体给偶联后的抗原提供免疫原性 这常常引起二次免疫应答时出现免疫载体效应, 也就是免疫载体不仅仅单纯起到运送抗原的作用, 而且具有载体特异性 当二次免疫应答接触的抗原是用来免疫的物质与其它载体相偶连的分子时, 载体特异性会造成机体不产生或产生较弱的二次免疫应答, 这种免疫载体效应在半抗原免疫应答过程中表现得尤其明显 而免疫佐剂通常具有广泛增强机体非特异性免疫应答的作用, 通过提高机体免疫易感性和免疫功能, 来增强特异性免疫应答反应, 达到提高疫苗保护力的作用 一般通过物理方法与抗原混合后一起用于机体, 也可先行单独用于机体, 以增加机体的非特异性免疫应答 佐剂的种类繁多, 效果明显 却也存在一些缺点, 如稳定性有待提高, 与抗原结合能力有限等等 而且由于佐剂的制备比较困难, 所以价格较高 随着越来越多生物基因组序列的破译, 必将有更多新的抗原成分被纳入亚单位疫苗的研究中 然而, 亚单位抗原免疫原性的提高往往有赖于有效的 17

18 免疫佐剂 因此, 多来源 多途径开发低廉 高效 速效 长效的新型免疫佐剂, 并探讨其作用机理, 是免疫佐剂研究发展的主要趋势 而既发挥免疫增强作用, 又具有抗原提呈活性的双效佐剂, 是提高疫苗保护力佐剂研究的新方向 ( 任洪林, 冯小丽 ) 参考文献 : [1] Billaud J, Peterson D, Lee B O, et al Advantages to the use of rodent hepadnavirus core proteins as vaccine platforms. Vaccine, 25(9): 1593~1606 [2] Tabrizi C A, Walcher P, Mayr U B, et al Bacterial ghosts - biological particles as delivery systems for antigens, nucleic acids and drugs. Curr. Opin. Biotech., 15(6): 530~537 [3] Ebensen T, Paukner S, Link C, et al Bacterial ghosts are an efficient delivery system for DNA vaccines. J. Immunol., 172(11): 6858~6865 [4] Kudela P, Paukner S, Mayr U B, et al Bacterial ghosts as novel efficient targeting vehicles for DNA delivery to the human monocyte-derived dendritic cells. J. Immunother., 28(2): 136~143 [5] Mayr U B, Kudela P, Atrasheuskaya A, et al Rectal single dose immunization of mice with Escherichia coli O157:H7 bacterial ghosts induces efficient humoral and cellular immune responses and protects against the lethal heterologous challenge. Microb. Biotechnol., 5(2): 283~294 [6] Eko F O, Schukovskaya T, Lotzmanova E Y, et al Evaluation of the protective efficacy of Vibrio cholerae ghost (VCG) candidate vaccines in rabbits. Vaccine, 21(25-26): 3663~3674 [7] Panthel K, Jechlinger W, Matis A, et al Generation of Helicobacter pylori ghosts by PhiX protein E-mediated inactivation and their evaluation as vaccine candidates. Infect. Immun., 71(1): 109~ 116 [8] Eko F O, Lubitz W, Mcmillan L, et al Recombinant Vibrio cholerae ghosts as a delivery vehicle for vaccinating against Chlamydia trachomatis. Vaccine, 21(15): 1694~1703 [9] Riedmann E M, Kyd J M, Smith A M, et al Construction of recombinant S-layer proteins (rsbsa) and their expression in bacterial ghosts - a delivery system for the nontypeable Haemophilus influenzae antigen Omp26. FEMS Immunol. Med. Mic., 37(2-3): 185~192 [10] Soysal A, Millington K A, Bakir M, et al Effect of BCG vaccination on risk of Mycobacterium tuberculosis infection in children with household tuberculosis contact: a prospective community-based study. Lancet, 366(9495): 1443~

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