固体发酵物料可溶性糖和乙醇检测方法研究进展加入 (6000.0±0.1)g 的蒸馏水打开冷却水阀并保证冷却水流量满足冷却要求, 搅拌 30min 从搅拌桶倒出约 300mL 渗出的混合汁, 用筛孔为 0.038mm 的筛网 ( 或滤布 ) 进行过滤, 用 600mL 的锥形瓶收集混合汁滤

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胡钝幸
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1 固体发酵物料可溶性糖和乙醇检测方法研究进展范桂芳, 李佩佩, 齐立松, 仉磊, 李十中清华大学核能与新能源技术研究院, 北京市生物燃料工程技术研究中心, 北京摘要 : 发酵料中可溶性糖与乙醇含量是判断发酵进程的重要指标, 开发糖和乙醇快速检测方法对发酵过程优化与控制非常重要对于固体物料的检测, 通常需要在检测前将固体物料中的糖和乙醇转移到液相综述了固体物料中可溶性糖和乙醇的提取和定量检测方法, 以及用于酒精固体发酵过程监控的近红外光谱定性与定量模型建立情况最后, 对固体物料可溶性糖和乙醇含量的检测技术与固体发酵过程监控技术提出建议关键词 : 固体发酵 ; 可溶性糖 ; 乙醇 ; 提取 ; 检测 ; 近红外光谱 DOI: /j.issn 化石能源逐渐枯竭问题和化石能源燃烧所带来的大气污染问题不容忽视, 因此迫切需要开发清洁与可再生能源 2017 年 9 月, 国家发展和改革委员会国家能源局等十五部门联合印发关于扩大生物燃料乙醇生产和推广使用车用乙醇汽油的实施方案, 指出以生物燃料乙醇为代表的生物能源产业是国家战略性新兴产业, 要求到 2020 年在全国范围内推广使用车用乙醇汽油, 并基本实现全覆盖清华大学核能与新能源技术研究院开发了甜高粱秆固体发酵连续生产乙醇的工艺, 在山东东营建立了年产 3000 吨乙醇规模的示范厂该示范厂需要监测物料发酵进程以判断发酵的异常与否, 并控制合适的发酵时间, 及时将物料转移到蒸馏工段固体发酵与液体发酵相比, 有废水少节省压榨能耗和糖利用率高等优点 [1], 然而要测定固体发酵料中的可溶性糖和乙醇含量, 判断发酵进程, 通常需要第一作者 : 范桂芳, 硕士, 工程师研究方向为生物质转化过程分析 fanguifang@mail.tsinghua.edu.cn 通讯作者 : 李十中, 清华大学核能与新能源技术研究院新能源研究所教授副所长, 北京市生物燃料工程技术研究中心主任, 香港科技大学兼职教授,Biomass and Bioenergy 杂志编辑主要从事先进生物燃料前沿技术研究, 致力于生物燃料技术工程化与产业化, 主持和参与中国生物燃料和生物能源产业路线图设计发展战略及激励政策的制定工作发表论文 100 多篇, 获授权发明专利 18 件 szli@tsinghua.edu.cn 先将可溶性糖和乙醇从固相转移到液相本文对固体物料中可溶性糖和乙醇的提取和检测方法进行了综述, 并对方法的选取和优化提出了建议为了提高工业自动化水平, 实现智能制造, 一些实时在线的检测方法得以被开发, 如近红外光谱 [2] 电子鼻 [3] [4] [5] 生物传感器以及在线质谱等, 这些检测方法有的检测液体, 有的检测顶空气体对于规模较大的发酵罐, 可能会发生因为传质不佳导致采集的样品不具有代表性的问题近红外光谱可以直接对固体进行测量, 且仪器价格相对低廉, 在过程监控中的应用广泛, 本文综述了酒精固体发酵过程中近红外光谱定性与定量模型建立情况, 并对固体发酵过程监控技术进行了展望 1 固体物料中可溶性糖和乙醇提取 1.1 可溶性糖的提取 [6] 孟利等以甜高粱秸秆为原料, 用单因素法考察了料液比浸提温度浸提时间 3 个因素对从甜高粱秸秆中可溶性糖提取量的影响, 确定最佳提取工艺条件为料液比浸提浸提 2h 覃波 [7] 等在传统的蒸煮方法的基础上开发了湿式分解法对甘蔗糖分提取先称取 (2000.0±0.1)g 蔗丝 ( 或蔗渣 ) 样品, 之后, 把蔗丝放进分解机的搅拌桶内, 50

2 固体发酵物料可溶性糖和乙醇检测方法研究进展加入 (6000.0±0.1)g 的蒸馏水打开冷却水阀并保证冷却水流量满足冷却要求, 搅拌 30min 从搅拌桶倒出约 300mL 渗出的混合汁, 用筛孔为 0.038mm 的筛网 ( 或滤布 ) 进行过滤, 用 600mL 的锥形瓶收集混合汁滤液, 并冷却至室温备用该改进方法缩短了糖提取时间, 提高了重现性在微波发生器产生的交变电磁场作用下, 水分子等极性分子排列方向剧烈变化, 分子之间相互磨擦碰撞, 温度迅速上升, 使细胞内部的压力超过细胞壁膨胀所能承受的能力, 细胞破裂后蔗糖分子可以更自由地渗出, 并 [8] 扩散到介质中陈家权等用单因素和正交实验设计考查了微波功率处理时间水料比 ph 等因素对甘蔗糖浸出量的影响, 确定最优提取条件为微波输出功率 80% 提取时间 15min 固液比 1 3 及 ph7.2 采用微波辅助可大幅缩短提取时间, 降低能耗, 节约成本微波功率不宜过高, 处理时间不宜过长, 否则蔗糖将发生转化, 影响提取率超声提取是声波所具有的机械作用热作用和空化作用对固体产生超声促溶, 利于物料中的有效成分转移 [9] 林启训等用单因素和正交实验设计考察了温度时间和超声波输入功率对茶树菇可溶性糖提取量的影响确定最佳工艺条件为提取温度 65, 提取时 [10] 间 35min, 超声波输入功率 100W Mao 等根据甜高粱内部不同结构提出采用两个参数的联合一阶动力学模型对甜高粱秆中可溶性糖的传递进行拟合, 考察了不同颗粒大小搅拌速度温度以及渗透压条件下可溶性糖的传递动力学结果表明较小的颗粒更容易达到平衡, 搅拌速度的增加及浸提温度的升高加快了糖浸出速率, 而随着渗透压的增大, 甜高粱茎杆中糖分浸出速率降低, 不同条件下模型拟合相关系数在 ~ 乙醇的提取固体发酵渣中乙醇的提取法有蒸馏法和固液萃取法 (1) 蒸馏法取若干固体发酵料, 添加适量去 [11] 离子水, 蒸馏, 准确收集馏分耿欣等和岳元媛 [12] 等用简单蒸馏法分别提取了甜高粱发酵渣和白酒 [13] 发酵糟醅中的乙醇此过程耗时约 30min Li 等在不同蒸汽流量与不同物料填充量条件下研究了乙醇固体蒸馏的动力学, 结果表明乙醇固体蒸馏遵循拟一级动力学方程 [14] (2) 固液萃取法 Canabarro 等考察了温度固液比和旋转速度对甘蔗发酵渣中乙醇提取率的影响, 结果表明 30 固液比 40%( 质量分数 ), 乙醇初始浓度 10%( 质量分数 ) 和旋转速度 100r/ min 时, 获得的乙醇回收率最高, 为 81.3% 动力学数据表明 10min 内乙醇浓度达到平衡当固液比为 0.1% ~ 0.4%( 质量分数 ) 时, 回收率可达到 99.8% [15] 2 可溶性糖和乙醇检测方法 2.1 可溶性糖的检测可溶性糖的检测方法有旋光法 [16] 气相色谱法 [17-18] 液相色谱法 [19] 分光光度法 [20-21] 流动分析法 [22-24] [25] 化学滴定法等下面对各种方法进行简单介绍 (1) 旋光法当线偏振光通过某种透明旋光物体时, 线偏振光的振动面将旋转一定的角度, 偏转角度与溶液浓度成正比, 因此可以通过测量溶液的旋光度来确定溶液的浓度 (2) 气相色谱法色谱分离利用不同组分在流动相与固定相之间分配系数不同, 在色谱柱中经反复吸附脱附而实现分离, 该方法能分别检测各组分的浓度, 气相色谱采用气体作为流动相由于糖分子本身不易气化, 因此进行气相色谱分析时, 必须先将其转化成易挥发对热较稳定的衍生物徐桂 [17] 云等开发了针对多糖中 11 种单糖的检测方法蔡 [18] 凯等开发了针对烟草中 4 种可溶性糖的检测方法 (3) 液相色谱检测法液相色谱法是用液体作 [19] 为流动相的色谱分离与检测方法姜艳等开发了针对菌群降解纤维素的发酵液中纤维二糖葡萄糖乙醇丁醇甘油乙酸与丁酸的检测方法 (4) 分光光度法利用一定波长下, 物质对光的吸收与显色溶液浓度成正比进行定量检测, 该方法 [20] 灵敏度高, 根据显色剂的不同分为斐林试剂法和 [21] DNS 比色法等 (5) 流动分析法基于分光光度法的检测原理, 通过泵对溶液进行传输, 完成自动采样溶液混合显色与检测过程数据输出软件编入了基线校正等功能, 能修正分光光度计因长时间运行产生的检测信号单方向漂移 (5 月 ) 生物产业技术 51

3 (6) 化学滴定法利用斐林溶液与还原糖共沸, 产生氧化亚铜沉淀的反应, 以次甲基蓝为指示液, 以样品或经水解后的样品滴定煮沸的斐林溶液, 稍微过量的还原糖将次甲基蓝的蓝色还原为无色, 以示终点根据样品消耗量求得总糖或还原糖的含量 [25] 几种糖分析方法检测时间相对误差仪器成本优缺点的对比见表 1 对于固体发酵工厂中糖的分析, 化学滴定法的检测速度快精度较高, 是首选的分析方法, 但是检测低浓度的样品误差较大如果需要检测低浓度的糖, 可以考虑分光光度法, 但是该方法工作曲线线性范围窄, 操作较为繁琐如果待测样品数量大, 可以考虑流动分析法, 能极大节省人力滴定法分光光度法和流动分析法都需要将非还原性糖水解为还原性糖, 其中流动分析仪可以实现操作的自动化如果对检测速度无要求, 可以考虑液相色谱法, 该方法可以同时对发酵过程中原料产物及副产物进行检测, 以辅助判断发酵是否异常 2.2 乙醇的检测以下分蒸馏得到的馏分固相检测和固液萃取液几种情况介绍乙醇的检测方法对于馏分中酒精含量, 国标 GB/T [26] 推荐密度瓶法和酒精计法, 这两种方法都是利用不同浓度乙醇密度不同的原理检测, 不需要化学试剂, [27] 但是精度较低 ; 虞精明等综述了酒中乙醇含量的检测方法, 包含密度瓶法折光率法酒精计法化学氧化法分光光度法荧光光度法气相色谱法激光拉曼光谱法近红外光谱法和微生物电极法 [28] 对于固体物料, 曾诗雨等建立了顶空固相微萃取 - 气相色谱法, 用于测定全麦酒酿中乙醇含量该方法操作简便快捷样品用量少灵敏度高结果准确重现性好, 适用于全麦酒酿等多种酒酿中乙醇含量的测定对于固液萃取溶液, 溶液里含有糖醇等多种组分, 其中糖不容易挥发, 宜用液相色谱法, 可实现多种组分同时检测 [19] 乙醇能够气化, 采用气相色谱法无需衍生化, 且分离时间短因此, 气相色谱法是操作便利精度高用时较短的乙醇检测方法 3 近红外光谱快速检测法在固体发酵过程中模型建立情况近红外光谱具有检测速度快在绝大多数物质中有吸收容易实现在线检测等特点, 是过程监测与控制技术的主流方法, 但是近红外光谱吸收强度低吸收谱带宽光谱特异性不强通常采用多个波长的吸光度并借助化学计量学进行多元回归, 得到定量检测模型乙醇在 4406cm cm -1 附近有明显近红外吸收 [29-30], 为乙醇的近红外光谱定量检测提供了依据 3.1 定性模型开发定性模型的开发采用有监督的模式识别法 Fan [30] 等用主成分判别分析法对甜高粱秆固体发酵的初始期指数增长期和稳定期三个阶段的样品进行识 [31] 别, 识别率为 97.4% Jiang 等用偏最小二乘判别分析 (PLS-DA) 反向传播神经网络(BPNN) 支持向量机 (SVM) 极限学习机(ELM) 建立了固体发酵不同阶段的识别模型, 其中基于 ELM 算法的识别模型最优, 在验证过程中识别率达到了 92.6% ; 表 1 几种糖分析方法的对比分析方法检测时间 /min 相对误差 /% 仪器成本 / 万元优点缺点参考文献旋光法易操作快速精度低不适合测混合糖 [16] 气相色谱法 ~ 15 精度高能测混合组分前处理复杂检测时间长 [18] 液相色谱法 ~ 25 精度高前处理简单能测混合组分分光光度法 ~ ~ 8 精度高检测时间长 [19] 样品稀释与显色人力投入大易引入误差 [20-21] 流动分析法 ~ ~ 35 精度高快速不能给出不同组分的含量 [22-24] 化学滴定法精度较高快速人力投入大判断滴定终点时易引入人为误差 [20] 52

4 固体发酵物料可溶性糖和乙醇检测方法研究进展 [32] Jiang 等还用线性判别分析 (LDA), K 近邻判别分析 (KNN) 和 SVM 算法建立了正常和异常发酵样品的识别模型, 研究表明 SVM 建立的识别模型最有效, 在验证过程中识别率达到 96.3% 开发定性模型有助于快速判别固体发酵阶段和状态 3.2 定量模型开发 [33] 杨维旭等改进了近红外光谱 DA7200 的光谱采集附件, 在酒精发酵过程的液化糖化发酵工序中, 用偏最小二乘法 (PLS) 建立了液化醪中还原糖锤度, 糖化醪中还原糖锤度挥发酸和发酵醪中还原糖酒分挥发酸 ph 葡萄糖(DP1) 麦芽糖 (DP2) 麦芽三糖(DP3) 低聚糖( 四糖 ~ 十糖 ) 果糖阿拉伯糖丁二酸乳酸乙酸 [30] 丙三醇甲醇乙醇的定量模型 Fan 等用 PLS 法建立了甜高粱秆固体发酵料中 ph 糖乙醇和水 [34] 含量的定量模型 Ouyang 等开发了一种便携式紫外可见和近红外光谱仪, 并用组合区间偏最小二乘法 (Si-PLS) 建立了米酒发酵过程中总糖乙醇 [35] 和 ph 的定量模型 Li 等用 PLS 法建立了固体发酵物料中水分生物质和纤维素酶的定量模型定量模型建立后能够实时在线获得待测的物质量模型的质量受检测方法精度光谱仪器稳定性光谱采集方式变量选择与回归算法选取的影响 4 结语 1 固液萃取能有效提取固体物料中的可溶性糖和乙醇糖和乙醇的传质受颗粒大小搅拌速度提取温度的影响微波能促进传质, 缩短提取时间至 15min, 还可以进一步优化传质条件, 减少固液萃取时间 2 化学滴定法是检测糖比较准确快速和成本低的方法 ; 气相色谱法是检测乙醇的准确较快速和成本较低的方法 ; 流动分析法仪器成本较高, 但是可以极大节省人力 ; 液相色谱法仪器成本也较高, 但是可以同时检测糖乙醇及其他副产物 3 近红外光谱可以实现实时检测, 但是预测精度与传统检测方法比还有差距, 可以在一定精度范围内实时判断发酵进程需要通过提高检测方法精度仪器稳定性, 优化变量选择与回归算法来进一步提高近红外光谱模型质量参考文献 [1] LI S Z,LI G M,ZHANG L,et al. A demonstration study of ethanol production from sweet sorghum stems with advanced solid state fermentation technology[j]. Applied Energy,2013,102: [2] SKVARIL J,KYPRIANIDIS K G,DAHLQUIST E. Applications of near-infrared spectroscopy(nirs)in biomass energy conversion processes:a review[j]. Applied Spectroscopy Reviews,2017,52(8): [3] JIANG H,ZHANG H,CHEN Q S,et al. Recent advances in electronic nose techniques for monitoring of fermentation process[j]. World J Microbiol Biotechnol,2015,31: [4] 冯东, 王丙莲, 梁晓辉, 等. 生物传感器在纤维素乙醇测定中的应用 [J]. 2011,27(s1): [5] 黎亮, 张嗣良, 庄英萍, 等. 在线质谱仪在工业发酵过程优化与放大中的应用 [J]. 分析仪器,2012,4: [6] 孟利, 刘峰, 付海燕, 等. 甜高粱秸秆中可溶性糖提取及组成分析 [J]. 哈尔滨商业大学学报 ( 自然科学版 ),2015,31(2): [7] 覃波, 兰芳. 一种新的甘蔗蔗糖分测定方法 [J]. 广西蔗糖,2008,2: [8] 陈家权, 穆星宇, 廖子夙, 等. 微波辅助提取甘蔗糖分的工艺研究 [J]. 食品与机械,2008,5:57-59,66. [9] 林启训, 邱蕊, 毛延妮. 超声提取茶树菇可溶性糖的影响因素及优化 [J]. 福建农林大学学报 ( 自然科学版 ),2009,38(3): [10] MAO Y Y,LI J H,LI S Z,et al. The mass transfer of sugar in sweet sorghum stalks for solid-state fermentation process[j]. Fuel,2015, 144: [11] 耿欣, 李天成, 李十中, 等. 甜高粱茎秆固态发酵制取燃料乙醇过程分析与中试研究 [J]. 太阳能学报,2010,31(2): [12] 岳元媛, 向文良, 张文学, 等. 白酒发酵糟醅中残酒精含量检测方法的探讨 [J]. 中国酿造,2005,7: [13] LI G M,LI J H,LI S Z,et al. Extraction of bioethanol from fermented sweet sorghum bagasse by batch distillation[j]. Korean J Chem Eng,2017,34(1): [14] CANABARRO N I,SOARES J F,CORREA J V,et al. Optimization of solid-liquid extraction of ethanol obtained by solid-state fermentation of sugarcane bagasse[j]. Latin American Applied Research,2015,45(1): [15] CANABARRO N I,ALESSIO C,SOARES J F,et al. Optimization of solid-liquid extraction of ethanol obtained by solid-state fermentation of sugarcane bagasse[j]. Blucher Chemical Engineering Proceedings, 2015,1. DOI: /chemeng-cobeq [16] 黄曙江. 一种糖溶液旋光度的测量方法和不确定度分析 [J]. 计量与测 (5 月 ) 生物产业技术 53

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材料导报研究篇年月下第卷第期种球的制备单步溶胀法制备分子印迹聚合物微球洗脱处理种子溶胀聚合机理种球用量的影响

材料导报研究篇年月下第卷第期种球的制备单步溶胀法制备分子印迹聚合物微球洗脱处理种子溶胀聚合机理种球用量的影响水相中组氨酸单分散分子印迹聚合物微球的合成表征及其识别性能研究李思平等李思平徐伟箭较佳工艺条件下在水性体系中选用无皂乳液聚合法制得的单分散微米级聚苯乙烯微球为种球分别以组氨酸甲基丙烯酸或丙烯酸胺乙二醇二甲基丙烯酸酯为模板分子功能单体和交联剂合成了组氨酸分子印迹聚合物微球研究了形貌粒径及其分布以及模板分子与功能单体之间的相互作用分别以激光粒度分析仪紫外分光光度法和红外光谱表征功能单体与交联剂之间的共聚情况