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1 植物生产层 草 业 科 学 卷 期!"! 扁穗牛鞭草组织培养中褐化控制技术初探 徐耀华 杨春华 刘晓波 蒋新民 四川农业大学动物科技学院草业科学系 四川雅安 $%& 摘要 以雅安 扁穗牛鞭草 ' 幼茎诱导的愈伤组织为试验材料 探讨了 种抗褐化剂 活性炭 聚乙烯吡咯烷酮 抗坏血酸 ' 以及不同继代培养周期和培养温度对扁穗牛鞭草愈伤组织褐化控制及愈伤组织生长状况的影响 结果表明 向培养基中添加 和低浓度的 能有效降低褐化率并促进愈伤组织的生长 其中以 的效果最好 和 的效果次之 ' 抗褐化性能较差 以 为一个继代培养周期 愈伤组织的褐化率最低 培养室温度控制在 () 左右 既可有效降低愈伤组织的褐化率 又不影响愈伤组织的生长 关键词 扁穗牛鞭草 愈伤组织 褐化控制中图分类号 *+,& %& -, 文献标识码 文章编号.$,..$ 扁穗牛鞭草 为禾本科黍亚科牛鞭草属暖季型多年生根茎型草本植物 其具有生长速度快 再生能力强 产量高 适口性好 适应性广 抗逆性强等优良特性 是南方地区栽培草地建植 草山草坡改良和生态恢复重建的主打草. 种 扁穗牛鞭草花粉活力低 自然结实能力 差 有性繁殖选育新品种难度较大 通过组织培养可以加快新品种选育速度 但扁穗牛鞭草在组织培养过程中愈伤组织的褐化现象比较严重 褐化又称褐变 包括酶促褐变和非酶促褐变 目前普遍认为植物组织培养中的褐变主要是由多酚氧化酶和过氧化物酶将外植体中的酚类化合物氧化形 &.% 成醌引起的 向培养基中添加抗氧化剂和吸附 $.&.& 剂 对外植体进行预处理 调节培养基中无 % 机盐的浓度或控制培养条件如缩短继代培养周 $.* 期 选择适宜的培养温度 黑暗培养等都可以有效控制褐化 在组织培养中外植体及愈伤组织褐化不仅影响愈伤组织的诱导和生长 严重的甚至导致外植体和愈伤组织死亡 褐化是限制扁穗牛鞭草大规模组织培养的主要因素 而关于扁穗牛鞭草组织培养褐化的相关研究较少 为此 本研究分析了培养基中添加抗褐变剂 继代培养周期及培养温度对扁穗牛鞭草组织培养中褐化的影响 旨在探讨有效抑制扁穗牛鞭草愈伤组 织褐化的方法 材料与方法 试验材料 供试材料为 雅安 扁穗牛鞭草 ' 幼茎 来自四川农业大学草业科学系科研基地 培养基 基本培养基为 / 培养基 蔗糖 琼脂 %* 01 值 %* 诱导和继代培养基均为 / - &. 试验方法 愈伤组织的诱导 晴天 左右采集 雅安 扁穗牛鞭草的幼茎带回实验室 流水冲洗 在超净工作台上用 % 的酒精表面消毒 无菌水漂洗 次 然后用加有几滴吐温的 的升汞溶液处理 * 无菌水漂洗 % 次 最后用无菌滤纸吸去材料表面的水分 用手术刀和镊子剥出幼嫩茎段并切成约 %' 长的小段 接种于诱导培养基 每个三角瓶接种 % 段 共接种 & 瓶 后进行继代培养 培养条件为温度 %() 暗培养 不同抗褐化剂的使用 选取长势良好且一致的愈伤组织分别接种到含有不同质量浓度的活性炭 聚乙烯吡咯烷酮 抗坏血酸 ' 的继代培养基中 以不加抗褐化剂为对照 其中 和 的质量浓度分别设为 和 & 收稿日期.,. 接受日期.. 基金项目 现代农业产业技术体系 牧草 2... 专业资金作者简介 徐耀华,*$. 女 河南许昌人 在读硕士生 主要从事草地生态与草坪研究. " %%%,33'! 通信作者 杨春华,$,. 女 四川平武人 教授 博士 研究方向为草地生态与草坪. " 4' ' 56 5'

2 草 业 科 学 第 卷 期 ' 的质量浓度分别设为 %% 和 每瓶接种 块愈伤组织 每个处理接种 瓶 重复 次 温度 %() 暗培养 后 统计愈伤组织的褐化率 每 观察一次愈伤组织的褐化现象和生长状态 愈伤组织的褐化程度采用目视法 共分为 % 级 用 - 表示 - 越多 表示褐化程度越严重 不同的继代培养周期 设计 & 个不同的继代 培养周期 % 和 其它条件相同 暗培养 $ 后统计愈伤组织的褐化率 每 观察一次愈伤组织的褐化现象 每个处理接种 瓶 重复 次 不同的培养温度 设置 & 个水平的培养温度 ((%( 和 () 其它培养条件一致 暗培养 后 统计愈伤组织的褐化率和生长状态 每个处理接种 瓶 重复 次 表 不同抗褐化剂对雅安 扁穗牛鞭草愈伤组织抗褐化的影响! "!!!!! $! % "!!! " $ & '! 处理 对照! 87!" 添加浓度 '! '6 87 8! & 愈伤组织生长态 6 7!9 8 86!:' "5 生长缓慢 多黑褐色 "!9 7!9!76 " ' 7!9 生长迅速 淡黄色 颗粒状 8 7!9 46"!9 7 5" 7 生长迅速 淡黄色 颗粒状 8 7!9 46"!9 7 5" 7 生长速度一般 米黄色 湿润 /! !9 6 6! 8 生长相对缓慢 米黄色 湿润! "4"!9 7!9 6 6! 8 生长迅速 淡黄色 颗粒状 8 7!9 46"!9 7 5" 7 褐化率 7 86 褐化程度 & ---- %$ - 6 -,, ' -- %,; -- %6 - 褐化持续时间 57 8! 从第 % 天开始一直持续 "6 6 7"4 : 6 4 '! 8 56 从第 天开始出现一直持续到 "6 6 7" '! " 速度一般 米黄色 致密 /! !9 '! 0 '8 46"!9 相对缓慢 黄色或黄褐色 疏松! "4"!9 7!9!:8 46"!98!8 9 4, -- ' --- 主要集中在接种后前 "4 '!. ' : :867 5'8! & 生长缓慢 部分死亡 "!9 7!9 0 78!: % % 生长缓慢 黑褐色 疏松 "!9 7!9!:8 " '. 7!9 &$; ---- ' % 生长慢 黄褐色 疏松 "!9 7!9!: 生长慢 黄褐色 疏松 "!9 7!9!: 生长慢 黑褐色 疏松 "!9 7!9!:8 0! 4 " '. 7!9 &% ' ----, ' ---- &$; ' ---- 从第 % 天开始一直持续到培养结束 ;6 :7! 8 6 % "8!8 66!: 8 6'5"8576 注 同列不同字母表示差异显著 大写字母代表 水平 小写字母代表 % 水平 下表同!86 :676 8' 0 8 " "!967" '!"5!9 : ' '6 :676 ' %"6 6"76 06'. 8 6" "!9

3 &!"! 结果与分析 抗褐化剂对愈伤组织褐化的影响 在原培养基上继代培养 愈伤组织褐化严重 生长缓慢 多黑褐色 培养满 个月褐化率达到 & 添加了吸附剂 后 愈伤组织的褐化程度极显著降低 褐化进程趋缓 愈伤组织生长快且多表现为淡黄色干燥的颗粒状 表 图 添加低质量浓度的 对扁穗牛鞭草愈伤组织的褐化也有极显著的抑制作用 褐化持续时间短 生 长速度快 但高质量浓度的 却在一定程度上加重了愈伤组织的褐化 特别是在 & 处理下 愈伤组织褐化率甚至超过对照 添加抗氧化剂 ' 对扁穗牛鞭草愈伤组织抗褐化作用多不如 和 本试验所研究的 种抗褐化剂中 以 的抗褐化效果最好 添加量为 时 愈伤组织的褐化率和褐化程度最低 生长速度快 愈伤组织品质好 图 不同处理对扁穗牛鞭草愈伤组织褐化控制及生长的影响!!!! % "!!! " $ & '!

4 草 业 科 学 第 卷 期 % 不同继代周期对愈伤组织褐化的影响 随着继代培养周期的延长 愈伤组织的褐化率逐渐增加且差异极显著 表 图 在继代周期为 和 % 的处理中 只要在转接过程中将褐化部分切除 一部分褐化即可被抑制 其中以 为一个继代培养周期 褐化率最低 但在继代间隔为 和 的处理中 愈伤组织大多在可抑制的时间里没得到良好的处理 而直接导致整块愈伤组织完全褐化 进而丧失分化能力 不同培养温度对愈伤组织褐化的影响 在不同的培养温度下 褐化主要集中出现在接种后 的 % 内 % 后基本上无新的褐化出现 随培养温度升高 褐化情况逐渐严重 表 图 愈伤组织在 () 环境中培养 褐化率虽然最低 但愈伤组织生长缓慢 且多为水渍状 在 () 处理中 愈伤组织生长迅速且大多为表面干燥的颗粒状 褐化率低于 % 在 %() 处理中 愈伤组织大多为表面干燥的颗粒状 但生长缓慢且褐化率大于 在 () 处理中 愈伤组织的褐化率出现明显的陡增 达到了 $*$& 综合愈伤组织的生长状况和褐化率 本研究认为 () 是较为适宜的培养温度 表 不同继代周期对雅安 扁穗牛鞭草愈伤组织抗褐化的影响! & & &! $! % "!! & '! 继代周期 5 '5"8576 '4'"6 愈伤组织长势 6 7!9 8 86!:' "5 褐化率 7 86 褐化程度 % 生长良好 淡黄色 致密 /!76!7!5 '! 0 '8 46"!9 生长良好 淡黄色 致密 /!76!7!5 '! 0 '8 46"!9 生长一般 黄褐色 增多 /! ! '76 6 褐化严重 黑褐色 增多 有些已经致死 67!5 7!9 " '. 7!9 '76 6! ,*$ - *, ' --,; --- %$ 表 不同培养温度对雅安 扁穗牛鞭草愈伤组织抗褐化的影响! & & &! $! % "!! & '! 培养温度 5" ) 愈伤组织长势 6 7!9 8 86!:' "5 褐化率 7 86 褐化程度 ( ( %( ( 生长缓慢 乳白色 水渍状 "!9 7! ! "5 0!:.9 86 生长迅速 黄色 干燥 颗粒状 8 7!9 46"! " 7 生长缓慢 黄色 干燥 颗粒状 "!9 7!9 46"! " 7 生长缓慢 湿润 疏松 黑色 黑褐色 "!9 7!9!:8 0! 4 " '. 7!9 8! " ' $% - &* ' - %&; -- $*$& 讨论与结论在扁穗牛鞭草组织培养过程中 特别是在继代培养过程中 愈伤组织褐化问题比较突出 其原因可能有两点 一是扁穗牛鞭草体内含单宁过多 这个 现象在愈伤组织初代诱导过程中表现特别突出 外植体在切开 内即可观察到切口有大量的褐色分泌物堆积 二是扁穗牛鞭草体内含酚类物质较多 且生长速度较快 在培养过程中 若不及时转

5 $!"! 接 愈伤组织生长过程中分泌的酚类物质堆积在培养基中 容易造成褐化 活性炭是一种常用的吸附剂 它主要吸附非极性分子和色素等大分子 能吸附愈伤组织在培养过程中分泌的酚 醌类物质 从而减少有害物质的堆, 积 降低褐化率 曾有报道称 活性炭在培养基中添加的量为 % 时 能够明显减少高粱! 幼胚产生的酚类物质 本研究结果表明 吸附剂活性炭对扁穗牛鞭草的褐化现象有显著的抑制作用 与对照相比褐化率有明显的 $., 降低 且褐化比对照出现得晚 与前人的试验结果一致 其中 的活性炭防褐化效果最好 但在杉木 "!! 的愈伤组织培养中 活性炭不仅不能抑制褐化现象的发生 反而加剧了褐化程度 可能是因为高浓度的活性炭在吸收酚类物质的同时 也吸收了培养基中的营养物质 导致培养基渗透压改变 褐化加重 聚乙烯吡咯烷酮是酚类物质的专一性吸附剂 常用来吸附酚类物质和细胞器的保护剂 低浓度的聚乙烯吡咯烷酮对扁穗牛鞭草愈伤组织的褐化也有 较好的抑制作用 与肖莉杰等 李萍等的研究结果一致 抗坏血酸为多羟基还原物质 一方面可以使多酚氧化酶失活阻止酚类物质氧化 另一方面抗坏血酸在酶的催化下能消耗溶解氧 使酚类物质因缺氧 而无法氧化 前人的研究表明 抗坏血酸对一些,. 植物的褐化有较好的抑制作用 而对另一些植物的褐化并没有明显的抑制作用 有的甚至还加剧了外植体或愈伤组织褐化且随浓度增加更严 * 重 本研究中抗坏血酸对扁穗牛鞭草愈伤组织的防褐化效果不佳 另有研究表明 低浓度的抗坏血酸可以抑制白玉兰 $!%% 愈伤组织 和蒙古黄芪 &! '! 愈伤组织 的褐化 陈红 & 和张绿萍的研究表明把外植体浸泡在抗坏血酸溶液中进行预处理可以达到较好的防褐化效果 直接加入培养基效果却不佳 可能是因为较高浓度的抗坏血酸直接加在培养基中 在高温高压消毒过程中 抗坏血酸结构破坏导致活性丧失或产生了有毒有害物质 致使培养物褐化程度加重 培养周期对扁穗牛鞭草愈伤组织的褐化率有显 著影响 随培养时间的延长 醌类物质不断积累 褐化现象逐渐严重 及时更换新鲜的培养基 切除褐化部分 减少醌类物质的积累即可达到很好的防褐化效果 但培养时间过短 对愈伤组织的生长不利 因此以 为一个培养周期 效果较佳 与蒙古黄 氏组织培养试验结果一致 在野牛草! %! % 的组织培养中发现 继代周期缩短至 % $ 可有效防止愈伤组织的褐化 培养温度对扁穗牛鞭草愈伤组织的褐化现象影响很大 褐化率随培养温度的升高而急剧增加 特别是达到 ) 时褐化现象非常严重 温度主要通过影响多酚氧化酶 的活性影响酚类物质的氧 化 进而影响褐化程度 赵伶俐等的研究结果显示 温度越高 多酚氧化酶活性越强 总酚含量越高 蝴蝶兰! 的褐化率越高 其中在 ) 时褐化率最低 紫花苜蓿 $% 转基因再生过程中不同季节不同温度对愈伤组织褐化情 * 况影响也较大 外植体的种类 基因型 生理状态 营养状况 生长部位 取材季节以及培养基 无机盐浓度 添加植物生长调节剂的种类和浓度 抗褐化剂的种类和浓度 培养条件等都会影响褐化率 抑制褐化发生的措施也多种多样 但每种方法都有一定的适用范围和局限性 所以应根据培养物的实际情况结合试验选择合适的方法 更加有效地抑制或减轻组织培养中褐变的发生 减轻培养物的损失 在扁穗牛鞭草愈伤组织的继代培养基中添加 的活性炭 继代 次 () 的环境中培养可以起到很好的防褐化效果 参考文献 王显 牧草栽培学 / 北京 中国环境科技出版社 * 杨春华 张新全 李向林 等 牛鞭草种质资源及育种研究 草业学报 &. 傅仙桃 杨春华 陈灵鸷 等 广益牛鞭草花粉特性及结实性研究 草业学报 * $.$ & 许传俊 李玲 蝴蝶兰外植体褐变发生与总酚含量 和 的关系 园艺学报 $ & $.$& %16 5!2 6! 6!70!"! 4!' 6 ' " '6 7!9 ' " :7!

6 草 业 科 学 第 卷 期 40!'!84" " 8 6" "8576,,*. $ 吕宗友 苏衍青 赵国琦 等 不同的防褐化措施对苏丹草愈伤诱导及抗褐化的有效研究 草业学报 &.* 肖莉杰 王丽艳 闵丽 等 玉米成熟胚愈伤组织诱导及褐化控制研究 玉米科学,&.& * 刘真华 葛红 蝴蝶兰组织培养中的褐化控制研究 园艺学报 %&.&, 王小敏 吴文龙 李海燕 等 黑莓外植体褐化影响因素分析及适宜培养条件筛选 植物资源与环境学报,* $.$* 陈剑勇 杉木愈伤组织培养中的褐化控制研究 亚热带植物学 & &.&, 赵庆芳 韩静 刘静 等 蒙古黄芪愈伤组织诱导及褐化抑制 西北师范大学学报 自然科学版, &%. 李萍 成仿云 张颖星 防褐剂对牡丹组培褐化发生 组培苗生长和增殖的作用 北京林业大学学报 *.$ 周丽艳 郭振清 秦子禹 等 白玉兰组织培养中的褐化控制 河北科技师范学院学报 *&,. & 陈红 张绿萍 不同处理对刺梨花药愈伤组织诱导及褐变的影响 北方园艺 * %. % 王维旭 张骥诚 刘学群 等 微量元素对籼稻品种愈伤组织诱导和褐化的影响 华中农业大学学报, $.* $ 赵丽君 王雪芳 王锁民 等 植物组织培养及其在草类作物中的研究和应用 草业科学 *$ &.&* 赵伶俐 葛红 范崇辉 等 蝴蝶兰组培中 01 和温度对外植体褐化的影响 园艺学报 $$.$ * 李云霞 马晖玲 成慧 紫花苜蓿基因转化组织再生过程中褐化因素的分析 中国草地学报 & $,.&, 刘用生 李友勇 植物组织培养中活性炭的使用 植物生理学通讯,,&& & " 64 /! 7! ' :!7 8!!:!7 5! /!6 ' 5 07! 6 87! ! 4 86 " 8 6" "8576, %%.$& 陈惠娟 植物组织培养中褐变的产生机理及克服措施 植物保护 %,.* '&! $! (! & "!!! & 2! !.! !: 7 " ' 6 '6 ' 5 7 '5" $%& ) '6" 6 8 ' "5 67!5 07! "6 76 5'. 8 66:6'8 6 6!:8 '5" " !< 8 '8 86 ' 7! 0!"4 4"0477!"! 6 8 :! !86 8 "8!76 5'6 7! ! 5 '5" ' : '5"8576'4'"6 % % )6 5"8! '8 86 ' 7! '5 8 8( ):!7 76 5' ! : ' 8"4!8 6'76 6' "5 7!98 '5"857 86' 3569 " "!9!767! !: ' "5 8 56'5" :!7 8! 6< * " ' "5 8. 7!9!776 0! 58! " 4' ' 56 5'

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