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径薛
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1 2010 年第 68 卷化学学报 Vol. 68, 2010 第 24 期, 2574~2580 ACTA CHIMICA SINICA No. 24, 2574~2580 研究论文一种利用同一表面等离子体共振传感器检测多种残留物的方法张婉洁苏洋徐可欣石婷刘瑾 * ( 天津大学精密测试技术及仪器国家重点实验室天津 ) 摘要提出了一种新的利用基于表面等离子体共振 (Surface Plasmon Resonance, SPR) 的生物光学传感器检测多种残留物的方法. 引入分子标记技术, 在修饰有羧甲基葡聚糖的芯片表面固定一层抗分子标记物的抗体, 通过对待测样品的两步孵育, 将对多种残留物的检测转化为对同一标记物的测量. 实验采用的分子标记物为牛血清白蛋白 (Bovine Serum Albumin, BSA), 分别标记了四种被测物 : 卡那霉素三聚氰胺氨苄青霉素和链霉素. 对四种被测物的水溶液进行了检测, 检测限分别为 50, 10, 1.25 和 10 ng/ml, 均低于各自的最大残留检出限 (Maximum Residue Limit, MRL). 该检测方法解决了原有竞争抑制法在检测时传感器的专一性问题, 实现了传感器的通用性, 同时该方法可推广到其他免疫法检测的领域, 使免疫传感器免疫试纸等通用性增强. 关键词表面等离子体共振 ; 生物传感器 ; 抗生素残留 ; 竞争法 ; 分子标记 A Method for the Detection of Various Residues Based on the Same Surface Plasmon Resonance Sensor Zhang, Wanjie Su, Yang Xu, Kexin Shi, Ting Liu, Jin* (State Key Laboratory of Precision Measuring Technology and Instruments, Tianjin University, Tianjin ) Abstract A new method based on surface plasmon resonance (SPR) biosensors for the detection of various residues is proposed. Marking the residues with special moleculars, and the moleculars monoclonal antibody was immobilized on the sensor surface, which is covered with carboxymethyl dextran. So the direct analyte was transformed to general markers after twice incubation of samples. Bovine Serum Albumin (BSA) was used as molecular-marker in the assay, and kanamycin, melamine, ampicillin and streptomycin were marked with BSA separately. Water solution with a series concentration of the antibiotics was detected respectively in this paper. The limits of detection (LODs) reach to 50, 10, 1.25 and 10 ng/ml respectively, being much lower than maximum residue limit (MRL) accordingly. The method has solved the problem that sensors are special for the detection of residues in the competitive assay, and then the sensors will be more available. Furthermore, the method can be applied to other fields of the immunoassay, enhancing the availability of immunesensors and test papers. Keywords surface plasmon resonance; biosensor; antibiotics residues; competitive assay; molecular mark 随着生活水平的提高, 牛奶中抗生素及三聚氰胺等的残留问题日益受到消费者及各国政府和食品安全机构的重视, 已成为乳业管理和技术的难题之一. 基于表面等离子体共振 (Surface Plasmon Resonance, SPR) 效应的生物传感器免疫法是近年来发展起来的一种新的检测方法. 表面等离子体共振传感器是一 * liu_jin@tju.edu.cn Received March 18, 2010; revised June 7, 2010; accepted August 19, 国家自然科学基金 (Nos , ) 高等学校博士点专项科研基金(Nos , ) 和天津市应用基础与前沿技术研究计划 (No. 06YFGDGX17400) 资助项目.

2 No. 24 张婉洁等 : 一种利用同一表面等离子体共振传感器检测多种残留物的方法 2575 种多功能的自动分析仪器, 可以实时监测分子间的相互作用而且不需要标记 [1]. 该方法可以实现多个样品快速准确的检测, 并且, 由于每一轮检测结束后, 结合在传感片上的反应物可以用洗脱液洗脱使传感片再生, 可重复使用, 节约耗材. 因此, 该方法在食品成分和药物残留等检测领域中得到了迅速的发展, 如食品中的微量成分 ( 叶酸 [2] 孕酮 [3] 乳铁传递蛋白 [4] [5] β- 酪蛋白等 ) [6] 毒素 ( 金黄色葡萄球菌毒素等 ) 药物残留( 兽药抗生 [7] 素等 ) 非法添加物( 瘦肉精等 ) 等. 在抗生素检测领域 [8 ~ 已经成功检测了 β- 内酰胺类抗生素 11], 氨基糖苷类 [12,13] [1], 磺胺二甲嘧啶等多种抗生素残留. 由于牛奶中的多种残留大多为小分子物质, 小分子物质引起的 SPR 传感器响应较小, 与噪声水平相当, 利用竞争法进行检测是提高小分子检测灵敏度的有效方法 [14] [12]. Haasnoot 等将庆大霉素新霉素卡那霉素链霉素的衍生物分别固定在传感芯片 (CM5) 的四个流通池表面, 利用竞争反应, 抗原抗体特异性结合后检测了五种 ( 包括双氢链霉素 ) 氨基糖苷类抗生素在牛奶中的残留及五种抗生素之间的交叉反应, 检测限达到 15~60 [13] ng/ml. Baxter 等利用 BIAcore 2000 仪器对巴氏灭菌消毒牛奶不需离心过滤脱脂等预处理进行了链霉素残留检测, 与双氢链霉素的交叉反应率达到 106%, 检测 [8] 限为 4.1 ng/ml. Gaudin 等对 β- 内酰胺类抗生素分别进行酶解预处理和化学预处理两种不同的预处理方法, 将氨苄青霉素固定在芯片表面, 采用竞争反应对青霉素类多种抗生素进行了检测并测定了交叉反应率. Gustavsson 等利用一种青霉素绑定蛋白, 即带有羧肽酶活 [9,10] 性的微生物受体蛋白 (R39), 采用竞争法检测了多种 β- 内酰胺类抗生素. 上述检测均利用了具有同类结构的抗生素本身具有交叉反应的原理, 通过一次固定配体检测了具有同类结构的多种抗生素, 但检测多种不同结构的残留物时, 需要对传感器进行不同的修饰处理, 造成传感器芯片耗费量大, 成本提高, 检测时间也成倍的增加. [15] Cacciatore 等引入地高辛 (digoxigenin, DIG) 作为分子标记物, 将检测对象转化为 DIG, 对样品中的抗生素进行两步孵育, 即先将待测抗生素与 PBP 2x* 进行一段时间孵育, 再对混合液与被 DIG 标记的氨苄青霉素 (DIG-AMPI) 进行孵育形成 DIG-AMPI/PBP 2x* 复合物, 与固定在传感器表面的抗 DIG 抗体进行特异性结合, 从而实现了对苄青霉素氨苄青霉素阿莫西林氯唑西林头孢氨苄头孢哌酮等 β- 内酰胺类抗生素的检测. 而 [9,10] Gustavsson 等采用竞争法检测 R39 时, 是利用了 R39 对 3 肽转化为 2 肽的催化作用, 将检测对象转化为 3 肽或者 2 肽. 这些检测方法均引入了其它的分子作为间接检测对象, 其可与待测抗生素结合为偶联物, 或者可间接反映待测物的量的变化. 例如 3 肽向 2 肽转化的量可以反映 R39 的量的多少, DIG-AMPI/PBP 2x* 复合物的量可以反映氨苄青霉素的量的多少. 传感器表面固定的是间接检测物的抗体, 即 2 肽 (3 肽 ) 的抗体和 DIG 抗体. 因此, 这些方法是将特异性的残留物检测转化为较普通的分子的检测, 即 2 肽 (3 肽 ) 或者 DIG, 并且, 通过催化或者分子标记可以转化为这些分子的其他残留物都可使用同一传感器进行检测, 这使得传感器的修饰变得简单, 没有了专一性. 分子标记是抗生素检测领域常用的方法. 由于抗生素分子较小, 直接固定到传感器表面具有很多缺点 : 如固定困难, 一些抗生素缺乏与传感器表面进行偶联需要特定的基团, 如胺耦合需要氨基巯基等官能团 ; 抗生素分子在传感器表面固定的密度太大, 影响抗体的吸附等. 常常采用被蛋白标记后的抗生素进行传感器的修饰, 如牛血清白蛋白 (Bovine Serum Albumin, BSA)- 抗生素偶联物, 匙孔血蓝蛋白 (Keyhole Limpet Hemocyanin, KLH)- 抗生素偶联物等. 相对于 DIG 小分子, BSA KLH 等蛋白质与抗生素的偶联较容易实现. 因此, 本文拟将抗生素等残留物的检测转化为蛋白质标记物 ( 如 BSA) 的检测, 通过检测对象的转化使得传感器具有检测多种残留物的能力. 因此, 本文提出一种新的以表面等离子体共振技术为基本原理的生物传感器的检测方法, 结合抗原抗体的特异性反应原理, 采用更为常见的牛血清白蛋白作为分子标记物, 通过对待测样品的两步孵育, 将对多种残留物的检测转化为对同一标记物的测量, 采用同一表面等离子体共振传感器检测乳品中多种抗生素及三聚氰胺等残留物, 解决现有技术中传感器专一, 不能测量多种残留物的问题. 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 BIAcore X 100( 瑞典 Uppsala, Pharmacia Biosensor AB), 传感片 (Sensor Chip CM5) 由 GE 公司购得. 磷酸盐缓冲液 (Phosphate buffer saline, PBS, 20 mmol/l Na 2 HPO 4, 20 mmol/l NaH 2 PO 4, ph 7.4), 氨苄青霉素 ( 德国 SERVA 公司 ) 链霉素( 上海生工生物工程技术服务有限公司 ) 卡那霉素( 瑞士 FLUKA 公司 ) 三聚氰胺( 分析纯, 天津市赢达稀贵化学试剂厂 ), 抗 BSA 抗体 ( 美国 ICLLab 公司 ), 抗氨苄青霉素抗体 ( 美国 USBiological 公司 ) 抗链霉素抗体( 英国 Abcam 公司 ) 抗卡那霉素抗体 ( 美国 Fitzgerald 公司 ) 抗三聚氰胺抗体( 武汉华美生物工程有限公司 ), 氨苄青霉素 -BSA 偶联物链霉素 -

3 2576 化学学报 Vol. 68, 2010 BSA 偶联物卡那霉素 -BSA 偶联物 ( 以上三种购自无锡康拜尔生物科技有限公司 ), 三聚氰胺 -BSA 偶联物 ( 广州市江森生物科技有限公司 ), 1-(3- 二甲氨基丙基 )-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC HCL, 上海延长生化有限公司 ) 和 N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS, 上海延长生化有限公司 ), 醋酸钠缓冲液 (10 mmol/l, ph 6.0), 乙醇胺 - 盐酸 (Ethanolamine hydrochloride, 美国 Sigma-Aldrich 公司, ph 8.5). 实验中用到所有的试剂均为分析纯, 水为去离子水. 所有溶液在使用前均经 0.22 µm 的微孔滤膜过滤和超声脱气处理. 1.2 检测原理本文采用竞争法进行检测, 并通过二次竞争抑制将检测对象转换为同一物质, 该物质为待测抗生素或添加剂的标记物, 从而实现了同一传感器对多种残留物的检测. 具体采用 BSA 标记所有的待测残留物, 包括氨苄青霉素链霉素卡那霉素和三聚氰胺. 该方法包括两部分. 第一部分为样品的预处理 : 对含有不同浓度残留物的样品进行预处理, 进行两次孵育. 第一次孵育时向被测溶液 ( 如氨苄青霉素溶液 ) 中分别加入等量且过量的被测物抗体 ( 如抗氨苄青霉素抗体 ), 反应充分后, 剩余未与被测物反应的抗体量与被测物含量成反比关系 ; 第二次孵育时向被测溶液中分别加入等量且过量的被测物的 BSA 偶联物 ( 如氨苄青霉素的 BSA 偶联物 ), 反应充分后溶液中被测物 -BSA 偶联物 - 抗体复合物 ( 如氨苄青霉素 - 氨苄青霉素的 BSA 偶联物 - 抗氨苄青霉素抗体 ) 的量则与第一次孵育后多余的抗体量成正比. 第二部分为检测 : 将抗 BSA 抗体固定于 CM5 芯片表面, 当被测样品流经芯片时, 所有的含 BSA 的物质被吸附, 具体包括被测物的 BSA 偶联物 ( 如氨苄青霉素的 BSA 偶联物 ) 被测物-BSA 偶联物 - 抗体复合物 ( 如氨苄青霉素 - 氨苄青霉素的 BSA 偶联物 - 抗氨苄青霉素抗体 ) 两部分, 两部分物质的量总量相同, 其质量的不同是由两者所占比例不同引起, 被测物 -BSA 偶联物 - 抗体复合物的量越大, 引起的传感器响应越大, 且响应大小与被测物 -BSA 偶联物 - 抗体复合物的量成正比, 即与样品中所含被测物的量成反比. 检测原理示意图见图 1 所示. 用 PBS 分别配置浓度为 0, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 ng/ml 的氨苄青霉素溶液, 浓度为 0, 10, 50, 100, 200, 400, 600 ng/ml 的链霉素溶液, 浓度为 0, 10, 50, 100, 200, 400, 600 ng/ml 的卡那霉素溶液, 浓度为 0, 10, 20, 50, 100, 200 ng/ml 的三聚氰胺溶液. 对不同浓度的氨苄青霉素链霉素溶液卡那霉素溶液三聚氰胺溶液的样品溶液分别按照上述预处理方法进行两次孵育. 配置好的溶液 4 下保存待用. 1.3 传感器芯片预处理实验采用的 CM5 芯片的金膜表面修饰有羧甲基化的葡聚糖, 将抗 BSA 抗体固定到芯片表面, 步骤如下 : (1) 在 PBS 缓冲溶液流过传感片表面数分钟使信号稳定后, 调节流速为 5 µl/min, (2) 通入 EDC/NHS( 体积比为 1 1, EDC 为 0.2 mol/l, NHS 为 0.05 mol/l) 7 min, (3) 通入抗 BSA 抗体溶液 ( 醋酸钠缓冲液稀释, ph 6.0, 分别配置 100, 200, 400 µg/ml) 10 min, (4) 通入乙醇胺 - 盐酸溶液 7 min. 1.4 测量方法采用同一传感器芯片分别对氨苄青霉素水溶液链霉素水溶液卡那霉素水溶液三聚氰胺水溶液进行测量. 氨苄青霉素溶液的测量步骤为 : (1) 调节流速为 5 µl/min, 在 PBS 缓冲溶液流过已固定好抗 BSA 抗体的传感片表面数分钟使信号稳定后, 以此作为测量基准, (2) 通入预处理后的氨苄青霉素 - 氨苄青霉素的 BSA 偶联物 - 抗氨苄青霉素抗体的混合溶液 10 min, (3)PBS 缓冲液冲洗, 记录通入混合溶液前后的传感器响应差值. 其余浓度的氨苄青霉素溶液及各浓度的链霉素溶液各浓度的卡那霉素溶液各浓度的三聚氰胺溶液均采用同样的步骤进行测量. 每次测量结束后调节流速为 20 µl/min, 通入 NaOH 溶液 (0.1 mol/l) 1 min, 用以破坏抗原抗体的结合, 并用缓冲液冲洗. 2 结果与讨论 2.1 抗 BSA 抗体的固定实验采用的传感片 (sensor chip CM5) 表面含有一层羧甲基化葡聚糖, 可以提供配体偶联基底和为生物反应提供亲水环境 [16], 羧甲基化葡聚糖活化后含有酯键, 蛋白质中所含有的氨基可以自发地与酯键发生偶联反应而与羧甲基化葡聚糖共价结合 [17]. 本实验中所使用的抗 BSA 单克隆抗体的等电点为 8.5, 经多次实验发现该抗体在 ph 值为 6.0, 浓度为 200 µg/ml 时与芯片有最大结合量, 在 10 min 内的响应值达到 2431 RU( 其余数据未列出 ). 图 2 所示为在该条件下抗 BSA 抗体的固定曲线. EDC/NHS 使传感片表面的羧基活化后含有酯键, 抗 BSA 单克隆抗体 (anti-bsa antibody) 中所含的氨基可以与酯键发生偶联反应, 且此为共价结合不易被破

4 No. 24 张婉洁等 : 一种利用同一表面等离子体共振传感器检测多种残留物的方法 2577 图 1 检测原理示意图 Figure 1 A schematic illustration of detection BSA 偶联物, 二者发生特异性结合, 乙醇胺 - 盐酸溶液封闭未反应的活化羧基官能团 RU 的传感单位变化相当于芯片表面蛋白浓度变化为 1 ng/mm 2 [18], 以此计算表面抗体的覆盖量为 2.4 ng/mm 传感器稳定性测定首先, 将 PBS 通入固定好的传感器芯片, 流速 5 µl/min, 记录 5 min, 该段响应的标准差为 5 RU. 测量信号应大于 3 倍的标准差 15 RU. 2.3 多种残留物检测结果图 2 抗 BSA 抗体的固定曲线 Figure 2 The binding curve of anti-bsa antibody 坏, 结合上的抗 BSA 单克隆抗体用以检测溶液中的卡那霉素溶液测量结果将不同浓度的卡那霉素溶液依次通入传感器进行测量, 得到传感器响应图, 如图 3. 其中卡那霉素的浓度依次为 0, 50, 100, 200, 400, 600 ng/ml. 图中区域 A 为

5 2578 化学学报 Vol. 68, 2010 以 PBS 缓冲液作为初始基线部分 ( 由于每次测量完毕芯片表面重建后, 基线略有漂移, 为便于比较, 将每次测量前的基线均修正到芯片表面修饰完毕后基线值 RU), 区域 B 为通入溶液部分, 即 BSA 与抗 BSA 抗体的结合反应, 区域 C 为 PBS 缓冲液冲洗芯片表面. 响应信号随时间变化的传感图反映了抗原抗体的结合过程, 每次检测完毕后记录 C 与 A 的差值, 将该相对响应值作为测量结果. 应曲线, 如图 5. 其中三聚氰胺的浓度依次为 0, 10, 20, 50, 100, 200 ng/ml. 图 3 测量卡那霉素溶液的 SPR 响应曲线 Figure 3 Responses of the detection of kanamycin 重复检测 3 次, 得到卡那霉素溶液的标准工作曲线如图 4 所示. 从图中可以看出, 样品中含有的卡那霉素越多, 其相对响应值越小, 二者成反比关系. 50 ng/ml 溶液与 0 ng/ml 溶液的平均响应差值为 140 RU, 大于仪器的噪声 3 倍标准差 15 RU, 也大于 0 ng/ml 溶液测量的 3 倍标准差 65 RU. 因此, 该传感器对卡那霉素的检测限低于 50 ng/ml, 其大大低于欧盟规定的最大检出限 (MRL) 150 µg/kg. 图 4 卡那霉素溶液的标准工作曲线 Figure 4 Calibration curves of kanamycin 三聚氰胺溶液测量结果将三聚氰胺溶液通入同一传感器, 得到传感器的响图 5 测量三聚氰胺溶液的 SPR 响应曲线 Figure 5 Responses of the detection of melamine 重复检测 3 次得到三聚氰胺溶液的标准工作曲线如图 6 所示. 10 ng/ml 溶液与 0 ng/ml 溶液的平均响应差值为 31 RU, 大于仪器的噪声 3 倍标准差 15 RU, 也大于 0 ng/ml 溶液测量的 3 倍标准差 13.2 RU. 因此, 该传感器对三聚氰胺的检测限低于 10 ng/ml, 其大大低于我国规定的最大检出限 MRL 1 mg/kg 氨苄青霉素溶液测量结果同理, 将不同浓度氨苄青霉素的溶液采用该传感器进行检测, 得到传感器响应图, 如图 7. 其中三聚氰胺的浓度依次为 0, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 ng/ml. 重复检测 3 次做出氨苄青霉素溶液的标准工作曲线如图 8 所示 ng/ml 溶液与 0 ng/ml 溶液的平均响应差值为 46 RU, 大于仪器的噪声 3 倍标准差 15 RU, 也大于 0 ng/ml 溶液测量的 3 倍标准差 10.1 RU. 因此, 该传感器对氨苄青霉素的检测限低于 1.25 ng/ml, 其大大低于欧盟的最大检出限 MRL 4 µg/kg.

6 No. 24 张婉洁等 : 一种利用同一表面等离子体共振传感器检测多种残留物的方法 2579 图 6 三聚氰胺溶液的标准工作曲线 Figure 6 Calibration curves of melamine 图 8 氨苄青霉素溶液的标准工作曲线 Figure 8 Calibration curves of ampicillin 图 7 测量氨苄青霉素溶液的 SPR 响应曲线 Figure 7 Responses of the detection of ampicillin 图 9 测量链霉素溶液的 SPR 响应曲线 Figure 9 Responses of the detection of streptomycin 链霉素溶液测量结果同理, 采用该传感器对不同浓度链霉素溶液进行检测, 传感器响应如图 9 所示, 其中链霉素的浓度依次为 0, 10, 50, 100, 200, 400, 600 ng/ml. 重复检测 3 次得到链霉素溶液的标准工作曲线如图 10 所示. 10 ng/ml 溶液与 0 ng/ml 溶液的平均响应差值为 96 RU, 大于仪器的噪声 3 倍标准差 15 RU, 也大于 0 ng/ml 溶液测量的 3 倍标准差 20.4 RU. 因此, 该传感

7 2580 化学学报 Vol. 68, 2010 器对链霉素的检测限低于 10 ng/ml, 其大大低于欧盟的最大检出限 MRL 200 µg/kg. 加了所需试剂以及样品的预处理, 但同一传感器可检测多种物质. 大大降低了对传感器专一性的要求, 可节省传感器的使用数量和传感器配体固定所需的时间, 达到了一次处理多次使用的效果, 促进了基于表面等离子体共振的检测技术在实际应用中的发展和推广. References 图 10 链霉素溶液的标准工作曲线 Figure 10 Calibration curves of streptomycin 3 结论本实验引入了分子标记技术, 采用牛血清白蛋白作为分子标记物, 利用抗原抗体的特异性反应原理, 在原有竞争抑制法的基础上, 提出了一种新的检测方法. 通过对样品的预处理, 将表面等离子体共振传感器对待测抗生素的测量转换为对分子标记物的测量. 采用可对被测物进行标记的分子标记物的单克隆 / 多克隆抗体或者特异性吸附蛋白对表面等离子体共振传感器进行化学修饰, 从而实现传感器的通用性. 该方法继承了原有竞争抑制法检测时相对响应值大, 检测限低的优点, 同时还解决了其检测时传感器专一性的问题. 利用此方法成功地对卡那霉素三聚氰胺氨苄青霉素和链霉素的水溶液进行了检测, 检测值均低于各抗生素或三聚氰胺的最大检出限, 同时根据不同浓度样品的响应分别建立了标准工作曲线. 有些标准曲线的拟合并不是很好, 可以采用分段拟合的方法进行解决. 该检测方法不仅仅局限于对牛奶中抗生素或三聚氰胺等残留的检测, 对任意可被分子标记物标记的抗生素或其他待测物质, 如保健口服液中的叶酸蜂蜜中的泰乐菌素食物中的葡萄球菌肠毒素 B 等均可进行测量. 由于残留物或者添加剂的种类繁多, 但标记物种类相对较少, 很多被测物可被同一标记物标记, 因此, 采用本文方法将对被测物的测量转化为标记物的测量, 虽然增 1 Li, H.; Cui, D.-F.; Wang, Y.-J.; Cai, H.-Y.; Wang, J.-B.; Zheng, Z.-P.; Chen, X. Food. Sci. 2007, 28, 288 (in Chinese). ( 李辉, 崔大付, 王于杰, 蔡浩原, 王军波, 郑自攀, 陈兴, 食品科学, 2007, 28, 288.) 2 Nygren, L.; Sternesjo, A.; Bjorck, L. Int. Dairy J. 2003, 13, Gillis, E. H.; Gosling, J. P.; Sreenan, J. M.; Kane, M. J. Immunol. Methods 2002, 267, Indvk, H. E.; Filonzi, E. L. Int. Dairy J. 2005, 15, Renaud, S. M.; Dupont, D.; Dulieu, P. J. Agric. Food Chem. 2004, 52, Homola, J.; Dostalek, J.; Chen, S.; Rasooly, A.; Jiang, S.; Yee, S. S. Int. J. Food Microbiol. 2002, 75, Johansson, M. A.; Hellenas, K. E. Analyst 2004, 129, Gaudin, V.; Fontaine, J.; Maris, P. Anal. Chim. Acta 2001, 436, Gustavsson, E.; Bjurling, P.; Sternesjo, A. Anal. Chim. Acta 2002, 468, Gustavsson, E. Ph.D. Dissertation, Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala, Gustavsson, E.; Degelaen, J.; Bjurling, P.; Sternesjo, A. J. Agric. Food Chem. 2004, 52, Haasnoot, W.; Cazemier, G.; Koets, M.; Amerongen, A. V. Anal. Chim. Acta 2003, 488, Baxter, G. A.; Ferguson, J. P.; O Connor, M. C.; Elliott, C. T. J. Agric. Food Chem. 2001, 49, Yang, X.-H.; Li, Z.-H.; Wang, Q.; Wang, K.-M. Acta Chim. Sinica 2007, 65, 1185 (in Chinese). ( 羊小海, 黎振华, 王青, 王柯敏, 化学学报, 2007, 65, 1185.) 15 Cacciatore, G.; Petz, M.; Rachid, S.; Hakenbeck, R.; Bergwerff, A. A. Anal. Chim. Acta 2004, 520, Lofas, S.; Johnsson, B. J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1990, 21, Johnsson, B.; Lofas, S.; Lindquist, G. Anal. Biochem. 1991, 198, Stenberg, E.; Persson, B.; Roos, H.; Urbaniczky, C. J. Colloid Interface Sci. 1991, 43, 513. (A Sun, H.)

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<453A5CCAB3C6B7BFC6D1A73131C4EA3134C6DA5C3134C6DA5C3032B7D6CEF6> 227 ELISA 刘沙洲 1,2, 桑小雪 1, 欧阳华学 3, 雷绍荣 3, 白林含 1, * (1. 四川大学生命科学学院, 四川成都 610065;2. 成都市食品药品检测中心, 四川成都 610045; 3. 四川省农业科学院分析测试中心, 四川成都 610066) 目的 : 比较