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1 第 37 卷第 6 期 Vol.37 No.6 井冈山大学学报 ( 自然科学版 ) 2016 年 11 月 24 Nov 井冈山大学学报 Journal of Jinggangshan ( 自然科学版 ) University (Natural Science) 24 文章编号 : (2016) 连云港山楂叶黄酮的超声提取及体外活性研究 * 许瑞波 1,2, 杨雯雯 2 2, 万蓓蓓 (1. 江苏省海洋资源开发研究院, 江苏, 连云港 ;2. 淮海工学院药学院, 江苏, 连云港 ) 摘要 : 以连云港花果山山楂叶为原料, 以总黄酮提取率为衡量提取工艺的指标通过单因素和正交实验设计优化了超声辅助提取山楂叶黄酮的工艺, 确定了从山楂叶中提取黄酮的最佳工艺条件 : 乙醇浓度 70%, 液料比 20:1 ml/g, 超声温度 70, 超声时间 40 min, 提取 3 次, 山楂叶黄酮提取率为 2.53% 此外, 采用琼脂平板扩散抑菌法和 DPPH 法研究了连云港山楂叶黄酮对大肠杆菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌的抑制作用以及抗氧化效应, 结果表明山楂叶黄酮具有明显抑菌活性和清除 DPPH 的能力关键词 : 山楂叶 ; 黄酮类化合物 ; 提取工艺 ; 抑菌活性 ; 抗氧化效应中图分类号 :TS202.3 文献标识码 :A DOI: /j.issn STUDY ON EXTRACTION TECHNOLOGY OF FLAVONOIDS FROM HAWTHORN LEAVES WITH ULTRASONIC-ASSISTED METHOD AND BIOACTIVITIES OF THE EXTRACT IN VITRO * XU Rui-bo 1,2, YANG Wen-wen 2, WAN Bei-bei 2 (1. Jiangsu Institute of Marine Resources, Lianyungang, Jiangsu , China; 2. School of pharmacy, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang, Jiangsu , China) Abstract: Hawthorn leaves as raw material were collected from Huaguo mountain of Lianyungang city and the yield of total flavonoids was used as evaluation indicator. The extraction technology of flavonoids from hawthorn leaves with ultrasonic assisted method was optimized by single and orthogonal experimental design, and the optimal extraction technology was obtained as following: ethanol concentration of 70%, solvent-to-liquid ratio of 20:1 (ml/g), extraction temperature of 70, extraction time of 40 min and extraction times of 3. The yield of flavonoids from hawthorn leaves is 2.53%. Moreover, the inhibitory effect of the flavonoids against Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Bacillus subtilis was determined by the agar diffusion method, and the antioxidant effect was evaluated by DPPH method. The results showed that the flavonoids extracted from hawthorn leaves had good antibacterial activity and excellent scavenging capacity to DPPH radical. Key words: hawthorn leaves; flavonoids; extraction technology; antibacterial activity; antioxidant effect 山楂叶是山里红 (Crataegus pinnatifida Bunge. Var. major N.E. Br) 或山楂 (Crataegus pinnatifida Bge.) 干燥叶, 其味酸性平, 归肝经, 具有活血化瘀理气通满的功效 [1-5] 早在东晋肘后方中就有关于山楂叶茎叶煮汁, 洗漆疮的记载民间用山楂叶泡茶, 有清肝消火降血压降血脂的功效 [6] 目前, 山楂叶已经被中国药典 (2005 版 ) 收载收稿日期 : ; 修改日期 : 基金项目 : 江苏省高校自然科学研究基金项目 (13KJB150005); 淮海工学院自然科学基金创新基金项目 (Z ); 江苏省海洋资源开发研究院科技开放基金项目 (JSIMR201303) 作者简介 :* 许瑞波 (1972-), 女, 吉林白山人, 副教授, 博士, 主要从事天然产物提取及配位化学相关研究 ( xuruibo9125@163.com); 杨雯雯 (1996-), 女, 江苏连云港人, 淮海工学院药学院制药工程专业 2014 级本科生 ( @qq.com); 万蓓蓓 (1991-), 女, 江苏南通人, 淮海工学院药学院制药工程专业 2009 级本科生 ( @qq.com).

2 井冈山大学学报 ( 自然科学版 ) 25 山楂叶中含有丰富的黄酮类化合物, 其黄酮含量约为山楂果的 20~120 倍, 因其产地不同, 黄酮含量也有差异 [7] 山楂叶黄酮主要采用水提法醇提水沉法及联合溶剂萃取法等方法进行提取, 利用大孔吸附树脂聚酰胺等进一步分离提纯研究发现, 山楂叶黄酮对治疗心血管疾病具有很好的疗效目前, 以山楂叶黄酮为主的制剂益心酮已经在临床上使用 [8-9] 我国山楂叶资源丰富, 人们只关注果实的开发利用, 一直把山楂叶视为废物江苏连云港市的丘陵岗地种植大量山楂树, 且该市有多家药企, 因此, 研究连云港山楂叶黄酮的提取工艺及其体外活性, 不仅可以变废为宝, 提高山楂树的经济价值, 而且为山楂叶黄酮类药物的研发提供依据本研究以连云港废弃山楂叶为原料, 研究了超声辅助提取山楂叶黄酮的最佳工艺及其体外抑菌与抗氧化活性 1 材料与方法 1.1 材料与仪器山楂叶采自江苏省连云港市花果山 ; 芦丁标准品 ( 含量 95%) 国药集团化学试剂有限公司 ; 营养肉汤和营养琼脂北京路桥技术有限公司 ; 亚硝酸钠硝酸铝三羟甲基氨基甲烷 (Tris) 抗坏血酸 (VC) 1,1- 二苯基 -2- 三硝基苯肼 (DPPH ) 等均为分析纯 722 可见分光光度计 ( 上海精密科学仪器有限公司 ) SCQ-250 超声波清洗器 ( 上海声浦超声波设备厂 ) UV-Vis2550 型紫外分光光度计 ( 日本岛津 ) 1.2 实验方法样品的处理用自来水冲洗山楂叶, 阴干, 置于 70 烘箱干燥 2 h, 粉碎过筛, 取 12~8 目的山楂叶粉以 15:1 (ml/g) 的液料比加入石油醚 (60~90 ), 50 处理 1 h, 过滤, 滤渣重复处理 1 次, 挥干石油醚, 得到石油醚抽提后的山楂叶原料粉, 避光保存于磨口瓶中, 备用山楂叶黄酮的制备称取 10 g 原料粉, 以乙醇为提取剂, 按一定液料比 ( 原料粉 : 某体积分数的乙醇,g:mL) 投料在某温度下, 使用超声波提取一定时间, 真空抽滤, 收集滤液 ; 相同条件下, 再提取滤渣 1 次 ( 不同提取次数 ), 合并滤液, 得山楂叶黄酮提取液标准曲线的制作精密称取 100 烘干至质量恒定的芦丁标准品 62.5 mg, 用体积分数为 60 % 的乙醇溶解, 定容于 100 ml 容量瓶中, 即得到质量浓度为 mg/ml 的标准品溶液精确吸取该标准品溶液 ml, 分别置于 25 ml 具塞试管中, 用 60% 乙醇定容至 12.5 ml 刻度, 加入 0.7 ml 质量分数为 5% 的 NaNO 2 溶液, 摇匀静置 6 min, 再加入 0.7 ml 10% Al(NO 3 ) 3 溶液, 摇匀放置 6 min, 加 2 ml 4% NaOH 溶液, 用 60 % 乙醇定容至刻度, 摇匀放置 10 min 后, 以 60 % 乙醇为空白对照, 测其在 510 nm 处的吸光度以浓度 C 为纵坐标, 吸光度 A 为横坐标, 绘制标准曲线 [10] 山楂叶黄酮的测定方法将山楂叶黄酮提取液置于 250 ml 容量瓶, 不足 250 ml 定容到刻度 ; 超过 250 ml, 浓缩后再定容于 250 ml 容量瓶从容量瓶中移取 1.0 ml 溶液置于 25 ml 具塞试管中, 按照的方法测定其在 510 nm 处的吸光度, 并计算山楂叶黄酮的提取率 : C V n 山楂叶黄酮的提取率 /% = 100 = C m 式中 :C 为测量液黄酮浓度 (mg/ml);v 为黄酮提取液的定容体积,250 ml; n 为稀释倍数, 25;m 为山楂叶粉的质量,10000 mg 超声辅助提取山楂叶黄酮的单因素实验选取乙醇体积分数超声时间超声温度液料比和提取次数进行单因素实验, 考察各因素对山楂叶黄酮提取率的影响正交实验优化山楂叶黄酮的提取工艺在单因素实验基础上, 选择乙醇体积分数提取次数提取时间和液料比为正交实验考察的因素, 采用 L 9 (3 4 ) 正交表对山楂叶黄酮的提取工艺条件进一步优化, 其因素水平安排见表 1

3 26 井冈山大学学报 ( 自然科学版 ) 水平 1 2 表 1 因素水平表 Table 1 Factors and levels for the experiment A 乙醇体积分数 (/%) 因素 B 提取次数 C 超声时间 ( 次 ) (min) D 液料比 (g:ml) 15:1 20: : 抑菌作用测定取 34 g 营养琼脂, 加 1.0 L 蒸馏水, 溶解后置于高压灭菌锅内,120 灭菌 30 min 冷却至 50~60 制成平板, 取 0.1 ml 活化菌液, 在平板上涂抹均匀, 以等距离均匀垂直放置 4 个牛津杯在牛津杯中加入 0.1 ml 样品液, 置于 37 生化培养箱中培养 24 h [11] 取出后, 测量每个牛津杯周围所产生的透明抑菌圈直径 (mm) 每个样品浓度重复二次抑菌实验, 取其平均值, 并以此数值来衡量样品抑菌活性强弱清除 DPPH 能力测定 [12-13] 采用 DPPH 法测定山楂叶黄酮对 DPPH 的清除作用, 以 VC 为标准对照物在 10 ml 具塞试管中加入 0.04 mg/ml DPPH 乙醇溶液 2 ml, 再分别加入 2 ml 样品液或 VC 溶液 ( 质量浓度 mg/ml), 摇匀置于 37 水浴锅中, 避光反应 30 min 后立即测定 517 nm 处吸光度 A 以无水乙醇为参比, 空白对照以无水乙醇代替样品计算山楂叶黄酮及 VC 对 DPPH 的清除率 : Ai-Aj DPPH 清除率 / % = (1- ) 100 A0 其中 :A 0 是空白对照吸光度 ;A i 是加样品液后的吸光度 ;A j 是样品液本底吸收 2 结果与讨论 2.1 单因素实验结果与讨论标准曲线按照方法, 得线性回归方程 :C = A ,R 2 = , 说明芦丁标准品在 0.004~0.02 mg/ml 呈良好线性乙醇体积分数对黄酮提取率的影响在液料比为 20:1, 超声温度 70, 超声时间 40 min, 提取 1 次条件下, 考察乙醇体积分数 (55% 65% 75% 85% 95%) 对山楂叶黄酮提取率的影响, 结果见图 1 由图可知, 随着乙醇体积分数的增加, 山楂叶黄酮提取率先略有增加, 当体积分数为 65% 时, 提取率最高再增大乙醇体积分数, 黄酮提取率又明显减小说明乙醇体积分数在 65% 左右时有利于从连云港山楂叶中提取黄酮类化合物超声时间对黄酮提取率的影响在乙醇体积分数为 65%, 液料比为 20:1, 超声温度 70, 提取 1 次条件下, 考察超声时间 ( min) 对山楂叶黄酮提取率的影响, 结果见图 2 由图可知, 随着超声时间的延长, 从山楂叶中提取出来的黄酮缓慢增多, 当提取 45 min 时, 提取率最高, 再延长提取时间, 提取率又下降可能是由于超声时间长, 体系温度升高, 破坏了一些比较活泼的黄酮类化合物, 从而导致提取率减少说明超声时间在 45 min 左右有利于从连云港山楂叶中提取黄酮乙醇体积分数 / % 图 1 乙醇体积分数对提取率的影响 Fig.1 Effect of ethanol volume content on extraction yield 超声时间 / min 图 2 超声时间对提取率的影响 Fig.2 Effect of extraction time with ultrasonic technique on extraction yield 超声温度对黄酮提取率的影响在乙醇体积分数为 65%, 液料比为 20:1, 超声时间 45 min, 提取 1 次条件下, 考察超声温度 ( ) 对山楂叶黄酮提取率的影响, 结果见图 3 由图可知, 随着超声温度的升高, 从山楂叶中提取出的黄酮也不断增加, 当超声温度为 70 时, 黄酮提取率最高 ; 再升高温度,

4 井冈山大学学报 ( 自然科学版 ) 27 提取率又下降一般而言, 温度升高可加速分子运动, 从而提高提取率, 但是温度过高会破坏某些黄酮化合物的结构, 反而导致提取率下降, 确定超声提取连云港山楂叶中黄酮的超声温度为液料比对黄酮提取率的影响在乙醇体积分数为 65%, 超声温度为 70, 超声时间 45 min, 提取 1 次条件下, 考察液料比 (10:1 20:1 30:1 40:1 ml/g) 对山楂叶黄酮提取率的影响, 结果见图 4 由图可知, 随着液料比增大, 黄酮提取率先缓慢增加, 后快速降低当液料比为 20:1 时, 提取率最高可能是因为液料比增加会使溶于水的大分子杂质快速溶出, 增大了提取液的粘度, 部分被提取出的黄酮反而被吸附在滤渣中, 降低了提取率, 故液料比为 20:1 左右有利于从连云港山楂叶中提取黄酮类化合物超声温度 / 图 3 超声温度对提取率的影响 Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction yield 液料比 / ml.g -1 图 4 液料比对提取率的影响 Fig.4 Effect of solvent-to-solid ration on extraction yield 提取次数对黄酮提取率的影响在乙醇体积分数为 65%, 液料比为 20:1, 超声温度为 70, 超声时间 45 min 条件下, 考察提取次数 ( 次 ) 对山楂叶黄酮提取率的影响, 结果见图 5 由图可知, 随着提取次数的增多, 山楂叶黄酮的提取率不断增加, 提取 3 次时, 提取率明显大于提取 2 次, 而略低于提取 4 次 ( 相差 0.07%), 说明山楂叶经过 3 次提取之后, 其所含的大部分黄酮都被提取出来了因此, 从连云港山楂叶中提取黄酮的次数以不超过 3 次为宜提取次数图 5 提取次数对提取率的影响 Fig.5 Effect of extraction times on extraction yield 2.2 正交实验结果与讨论根据单因素实验结果, 选择乙醇体积分数提取次数超时时间和液料比为正交实验考察的因素, 超声温度固定在 70, 采用 L 9 (3 4 ) 正交表进行山楂叶黄酮提取工艺的优化, 正交实验结果与分析见表 2, 方差分析结果见表 3 表 2 正交试验设计及结果 Table 2 Design and results for the orthogonal experiments 编号 A B C D 黄酮提取率 /% k k k R 表 3 方差分析表 Table 3 Analysis of variance for the extraction rate with various process parameters 方差来源偏差平方和自由度 F 值 F 临界值 (α = 0.05) A 显著性 B * C D

5 28 井冈山大学学报 ( 自然科学版 ) 从表 2 和表 3 的方差和极差分析可知, 提取次数对山楂叶黄酮提取率具有显著性影响, 各因素对提取率影响的主次顺序为 :B>D>C>A 最佳提取工艺参数为 :A 3 B 3 C 1 D 2 即以 70% 乙醇为提取剂, 液料比为 20:1(mL/g), 超声温度 70, 提取 40 min, 共提取 3 次 2.3 提取工艺的验证在最佳工艺条件下进行从连云港山楂叶中提取黄酮的验证实验, 共做 3 组平行实验, 提取率分别是 2.58% 2.49% 2.52%, 平均提取率为 2.53% 说明该工艺比较稳定, 重现性良好 2.4 山楂叶黄酮抑菌作用不同质量浓度的连云港山楂叶黄酮的抑菌实验结果列于表 4 实验所用牛津杯外径为 7.8 mm, 抑菌圈直径大于该值, 表明样品具有抑菌作用, 且抑菌圈直径越大说明样品的抑菌作用越强由表 4 可知, 山楂叶黄酮对三种受试菌株表现出很好的抑制作用, 尤其对枯草芽孢杆菌的抑制作用最强而且随着黄酮浓度的增大, 对三种细菌的抑制作用也增强表 4 山楂叶黄酮对三种细菌的抑制作用 Table 4 Antibacterial effect of flavonoids from hawthorn leaves against three bacterial strains 黄酮浓度 (mg/ml) 金黄色葡萄球菌 Staphyloccus aureus 抑菌圈直径 /mm 大肠杆菌菌 Escherichia coli 枯草芽孢杆 Bacillus subtilis 山楂叶黄酮清除 DPPH 的能力清除率 / % 图 6 Vc 质量浓度 / mg.ml -1 total flavonoids VC 山楂叶黄酮对 DPPH 的清除率 Fig. 6 Scavenging rate of vitamin C and flavonoids from hawthorn leaves against superoxide anion free radical 不同浓度的山楂叶黄酮或 VC 与 DPPH 清除率的关系见图 6 由图可知, 随着山楂叶黄酮或 VC 浓度的增加, 对 DPPH 的清除能力也不断增大当山楂叶黄酮的浓度为 0.8 mg/ml 时, 其对 DPPH 的清除率高达 90.67%, 与 0.1 mg/ml 的 VC 的清除率接近, 说明山楂叶黄酮具有优异的抗氧化效应, 比雨花茶黄酮的抗氧化性强 [13], 具有很好的应用前景 3 结论本研究通过单因素和正交实验优化了从连云港山楂叶中提取黄酮的工件, 获得了稳定可行的最佳提取工艺条件 : 用 70% 的乙醇以 20:1 的液料比, 超声温度 70, 超声提取 40 min, 提取 3 次, 黄酮提取率为 2.53% 对所提取黄酮进行了体外活性研究, 发现其对大肠杆菌金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌表现出良好的抑制作用, 对 DPPH 具有优良的清除效应由于连云港山楂叶资源丰富, 其所含黄酮活性优良, 值得对连云港山楂叶黄酮进行进一步的开发利用, 本研究为连云港地区山楂叶的综合利用促进校企联合提供了有力支撑参考文献 : [1] Long S R, Carey R A, Crofoot K M, et a1. Effect of hawthorn (Crataegus oxycantha) crude extract and chromatographic fractions on multiple activities in a cultured cardiomyocyte assay[j]. Phytomedicine, 2006, 13(9): [2] 英锡相, 李绍维, 林延会, 等. 山楂叶植物学及化学成分研究近况 [J]. 辽宁中医学院学报, 2001, 3(2): [3] Li H L, Song F R, Xing J P, et a1. Screening and structural characterization of α-glucosidase inhibitors from hawthorn leaf flavonoids extract by ultrafiltration LC-DAD-MS n and SORI-CID FTICR MS [J]. J Am Soc Mass Spectrom, 2009, 20(8): [4] 李冬菊, 林阳. 山楂叶黄酮的提取及其鉴定 [J]. 辽宁中医杂志, 2003, 30(7): [5] Tadi V M, Dobri S, Markovi G.M, et a1. Antiinflammatory, gstroprotective, fee-rdical-savenging, and atimicrobial ativities of hwthorn brries ehanol etract[j]. Journal of Agricultural and Food Chemisty, 2008, 56(17): [6] 许瑞波, 刘炜玮, 马卫兴, 等. 山楂叶多糖的提取工艺

6 井冈山大学学报 ( 自然科学版 ) 29 研究 [J]. 食品科技, 2008, 10: [7] 石瑞平, 周庆英, 陈兴菊. 不同生长期山楂叶黄酮类有效成分的含量测定 [J]. 中国药业, 2002, 11(7): 55. [8] 秦猛, 韩春英. 山楂叶提取物的研究进展 [J]. 齐鲁药事, 2009, 28(9): [9] 王晓华, 张晓丹. 山楂叶总黄酮药理作用及机制研究进展 [J]. 内蒙古民族大学学报 : 自然科学版,2010,25(4): [10] 王建全, 张亚娜, 林敏. 乙醇 / 硫酸铵双水相体系分离纯化款冬花总黄酮 [J]. 井冈山大学学报 : 自然科学版, 2016, 37(1): [11] 许瑞波, 周洪英, 陈林, 等. 地瓜叶总黄酮的超声辅助提取及生物活性研究 [J]. 食品科学,2013,34(14): [12] 勾明明, 刘梁, 张春枝. 采用 DPPH 法测定 26 种植物的抗氧化活性 [J]. 食品与发酵工业, 2010, 36(3): [13] 石雪萍, 李小华, 杨爱萍. 南京雨花茶中总黄酮提取以及 DPPH 自由基清除活性研究 [J]. 江苏农业科学, 2013, 41(6):

H 2 SO ml ml 1. 0 ml C 4. 0 ml - 30 min 490 nm 0 ~ 100 μg /ml Zhao = VρN 100% 1 m V ml ρ g

H 2 SO ml ml 1. 0 ml C 4. 0 ml - 30 min 490 nm 0 ~ 100 μg /ml Zhao = VρN 100% 1 m V ml ρ g 16 6 2018 11 Chinese Journal of Bioprocess Engineering Vol. 16 No. 6 Nov. 2018 doi 10. 3969 /j. issn. 1672-3678. 2018. 06. 004 1 2 1 1 1. 330200 2. 330006 4 Box-Behnken 1 25 g /ml 121 92 min 2 6. 284%

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