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1 Vol １５中国生态农业学报第１５卷第６期 Chinese Journal of Eco唱Agriculture ２００７年１１月玉米苞叶中总黄酮提取及其体外抗氧化性能的研究詹萍要倡田洪磊倡倡李开雄新疆石河子大学食品学院摘 No ６ Nov ２００７石河子８３２０００运用超声波技术提取玉米苞叶中的总黄酮用亚硝酸钠唱硝酸铝比色法测定总黄酮含量得出玉米苞叶中总黄酮提取的最佳工艺条件超声波功率７００ W 温度６０料液比 g m L １５０乙醇浓度为６０提取时间为３５min 玉米苞叶中总黄酮最大提取率为１畅２２５体外抗氧化试验表明玉米苞叶中的总黄酮对超氧阴离子自由基羟基自由基清除能力较好其 IC５０分别为１畅５μg ml 左右和０畅１４mg ml 清除能力均高于 V c 对 DPP H 自由基体系的清除率达到５０时玉米苞叶中总黄酮的 IC５０为０畅２ mg m L 左右 Vc 的 I C５０为０畅０７５mg m L 说明玉米苞叶中的总黄酮清除 DPP H 自由基的能力低于 Vc 但在所选浓度剂量范围内其最大清除率高于 Vc 试验表明玉米苞叶中的总黄酮是一种较好的天然自由基清除剂关键词超声波技术玉米苞叶总黄酮抗氧化 Extraction of corn唱bract flavonoid and related antioxidative activity Z HAN Pin g T IAN Hong唱Lei L I K ai唱xiong College of Food Science Shihezi University Shihezi ８３２０００ C hina CJEA ２００７１５６１０８１１２ Abstract T he craft of corn唱bract flavonoid extraction with ultrasonic and its content measurement w it h colorimetry was conducted and t he best distillation conditions found to be at ７００ W of ult rasonic po wer ex traction temperat ure of ６０ ma唱 terial proportion of ５０ g m L et han ol concen tration of ６０ extraction time of ３５ min T he highest total flavonoid rate gets １畅２２５ Antioxidative test results show good performance of flavon oid scaven gin g capacity in both superoxide radical sys唱 tems and hydroxyl radical systems Free radical scavenging capacity IC５０ flavon oids to supero xide radical system and hy唱 droxyl radical are respectively １畅５μ g m L and ０畅１４mg m L and stron ger t han vitamin C V C In DP PH system IC５０ flavonoid is ０畅２mg m L and I C５０ VC is ０畅０７５mg m L How ever within selected dosage t he hig hest scavenging capacity of flavonoids ou tw eighs t hat of V C T he tests sho w the suitability of flavonoid as good natural radical scavenger Key words Ultrasonic wave Co rn唱bract Flavonoid Antioxidative R eceived M arch ２２２００６ revised June ３２００６玉米在我国分布广泛总产量已多年突破１０亿 t 大量的玉米苞叶没有得到有效利用王开发等１用从玉米花粉中提取的黄酮类物质进行清除自由基的作用研究结果表明玉米花粉黄酮类物质有良好的抗氧化作用但用玉米花粉作为原料来提取黄酮类物质显然会对玉米的受精产生影响而用玉米成熟后的苞叶等做原料就不会有此后果目前超声提取技术已在油脂蛋白质多糖色素等物质提取中得到应用２秦炜３等采用超声浸提姜黄素不但缩短了浸取时间而且提高了姜黄素的提取率抗氧化的体外测定方法可分为物理法和化学法物理法应用较多的是电子自振 Elect rom Spin Resonance ESR 法４但由于仪器较贵不宜推广化学法主要有 P V 油脂过氧化值法化学发光法和比色法等 P V 法是利用抗氧化剂对食用油脂氧化的抑制能力来比较抗氧化能力的强弱通过测定油脂 P V 值的变化进行抗氧化剂活性的定性定量试验化学发光法是利用自由基氧化发光剂使之处于激发态当退激发时会发光此体系的发光强度和自由基含量成正比因此可用发光仪根据发光强度来测定受试物的抗氧化能力比色法是利用某些体系在氧化或自氧化过程中生成自由基自由基与某些化合物作用产生具有特定吸收的有色物质用分光光度计进行测定可间接判断受试物对自由基的清除作用５对于不同的抗氧化剂其抗氧化能力可根据清除５０原始自由基所用的抗氧化倡石河子大学高层次人才科研基金项目资助倡倡通讯作者收稿日期２００６唱０３唱２２改回日期２００６唱０６唱０３

2 第 6 期詹萍等 : 玉米苞叶中总黄酮提取及其体外抗氧化性能的研究 109 物剂量 (IC 50) 的大小来比较, 也有人认为用 AE( 是指达到 IC 50 时的时间 ) 来评价抗氧化能力, 由于考虑到了 [6] 时间因素, 因而比 IC 50 更具辨别力,IC 50 值越小,AE 越短, 则抗氧化剂的抗氧化能力越强本试验以西北农林科技大学试验田陕单 16 玉米苞叶为原料, 研究了超声波提取玉米苞叶中总黄酮的最佳工艺及玉米苞叶中总黄酮的体外抗氧化作用, 并对其清除自由基的能力进行评价, 为综合开发利用玉米苞叶资源提供参考, 同时为玉米苞叶中总黄酮的开发利用提供依据 1 试验材料及方法供试玉米苞叶采自西北农林科技大学试验田, 芦丁标准品和二苯代苦味酰肼自由基 ( DPPH) 购于 sigma 公司, 其他化学试剂均为分析纯或化学纯 [7] 1 畅 1 黄酮测定方法原理以芦丁为对照品, 运用分光光度法测定玉米苞叶中总黄酮含量, 加入铝离子试剂使黄酮化合物与铝盐形成络合物在可见光内获得稳定的吸收峰 1 畅 2 标准曲线绘制精确称取芦丁对照品 10 畅 0mg, 置于 25mL 容量瓶中, 加 80 % 乙醇溶解, 定容精确吸取 0 畅 0mL 0 畅 2mL 0 畅 4 ml 0 畅 6 ml 0 畅 8 ml 1 畅 0mL 1 畅 2mL 1 畅 4mL 置于 10mL 容量瓶中, 加 5% 亚硝酸钠 0 畅 3mL, 放置 6min, 再加 10 % 硝酸铝 0 畅 3mL, 放置 6min, 加 4% 氢氧化钠 4 畅 0mL, 加水至刻度, 摇匀,5 10 nm 处测黄酮含量, 以 510nm 处测得的吸光度 A( y) 对浓度 C( x) 回归, 得出回归方程 [8] 1 畅 3 提取工艺流程设计及主要影响因子确定提取工艺流程设计为 : 玉米苞叶 (2 畅 0g) 浸泡超声提取过滤蒸发浓缩萃取定容 (100mL) 吸取 (2mL) 定容 (10mL) 测吸光度本试验主要讨论乙醇浓度料液(g/mL) 超声时间和温度对玉米苞叶中黄酮提取率的影响, 通过预试验可以看出, 浓度在 0~50% 的乙醇所得提取液为棕黄色,55% ~95% 的乙醇所得提取液为绿色至墨绿色, 说明乙醇浓度超过 55 % 时, 玉米苞叶中的叶绿素被提取出来, 而叶绿素对紫外线吸收存在干扰, 使测量结果偏高, 故本试验将提取混浊液用 60 ~ 90 沸腾的石油醚萃取 3 次, 去除叶绿素后进行测定所测样品吸光度值经标准曲线回归方程换算后, 得出提取液总黄酮浓度, 然后按式 (1) 计 [9] 算提取率 : E = m/ M 100 % (1) 式中,E 为提取率,m 为经换算后提取液中总黄酮质量 (g),m 为样品质量 (g) 1 畅 4 玉米苞叶总黄酮的体外抗氧化性研究以 Vc 作对照, 采用超氧阴离子自由基体系羟基自由基体系及 DPPH 自由基体系对玉米苞叶总黄酮的抗氧化性进行试验 [10] 超氧阴离子自由基体系 : 取 0 畅 05mol/L ph 为 8 畅 2 的 Tris 唱 HCL 缓冲液 4 畅 5mL, 置于 25 水浴中预热 20min, 分别加入 1mL 试样和 0 畅 4mL 25mmol/L 的邻苯三酚溶液, 混匀后于 25 水浴中反应 5min, 加入 8mol/L HCl1 畅 0mL 终止反应, 以 Tris 唱 HCL 缓冲液作参比, 在 299nm 处测定吸光度, 计算清除率空白对照组以 1mL 试样溶剂代替样品, 每个处理均做 3 个重复清除率计算公式为 : 超氧阴离子自由基清除率 =100% ( A 0 - A 1)/ A 0 (2) 式中,A 0 为空白的平均吸光度,A 1 为试样的平均吸光度 [11] 羟基自由基体系 : 羟基自由基由 Fenton 反应产生在 10mL 具塞试管中依次加入 10mmol/L 的水杨酸溶液 0 畅 5mL 0 畅 2 mol/l 的磷酸缓冲液 (ph =7 畅 4)3mL 3 畅 8 mmol/l Fe 2+ 唱 EDTA(1 1) 溶液 0 畅 5mL 待测液 1mL, 最后加入 1mL 4mmol/L H2 O 2 溶液启动反应, 于 25 水浴中反应 90min 后, 加入 1mL 6mol/L HCl 终止反应, 再加入 0 畅 5g NaCl,4mL 冷的乙醚充分混匀, 静置后移取上层乙醚 3mL 于 10mL 离心管内, 在 40 恒温水浴中蒸干乙醚, 之后依次加入 10 % 三氯乙酸 ( W/ V )0 畅 15mL 10 % 钨酸钠 ( W/ V )0 畅 25mL 0 畅 5 % NaNO 2(W/V)0 畅 25mL, 混匀放置 5min 后, 加入 1mol/L NaOH 溶液 0 畅 25mL, 滴加去离子水至 4mL, 混匀, 在 510nm 处测定吸光度, 计算清除率空白用 1mL 试样溶剂代替试样, 每个处理均做 3 个重复清除率计算公式为 : 羟基自由基清除率 =100% ( A 0 - A 1)/ A 0 (3) [12] DPPH 自由基体系 : 将玉米苞叶总黄酮和 Vc 分别用 ph 3 的缓冲液和水配成 0 畅 05mg/mL

3 110 中国生态农业学报第 15 卷 0 畅 1mg/mL 0 畅 2 mg/ml 0 畅 4 mg/ml 0 畅 8 mg/ml 1 畅 6 mg/ml 等浓度的溶液备用, 另配制 0 畅 05mol/L Tris 唱 HCl (ph =7 畅 4) 缓冲液浓度为 2 畅 mol/l DPPH 的 95 % 乙醇溶液, 避光保存取 1mL 试样与 2mL DPPH 乙醇溶液混合, 再加入 2mL Tris 唱 HCl( ph =7 畅 4) 缓冲液并剧烈摇动, 在室温下避光保存 20min, 之后在 517nm 处测定吸光值, 每个处理均做 3 个重复各试样对 DPPH 自由基的清除率用式 (4) 计算 : DPPH 自由基的清除率 =100% ( A 0 - A 1)/ A 0 (4) 式中, 空白 A 0 为 1mL 试样溶剂 +2mL DPPH +2mL Tris 唱 HCl 缓冲液, 另外每个试样测定前需用 1mL 试样 +2mL Tris 唱 HCl 缓冲液对照调零, 以消除试剂本身颜色带来的误差 2 结果与分析 2 畅 1 标准曲线绘制按照 1 畅 2 所设计的芦丁浓度梯度进行标准曲线绘制, 结果见图 1 2 畅 2 单因素试验结果料液比对黄酮提取率的影响称取物料 2 畅 0g, 用 80 % 的乙醇分图 1 标准曲线别配制的料液比 (g/ml) 浸 Fig 畅 1 The normal curve 泡 24h, 在超声功率为 700W 45 条件下提取 25min, 各提取 3 次, 求平均值, 结果见图 2a 图 2a 表明, 随料液比的下降, 提取液吸光度增大, 在料液比值为 0 畅 02 ~ 0 畅 1 范围内, 吸光度增加幅度较大, 当料液比值 <0 畅 02 时, 吸光度增加趋势较为缓慢, 根据生产需要及最大限度降低叶绿素的干扰程度, 选料液比为 1 50 为宜乙醇浓度对黄酮提取率的影响称取物料 2 畅 0g, 分别用浓度为 20 % 30 % 40 % 50 % 60 % 70 % 80 % 的乙醇配制料液比为 1 40 溶液, 浸泡 24h, 在超声功率为 700W 4 5 条件下提取 25min, 每一个浓度条件下分别提取 3 次, 求平均值, 结果见图 2b 图 2b 表明, 随乙醇浓度的增加吸光度变大, 乙醇浓度为 60 % 时提取液吸光度达到最大值 0 畅 390, 但当乙醇浓度继续增加时提取液吸光度迅速下降乙醇浓度对提取率的影响, 在于不同含量乙醇极性的不同根据相似相溶原理,6 0 % 乙醇浓度对玉米苞叶黄酮溶解度最大超声温度对黄酮提取率的影响称取物料 2 畅 0g, 用 80 % 的乙图 2 料液比 (a) 乙醇浓度(b) 温度(c) 及提取时间 (d) 对黄酮提取率的影响醇配制 1 40 的料液比 (g/ml) 浸泡 Fig 畅 2 The influence of proportion of materials(a),concentration of ethanol(b), 24 h, 在超声功率为 700W 分别在 ex tracting temperature(c) and ex tracting time (d) to the extracting rate of flavonoid 条件下提取 25min, 各温度条件下分别提取 3 次, 求平均值, 结果见图 2c 在乙醇沸点以下并保证溶剂回流较完全的情况下, 温度越高, 浸提效果越好, 本文选用温度 60 超声时间对黄酮提取率的影响称取物料 2 畅 0g, 用 80 % 的乙醇配制 1 40 的料液比 (g/ml) 浸泡 24 h, 在超声功率为 700W 45 条件下分别提取 10min 1 5 min 2 0 min 25 min 30 min 35 min 40 min, 每一时间段内分别提取 3 次, 求平均值, 结果见图 2d 图 2d 表明, 提取液吸光度随提取时间的延长而逐渐升高由于超声过程中伴有热能的产生, 使得提取液升温有可能造成黄酮活性组分的损失 ; 同时从节约能源的角度考虑, 提取时间不宜过长, 以 30~40min 为宜

4 第 6 期詹萍等 : 玉米苞叶中总黄酮提取及其体外抗氧化性能的研究畅 3 正交试验结果以黄酮提取率为指标, 以单因素各影响因子为研究对象, 进行 L 9 (3 4 ) 正交试验, 结果见表 1 正交试验结果表明, 提取时间对玉米苞叶中总黄酮提取率影响最大, 其次为乙醇浓度, 料液比对提取率影响最小选择料液比为 1 50 乙醇浓度 60 % 提取温度 60 提取时间为 35min, 即提取工艺最佳优化组合为 A 2B 2 C 2 D 3 在 700W 的超声功率条件下, 依照最佳进行提取, 提取率可达 1 畅 225 % 2 畅 4 玉米苞叶总黄酮的体外抗氧化性能玉米苞叶总黄酮对超氧阴离子自由基的清除作用见图 3a 玉米苞叶总黄酮对超氧阴离子自由基有显著清除作用, 表 1 正交试验结果 Tab 畅 1 T he result of the distilled conditions test 试验号因素 Factor 吸光度 Code A 料液比 /g ml - 1 B 乙醇浓度 /% Proportion of material Ethanol concentration C 温度 / Temperature D 时间 /min Absorbency Time 1 1(1 40) 1(50) 1(45) 1(25) 0 畅 (1 40) 2(60) 2(60) 2(30) 0 畅 (1 40) 3(70) 3(75) 3(35) 0 畅 (1 50) 1(50) 2(60) 3(35) 0 畅 (1 50) 2(60) 3(75) 1(25) 0 畅 (1 50) 3(70) 1(45) 2(30) 0 畅 (1 60) 1(50) 3(75) 2(30) 0 畅 (1 60) 2(60) 1(45) 3(35) 0 畅 (1 60) 3(70) 2(60) 1(25) 0 畅 381 K1 1 畅畅畅畅 032 T = 3 畅 350 K2 1 畅畅畅畅 107 K3 1 畅畅畅畅 211 R 0 畅畅畅畅 179 其 IC 50 在 1 畅 5μg/mL 左右, 当总黄酮浓度在 50 畅 0μg/mL 时, 消除率达到 94 畅 90 %, 基本上达到最大值而 Vc 在较低的浓度范围内, 消除率呈负值, 说明在此浓度范围内 Vc 对超氧阴离子自由基不但没有清除作用, 反而可能产生促进作用 ;Vc 浓度在 5 畅 0μg/mL 时, 消除率只有 0 畅 04 %, 在此之后, 随浓度的提高, 消除率逐渐增加, 当 Vc 浓度为 500μg/mL 时, 消除率基本达到最大值 84 畅 50 %,Vc 的 IC50 在 90μg/mL 说明玉米苞叶总黄酮对超氧阴离子自由基的清除能力较好, 远远高于 Vc 对超氧阴离子自由基的清除能力图 3 玉米苞叶总黄酮和 Vc 对超氧阴离子自由基 (a) 羟基自由基(b) 和 DPPH 自由基 (c) 的清除效果 Fig 畅 3 The scavenging capacity of flavonoids and Vc in superoxide radical system(a),hydroxyl radical system(b)and DPPH system(c) 玉米苞叶总黄酮对羟自由基的清除作用见图 3b 玉米苞叶总黄酮和 Vc 对羟自由基有较高的清除能力, 随玉米苞叶总黄酮和 Vc 浓度的升高, 它们对羟基自由基的清除能力逐渐增强, 在 0 畅 05 ~ 1 畅 6mg/mL 浓度范围内, 总黄酮和 Vc 对羟基自由基的消除率为 44 畅 70 % ~ 72 畅 00 % 和 31 畅 40 % ~ 56 畅 10 %, 总黄酮的 IC50 为 0 畅 14mg/mL 左右,Vc 的 IC 50 为 0 畅 74mg/mL 左右, 说明玉米苞叶总黄酮清除羟基自由基的能力强于 Vc 玉米苞叶总黄酮对 DPPH 自由基的清除作用见图 3c 在 0 畅 05 ~ 0 畅 8mg/mL 的浓度范围内, 玉米苞叶总黄酮对 DPPH 自由基的消除率为 15 畅 23 % ~ 93 畅 40 %, 并且随浓度的升高, 对 DPPH 自由基的清除能力显著增强, 而作为对照的 Vc, 在所选浓度范围内, 对 DPPH 自由基的消除率为 42 畅 32% ~84 畅 6%, 且在浓度达到 0 畅 8mg/mL 后, 对 DPPH 自由基的消除率基本趋于平缓状态, 当消除率达到 50 % 时, 玉米苞叶总黄酮的 IC50 为 0 畅 2mg/mL 左右,Vc 的 IC 50 为 0 畅 075mg/mL, 说明总黄酮清除 DPPH 自由基的能力低于 Vc, 但最大消除率高于 Vc, 基本上能清除所有 DPPH 自由基 3 小结与讨论玉米苞叶黄酮最佳提取工艺条件为料液比 1 50 乙醇浓度 60 % 提取温度 60 提取时间 35min, 最大

5 112 中国生态农业学报第 15 卷提取率为 1 畅 225 % ; 玉米苞叶总黄酮对超氧阴离子自由基有显著清除作用, 随浓度的提高, 清除率逐渐增加, 最大清除率为 94 畅 90 %,IC 50 为 1 畅 5μg/mL 左右, 玉米苞叶总黄酮和 Vc 对羟自由基有较高的清除能力, 随玉米苞叶总黄酮和 Vc 浓度的升高, 它们对羟基自由基的清除能力逐渐增强, 总黄酮的 IC50 为 0 畅 14mg/mL 左右,Vc 的 IC 50 为 0 畅 74mg/mL 左右, 玉米苞叶总黄酮清除羟基自由基的能力强于 Vc, 玉米苞叶总黄酮和 Vc 对 DPPH 自由基的清除率随浓度的升高而逐渐增强, 玉米苞叶总黄酮的 IC 50 为 0 畅 2mg/mL 左右,Vc 的 IC 50 为 0 畅 075mg/mL, 说明总黄酮清除 DPPH 自由基的能力低于 Vc, 但最大消除率高于 Vc 本研究尝试利用超声技术进行玉米苞叶总黄酮提取, 主要是考虑到超声提取作为一个物理过程, 可以缩短提取时间, 又可避免可能的化学反应和所提化合物的分解, 为进一步研究玉米苞叶黄酮类物质及其生理活性作用机理奠定基础从抗氧化性试验结果可以看出, 玉米苞叶总黄酮清除自由基的能力很大程度上依赖黄酮浓度剂量的变化, 且在超氧阴离子体系和 DPPH 自由基体系中, 玉米苞叶总黄酮的最大清除效果可能存在一个阈值, 也就是说当清除能力达到某一水平时, 随黄酮浓度剂量的增加, 清除自由基的效果变化很小这对玉米苞叶总黄酮作为抗氧化剂使用时如何控制其使用量有很好的指导意义参考文献 1 赵保路. 氧自由基和天然抗氧化剂. 北京 : 科学出版社, ~ 胡爱军, 郑捷. 食品工业中的超声提取技术. 食品与机械,2004,20(4) :57 ~ 60 3 秦炜, 郑涛, 原永辉, 等. 超声场对姜黄素提取过程的强化. 清华大学学报 ( 自然科学版 ),1998,38(6) :46 ~ 48 4 高中洪, 黄开勋, 徐辉碧. 黄岑黄酮对自由基的清除作用的 ERS 研究. 华中理工大学学报,1999,27(1) :97 ~ 99 5 李蜀眉, 宋刚, 田维平, 等. 桔皮中黄酮化合物清除自由基的研究. 内蒙古农业大学学报 ( 自然科学版 ),2004,25(3) :89 ~ 91 6 胡春, 丁霄霖. 黄酮类化合物在不同氧化体系中抗氧化作用研究. 食品与发酵工业,1996 (3) :46 ~ 53 7 陈运中. 苦荞麦黄酮含量的测定. 食品科学,1998,19(3) :54 ~ 56 8 邵立波, 郑文德, 何艳贞. 葛根中黄酮类化合物的提取. 林业科学研究,1996,9(4) :400 ~ 中国科学院上海药物研究所植物化学研究室. 黄酮类化合物鉴定手册. 北京 : 科学出版社, 范晓, 严小军, 房国明, 等. 高分子量褐藻多酚抗氧化性质研究. 水生生物学报,1999,23(5):494~ 贾之慎, 邬建敏, 唐孟成. 比色法测定 Fenton 反应产生的羟自由基. 生物化学与生物物理进展,1996,23(2) :184 ~ Chow S.T.,Chao W.W.,Chung Y.C.Antioxidative activity and safety of 50 % ethaolic red extract.journal of Food Science,2003,68(1) : 21 ~ 25

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Microsoft Word 夏旭-1.doc 5 1 Vol. 5 No. 1 2014 1 Journal of Food Safety and Quality Jan., 2014 夏旭 1, 周爱梅 1*, 卢敏 1, 刘欣 1, 李启圣 2, 李少华 2 (1., 510642; 2., 510545) 摘要 : 目的, 方法, C (L-ascorbic acid),, DPPH 结果 1:90 (w:v) 50 s 3 h 320