中国组织化学与细胞化学杂志 476 第 26 卷 cell lung carcinoma, NSCLC) 上表达的报道本实验通过免疫组织化学方法检测上述两者在非小细胞肺癌组织中的表达, 着重讨论二者与非小细胞肺癌的病理组织学分级肿瘤 TNM 分期及淋巴结转移间的相关性, 探讨其是否参与非小细胞肺

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殷羊
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1 第 26 卷第期 2017 年月中国组织化学与细胞化学杂志 CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY Vol.26.No. October.2017 AMFR 和 C-Met 在非小细胞肺癌组织中的免疫组织化学表达及其与肿瘤增殖活性的关系 * ( 1 萍乡市人民医院, 萍乡 3000; 2 湘雅萍矿合作医院, 萍乡 3000; 3 厦门大学附属中山医院, 厦门 3600) 摘要目的通过研究非小细胞肺癌组织中自分泌运动因子受体 (autocrine motility factor receptor, AMFR) 与肝细胞生长因子受体 (hepatocyte growth factor receptor, HGF-R/C-Met) 的表达, 探讨二者与临床病理特征的关系及其与肿瘤细胞增殖活性的关系方法采用 SP 法免疫组织化学检测肿瘤组织中 AMFR C-Met 和 PCNA 的表达, 并计算增殖细胞核抗原指数 (PCNA Index,PI) 结果 AMFR 表达的总阳性率为 4.1%, 其中, 低分化组 AMFR 阳性表达率明显高于中 - 高分化组 ; 有淋巴结转移组阳性表达率明显高于无淋巴结转移组阳性表达率 C-Met 的阳性率为 61.3%, 其中, 低分化肿瘤组织中 C-Met 阳性表达率明显高于中 - 高分化组 ; 有淋巴结转移组阳性表达率明显高于无淋巴结转移组阳性表达率 ;TNM 分期 I-IIIA 期中 C-Met 阳性表达率为 3.7% 显著低于 IIIB-IV 组阳性表达率此外,AMFR 与 C-Met 的表达率呈显著正相关,AMFR C- Met 阳性表达组的 PI 值明显高于阴性组结论 AMFR C-Met 两者可能在非小细胞肺癌的发展转移中起着重要的作用关键词非小细胞肺癌; 自身分泌活动因子受体 ; 肝细胞生长因子受体 ; 细胞增殖中图分类号 R73- 文献标识码 A DOI:.70/ j. cnki Immunohistochemical expressions of AMFR and C-Met in non-small cell lung cancer and their relationship with tumor proliferative activity Zhang Zuhua 1, Li Ming 2, Dong Limin 2, Jiang Xingtang 3* ( 1 Pingxiang People s Hospital, Pingxiang 3000, China; 2 Xiangya Pingkuang Hezuo Hospital, Pingxiang 3000, China; 3 Zhongshan Hospital XiamenUniversity, Xiamen 3600) Abstract Objective To study the expression of autocrine motility factor receptor (AMFR) and hepatocyte growth factor receptor (HGF-R/C-Met) in non-small cell lung cancer (NSCLC). The relationship between the expressions and cancer clinicopathologic features as well as proliferative activity was also explored. Methods The expressions of AMFR, C-Met and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in tumor tissue specimens were examined using S-P immunohistochemistry. The PCNA Index (PI) was calculated. Results The expression of AMFR highly correlated with C-Met. The overall positive rates were 4.1% (AMFR) and 61.3% (C-Met) in all investigated cases, where patients with poorly differentiated tumor cells and lymph node metastasis had significantly higher positivity than those with well differentiated cells and clean lymph nodes. C-Met expression was also found to correlate with TNF classification where its positive rate was 3.7% and 2.% in I-IIIA and IIIB-IV respectively. The PCNA Indexes were significantly higher in AMFR and/or C-Met positive tumors than those negative ones. Conclusion The expression of AMFR and C-Met had strong correlation with clinicopathological features and tumor cell proliferation which may suggest they play an important role in the progression and metastasis of the cancer. Keywords Non small-cell lung cancer; autocrine motility factor receptor; hepatocyte growth factor receptor ; cell proliferation 在我国, 肺癌发病率及死亡率均迅速增长, 生存率仅约 %, 大多数患者死于后期肿瘤的复发和转移恶性肿瘤的复发浸润及转移与肿瘤细胞运收稿日期修回日期作者简介张祖华, 男 (14 年 ), 汉族, 主治医师 * 通讯作者 (To whom correspondence should be addressed): xmzsjxt@3.com 动能力是呈正向关系的 [1] 因此, 寻找与肿瘤细胞增殖运动相关的作用靶点, 已成为肿瘤研究的热点作为与细胞运动相关的重要细胞因子受体, 自分泌运动因子受体 (autocrinemotility factor receptor, AMFR) 和肝细胞生长因子受体 (hepatocyte growth factor receptor, HGF-R/C-Met) 在肿瘤的恶性演进侵袭转移及预后均起了重要的作用目前国内外还未见有 AMFR 联合 C-Met 在非小细胞肺癌 (non small

2 中国组织化学与细胞化学杂志 476 第 26 卷 cell lung carcinoma, NSCLC) 上表达的报道本实验通过免疫组织化学方法检测上述两者在非小细胞肺癌组织中的表达, 着重讨论二者与非小细胞肺癌的病理组织学分级肿瘤 TNM 分期及淋巴结转移间的相关性, 探讨其是否参与非小细胞肺癌的发展浸润及转移与此同时, 通过检测计算肿瘤细胞增殖活性相关指标, 讨论上述两个细胞因子与肿瘤细胞增殖活性的关系, 以揭示两者作为肺癌治疗靶点的潜在价值材料和方法 1 标本收集厦门大学附属中山医院病理科年间手术切除的非小细胞肺癌病例存档蜡块共计 111 例, 术前均未接受任何治疗 ; 其中男性 7 例, 女性 36 例 ; 中位年龄为 62 岁 (33~2 岁 ); 有无吸烟史的分别是 62 例和 4 例, 肿瘤大小大于 3cm 及小于或等于 3cm 的分别有 60 例和 1 例经病理学诊断, 鳞状细胞癌 3 例, 腺癌 7 例, 其他类型 ( 包括表皮粘液样癌腺鳞癌等 ) 例 ; 低分化癌 23 例, 中 - 高分化例 ;TNM 分期根据 200 年 UICC 修订版, 基于肿瘤复发及转移的概率以及与预后的关系, 将肿瘤的分期分为两组, 其中 I-IIIA 期 2 例, IIIB-IV 期 2 例 ; 有淋巴结转移例, 无淋巴结转移的为 3 例 2 免疫组织化学染色浓缩型兔抗人 AMFR 多克隆抗体 (ab 7641) 购自 Abcam 公司, 工作浓度为 (1:200); 即用型兔抗人 C-Met(ZA-04) 试剂购自北京中杉金桥, 即用型兔抗人 PCNA 试剂购自福州迈新公司 ;S-P 免疫组织化学试剂盒及 DAB 试剂盒购自福州迈新公司非小细胞肺癌组织常规石蜡包埋,4μm 厚连续切片 4 张, 采用 S-P 法进行 AMFR 和 C-Met 免疫组织化学染色, 主要步骤如下 : 常规脱蜡, 水化 ; 抗原修复过夜,3% H 2 O 2 消化内源性过氧化物酶 ;% 羊血清封闭 ; 一抗 4 冰箱过夜 ; 二抗, 室温孵育 30min;DAB 镜下控制染色, 流水冲 min; 苏木素核复染 ; 脱水透明封片观察以磷酸盐缓冲液 (PBS) 代替一抗作为阴性对照, 用以证实含有靶抗原阳性切片作为阳性对照 3 结果判定 AMFR [2] 以癌细胞内出现明确的胞膜或胞质着棕黄色为阳性, 阳性百分率 <% 为阴性 (-), %~0% 为阳性 (+), 0% 为强阳性 (++), 只计数癌细胞, 不计数非癌组织 C-Met [3] 阳性染色判断 : 不着色为 0 分, 浅棕黄色为 1 分, 棕黄色为 2 分, 深棕黄色为 3 分, 染色范围 : 阳性细胞数 <30% 为 1 分, 30% 为 2 分, 以染色深度与阳性细胞的百分比乘积为判定标准,0-1 分为 (-),2-3 分为 (+),4-6 分为 (++) 增殖细胞核抗原指数 (PCNA Index, PI) 的计算 : 低倍镜下选取肿瘤细胞丰富的区域, 连续观察个高倍镜视野, 计算每个高倍镜下 0 个肿瘤细胞中 PCNA 阳性细胞核数, 取其平均值 4 统计学方法应用 SPSS17.0 统计分析软件, 采用 x 2 检验 Fisher 确切概率法 AVONA 方差分析及 Spearman 相关分析, 以 P < 0.0 为差异有统计学意义, 以 P < 0.01 为差异有极显著统计学意义结果 1 AMFR 表达率与 NSCLC 的分化程度和淋巴结转移相关免疫组织化学染色显示,AMFR 阳性免疫反应产物主要位于肿瘤细胞胞质及胞膜上 ( 图 1), 且跟具体肺癌病理分型无关 AMFR 在 NSCLC 中的表达与临床病理特征的关系如 ( 表 1):AMFR 的阳性表达为 33 例, 强阳性表达为 27 例, 总阳性率为 4.0% (60/111); 其中, 低分化组阳性表达率 (7.3%) 明显高于中 - 高分化组 (47.7%); 有淋巴结转移组阳性表达率为 7.%, 明显高于无淋巴结转移组阳性表达率 30.2%;AMFR 的表达与患者年龄性别抽烟史肿瘤大小组织学类型及 TNM 分期无关 2 C-Met 表达率与 NSCLC 的分化程度 TNM 分期和淋巴结转移相关 S-P 法免疫组织化学染色显示,C-Met 主要表达于肿瘤细胞胞质中 ( 图 2), 且上述染色在不同肺癌病理分型中无明显差别 C-Met 在 NSCLC 中的表达及与临床病理特征的关系 ( 表 1):C-Met 的阳性表达为 46 例, 强阳性表达为例, 总阳性率为 61.3%(6/111) 在分化程度不同的非小细胞肺癌组织中,C-Met 阳性表达存在差异 : 低分化肿瘤组织中,C-Met 总阳性表达率为 73.%(17/23), 而在中 - 高分化组中, 阳性表达率.0%(1/);

A, expression pattern of AMFR; B, enlarged image inside the box from A; scale bar, 0μm 表 1 NSCLC 组织中 AMFR 和 C-Met 的表达与临床病理特征的关系 Tab.

3 第期 477 张祖华等. AMFR 和 C-Met 在非小细胞肺癌组织中的免疫组织化学表达及其与肿瘤增殖活性的关系 I-IIIA 期中阳性表达率为 3.7% 44/2 低于 IIIB-IV 阳性表达率.7 20/3 低于有淋巴结转移组中期阳性表达率为 2.% /2 在 111 例 NSCLC 的表达率 2.% 4/ C-Met 的表达与年龄患者中无淋巴结转移的共有 3 例其中 C-Met 性别吸烟史肿瘤大小及组织学类型无关图 1 AMFR 在非小细胞肺癌鳞癌组织中的免疫组织化学表达 B A 中方框内放大图像比例尺 0μm Fig. 1 Immunohistochemical examination of NSCLC (squamous cell carcinoma) tissue. A, expression pattern of AMFR; B, enlarged image inside the box from A; scale bar, 0μm 表 1 NSCLC 组织中 AMFR 和 C-Met 的表达与临床病理特征的关系 Tab. 1 Relationship between the expressions of AMFR and C-Met in NSCLC tissues and tumor clinicopathological characteristics AMFR 表达临床病理特征 Clinicopathologicalcharacteristics 性别年龄抽烟史肿瘤大小病理学类型分化程度 TNM 分期淋巴结转移男 33 1 女有无腺癌 2 鳞癌其他 7 3 低中-高 I-IIIA IIIB-IV 11 N N1-N3 20 χ2 P > C-Met 表达 χ2 P 图 2 C-Met 在非小细胞肺癌腺癌组织中的免疫组织化学表达 B A 中方框内放大图像比例尺 0μm Fig. 2 Immunohistochemical examination of NSCLC (squamous cell carcinoma) tissue. A, expression pattern of C-Met; B, enlarged image inside the box in A; scale bar, 0μm

中国组织化学与细胞化学杂志 47 第 26 卷 3 AMFR 和 C-Met 表达与 NSCLC 细胞增殖活性呈正相关 PCNA 是评价细胞增殖状态的重要指标, 与细胞增殖周期有关 [4] 免疫组织化学检测显示,PCNA 定位于 NSCLC( 鳞癌和腺癌 ) 细胞核, 阳性染色为细胞核出现棕黄色颗粒 ( 图 3) 对增殖细胞核抗原指数与 AMFR 和 C-Met

4 中国组织化学与细胞化学杂志 47 第 26 卷 3 AMFR 和 C-Met 表达与 NSCLC 细胞增殖活性呈正相关 PCNA 是评价细胞增殖状态的重要指标, 与细胞增殖周期有关 [4] 免疫组织化学检测显示,PCNA 定位于 NSCLC( 鳞癌和腺癌 ) 细胞核, 阳性染色为细胞核出现棕黄色颗粒 ( 图 3) 对增殖细胞核抗原指数与 AMFR 和 C-Met 的表达强度的关系分析显示,AMFR 和 C-Met 的表达与 NSCLC 细胞的增殖均呈显著正相关 ( 表 2) 图 3 PCNA 在非小细胞肺癌组织中的免疫组织化学表达 A, 鳞癌 ;B, 腺癌 ; 比例尺,0μm Fig. 3 Immunohistochemical examination on the expression of PCNA in NSCLC tissue. A, squamous cell carcinoma; B, adenocarcinoma; scale bar, 0μm. 表 2 AMFR 和 C-Met 表达与 PI 的相关性 Tab. 2 Correlation between PI value and the expressions of AMFR and C-Met in NSCLC AMFR 表达例数 PI 值 P C-Met 表达例数 PI 值 P ± ± ±11. < ±. < ± ± NSCLC 中 AMFR 与 C-Met 表达之间呈正相关在 111 例 NSCLC 中,AMFR 及 C-Met 均呈强阳性表达的有例, 均呈阳性表达的有例, 两者同时阳性表达率约 34.2%, 两者阳性表达率成显著正相关 ( 表 3) 表 3 在 NSCLC 中 AMFR 和 C-Met 表达间的相关性 Tab. 3 Correlation between AMFR and C-Met expressions in NSCLC C-Met 表达 AMFR 表达 r P < 讨论肺癌与其他恶性肿瘤一样, 其发病与进展是一个多因素多阶段的复杂的过程, 无数的细胞因子及其受体参与到这个复杂过程中来肿瘤细胞在多种促运动相关因子或调节因子作用下, 在外界微环境改变刺激下, 通过自身结构的改变, 如片状伪足的形成增强自身的运动能力, 众多的运动因子或调节因子在肿瘤细胞运动过程中发挥了重要的作用 [1] 近几年来, 随着分子生物学与基因组学的迅猛发展, 关于恶性肿瘤越来越多的未知区域被得以发现与证实各种与细胞运动相关的细胞因子及其受体大致可分为 3 类 :1 刺激细胞运动与浸润的因子, 包括迁徙刺激因子自分泌运动因子 (autocrinemotility factor,amf) 等 ;2 刺激细胞生长与运动的因子, 包括肝细胞生长因子 (hepatocyte growth factor, HGF) 表皮生长因子 (epidermal growth factor, EGF) 等 ; 3 促进运动而抑制生长的因子, 如转化生长因子 (transforming growth factor,tgf) 和干扰素等自分泌运动因子受体 (AMFR), 又被称为 gp7, 其通过与其配体 AMF 结合, 激活其藕联的 G 蛋白, 随后由蛋白激酶 C(Protein Kinases C PKC) 酪氨酸激酶 - 脂氧合酶等介导信息传递, 刺激肌醇代谢, 短时间内可见肿瘤细胞外形发生改变, 胞膜凹凸不平, 伸出伪足从而促进细胞的运动与此同

5 第期张祖华等. AMFR 和 C-Met 在非小细胞肺癌组织中的免疫组织化学表达及其与肿瘤增殖活性的关系 47 时,AMF/AMFR 还可以通过刺激间叶细胞向上皮内皮细胞转变, 促进肿瘤细胞的生长及维持肿瘤的恶性增殖 [] C-Met 于 11 年被识别, 是原癌基因 C- Met 的编码蛋白, 属于受体酪氨酸蛋白激酶家族成员, 为 HGF 的上皮特异性受体, 可调控一种侵袭性生长的遗传程序, 参与许多生理发育过程以及肿瘤的侵袭和转移 [3] 因此, 在肿瘤细胞迁移运动过程中,AMF 与 HGF 被认为是极其重要的细胞因子成分, 两者能分解包括丝氨酸酶肝素酶及金属基质蛋白酶 MMP-2 MMP- 从而提高肿瘤细胞的运动能力以实现细胞的转移 [6] 因此, 对上述两细胞因子在细胞表面的细胞受体 (AMFR C-Met) 展开相关研究, 从而为寻找到更有效的抑制肿瘤运动与转移的作用靶点打下铺垫本研究检测到, 低分化 NSCLC 组织的 AMFR 阳性表达率显著高于中 - 高分化组, 有淋巴结转移的 NSCLC 组织 AMFR 阳性表达率明显高于无淋巴结转移者, 表明分化程度越差的肿瘤组织, 肿瘤细胞活动能力可能会更强, 从而导致肿瘤发生早期淋巴结或远处转移本研究还通过将 AMFR 蛋白的表达与肿瘤增殖活性相联系起来, 结果表明 AMFR 阳性表达组中 PI 值显著高于阴性表达组, 证实其与肿瘤细胞的增殖活性密切相关, 由此进一步提示 AMFR 对细胞增殖可能具有正向调控作用, 其机制可能为 AMFR 与其配体结合后, 使 MAPK 信号通路里两个重要成分 MEK1 MEK2 发生磷酸化, 从而激活整个 MAPK 信号通路, 并且上调肿瘤细胞 cyclin D1 及细胞周期素依赖性激酶表达, 同时抑制细胞周期素依赖性激酶的抑制物 P27kip1 活性, 从而促进肿瘤细胞从 G1 进入 S 期 [7] 另外,AMF/AMFR 还可通过下调凋亡蛋白刺激因子 (apoptotic protease activating factor-1,apaf1) 和 Caspase- 来强化细胞凋亡抑制以达到促使细胞恶性增殖, 且涉及到 PKC/MAPK PI3K 等复杂的信号传导途径 [] 我们的研究也发现, 在分化程度不同的肺癌组织中,C-Met 阳性表达存在差异, 其中, 低分化肿瘤组织中,C-Met 阳性表达率也高于中 - 高分化组, TNM 分期 I-IIIA 期阳性表达率低于 IIIB-IV 期在 111 例 NSCLC 患者中, 无淋巴结转移 C-Met 阳性表达率.7%(20/3) 较有淋巴结转移组中的表达率 2.%(4/) 低与此同时, 本实验中还通过比较 C-Met 阴性及阳性表达组中 PI 值发现,C-Met 阳性表达组中肿瘤细胞 PCNA 的阳性表达程度更强烈, 说明染色体处于分裂期的肿瘤细胞肿瘤数目更多, 其恶性程度亦越高, 可说明 C-Met 可能与肺癌细胞的增殖及分化密切相关有报道称 HGF 通过激活核转录因子 κβ(nf-κβ) 来调控细胞增殖, 通过 MAPK 级联反应使转录细胞因子 ( 如 ETS1 ATF2) 磷酸化, 上调细胞周期素 CyclinD1, 启动相应核基因的表达, 调控细胞周期, 引起细胞增殖 [] 实验结果还表明, 一方面,AMFR C-Met 在 NSCLC 组织中的阳性表达率呈显著正相关, 另一方面, 通过计算肿瘤增殖指数发现 AMFR C-Met 的表达均与肿瘤细胞的增殖活性密切相关, 可推测出两者在促进肿瘤细胞增殖方面存在某种其他联系, 这种联系需要更深入的实验加以证实此前, 通过在舌癌组织中 [1] 进行免疫组织化学及生存分析证实, 舌癌患者中 AMFR C-Met 同时阳性表达的无病生存时间比两者其中之一阳性表达的生存时间更短, 反映出两者间可能存在协同作用而促进肿瘤细胞的侵袭与转移, 显示两者作为肿瘤分子标记物对评估恶性肿瘤患者的预后存在相当大的价值 Jia [] 等的实验证明,HGF/C-Met 及 AMF/AMFR 途径有着共同的下游信号, 即 Rho 信号系统, 并通过刺激 Rho 系统激活 MAPK AKT/PKB 等复杂的信号途径, 促使肿瘤细胞伪足的形成, 增强肿瘤细胞的运动能力在国内, 王伟等 [11] 采用逆转录聚合酶链反应 (RT- PCR) 在半定量水平检测 2 例原发性肝细胞癌及对应的癌旁组织中的 AMFR 和 RhoC mrna 的表达, 结果发现 AMFR 与 RhoC 蛋白的过表达可促进肝癌细胞的浸润与发展, 推测 AMFR 与 Rho 信号系统在恶性肿瘤的发生发展过程中存在某种协作的关系, 这与前面文献中的表述是一致的参考文献 [1] 彭亦良, 梁后杰. 癌细胞运动与迁移的分子机制. 中国生物化学与分子生物学报,2006,():74-7. [2] Endo K, Shirai A, Furukawa M, et al. Prognostic value of cell motility activation factors in patients with tongue squamous cell carcinoma. Hum Pathol, 2006, (): [3] 高霞, 刁路明, 李恒, 等. 非小细胞肺癌中肝细胞生长因子受体蛋白表达及其与肿瘤细胞增殖血管生成的关

6 中国组织化学与细胞化学杂志 40 第 26 卷系. 武汉大学学报 ( 医学版 ),200,26(3): [4] 黄志伟, 蔡雪彦. P3 PCNA ki67 在大肠癌中的表达与临床意义. 中国组织化学与细胞化学杂志,2013, (6):0-. [] Iiizumi M1, Liu W, Pai SK, et al. Drug development against metastasis-related genes and their pathways:a rationale for cancer therapy. Biochem Biophys Acta, 200, 176(2):7-4. [6] Liu XD, Yao WQ, Newton RC, et al. Targeting the c-met signaling pathway for cancer therapy. Expert Opin Investig Drugs, 200, 17(7): [7] Haga A, Funasaka T, Deyashiki Y, et al. Autocrine motility factor stimulates the invasiveness of malignant cells as well as up-regulation of matrix metallo proteinase-3 expression via a MAPK pathway. FEBS Letters, 200, 2(13): [] Fairbank M, St-Pierre Nabi IR. The complex biology pfautocrine motility factor/phosphoglucoseisomerase(amf/ PGI) and its receptor, the gp7/amfr E3 ubiquitin ligase. Mol Biosyst, 200, (): [] Sierra JR. C-MET as a potential therapeutic target and biomarker in cancer.theradv Med Oncol, 2011, 3(1suppl): S21 S3. [] Jia Z, Vadnais J, Lu ML, et al. Rho/ROCKdependentpseudopodial protrusion and cellular blebbing are regulated by p3 MAPK in tumour cells exhibiting autocrine c-met activation. Biol Cell, 2006, (6): [11] 王伟, 杨连粤, 杨治力, 等. 自分泌运动因子受体和 RhoC 基因在肝细胞癌侵袭转移中的作用. 中华肝胆外科杂志,2004,(06):40-4.

864 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 6 期 2016 年 6 月 of apoptosis related factors, decrease the incidence of adverse reactions, which is of great

864 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 6 期 2016 年 6 月 of apoptosis related factors, decrease the incidence of adverse reactions, which is of great 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 6 期 2016 年 6 月 863 曲妥珠单抗联合多西紫杉醇治疗 Her-2 阳性乳腺癌的临床研究 * 周永安, 刘训碧黄石市中心医院 ( 普爱院区 ) 乳腺肿瘤外科, 湖北黄石 435000 摘要 : 目的探析注射用曲