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1 第 26 卷第 7 期中国现代医学杂志 Vol. 26 No 年 4 月 China Journal of Modern Medicine Apr DOI: /j.issn 文章编号 : (2016) 论著表皮生长因子受体及其 Ⅲ 型突变体在人食管癌的表达及意义朱彦红, 韩大正 ( 河南大学第一附属医院消化内科, 河南开封 ) 摘要 : 目的检测表皮生长因子受体 (EGFR) 及表皮生长因子受体 Ⅲ 型突变体 (EGFRvⅢ) 在人食管癌组织中的表达, 探讨其与食管癌发生发展的关系及其与各临床病理特征之间的关系方法采用免疫组织化学染色法 (Maxvision TM 二步法 ) 检测食管癌组织及正常食管组织中 EGFR 和 EGFRvⅢ 蛋白的表达水平, 并将检测结果与临床病理参数进行综合分析结果食管癌组织 EGFR 和 EGFRvⅢ 的表达率分别为 65.6% 58.5%, 正常食管黏膜 EGFR 和 EGFRvⅢ 表达率为 30.0% 0% EGFR 在食管癌组织的表达明显高于正常食管组织 ( <0.01),EGFRvⅢ 在正常食管黏膜不表达二者在食管癌组织的表达与性别年龄肿瘤大小和生长部位均无相关 ( >0.05), 与食管癌的分化程度淋巴结转移远隔器官转移及临床分期相关 ( <0.05) 结论 EGFR EGFRvⅢ 过度表达可能与食管癌的发生发展密切相关,EGFR EGFRvⅢ 有望作为预测食管癌预后的候选基因,EGFRvⅢ 在食管癌组织中特异性表达, 可能使其成为食管癌治疗的理想的靶点关键词 : 表皮生长因子受体 ; 表皮生长因子受体 Ⅲ 型突变体 ; 食管癌 ; 免疫组织化学中图分类号 :R735.1 文献标识码 :A Expressions of EGFR and EGFR variant 芋 in human esophageal carcinoma and their significance Yan-hong Zhu, Da-zheng Han (Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital, Henan University, Kaifeng, Henan , China) Abstract: Objective To detect expression of epidermal growth factor receptor (EGFR) and epidermal growth factor receptor variant 芋 (EGFRv 芋 )in human esophageal carcinoma and to explore its relation with the genesis and development of human esophageal cancer and its relationship with clinicopathological parameters. Methods Immunohistochemistry (Maxvision TM 2) was used to detect the expressions of EGFR and EGFRv 芋 protein in human esophageal cancer tissues of 58 cases and normal esophageal tissue specimens from 20 non-cancer patients. Results Positive expression rates of EGFR and EGFRv 芋 in the human esophageal can 原 cer tissues (65.6% and 58.5% respectively) were higher than those of the normal gastric tissues (30.0% and 0%, <0.01). EGFRv 芋 was not expressed in the normal esophageal tissue. Their expressions were irrelated with gender, age, tomor size or tumor location ( >0.05); but were closely related with the degree of differen 原 tiation, lymph node metastasis, distant metastasis and clinical stages of esophageal cancer patients ( <0.05). Conclusions Over-expression of EGFR and EGFRv 芋 may be closely related to initiation and progression of esophageal cancer. EGFR and EGFRv 芋 could be considered as the markers for predicting the prognosis of human esophageal cancer. And the specific expression of EGFRv 芋 in esophageal carcinoma can make it the ideal target of treatment of esophageal carcinoma. Keywords: EGFR; EGFRv 芋 ;esophageal cancer; immunohistochemistry 收稿日期 : [ 通信作者 ] 韩大正, hdyfyzyh@126.com;Tel:

2 第 7 期朱彦红, 等 : 表皮生长因子受体及其 Ⅲ 型突变体在人食管癌的表达及意义食管癌是常见的消化道肿瘤, 全世界每年大约有 30 万人死于食管癌, 中国为高发区, 死亡率每年约 15 万人, 严重危害人类的生命健康流行病学资料显示食管癌的人群分布与年龄性别职业种族地理生活环境饮食生活习惯遗传易感性等有一定联系不典型的早期症状使患者得到早期诊断成为一个难题, 虽然给予积极的临床治疗, 但食管癌患者和其他消化道肿瘤患者一样, 大部分死于转移或者肿瘤的复发因此研究食管癌的发病机制造有着重大意义目前对于表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor,egfr) 表皮生长因子受体 Ⅲ 型突变体 (epidermal growth factor receptor variant Ⅲ,EGFRvIII) 在食管癌中的表达情况和相关性研究报道并不多本研究应用免疫组织化学法检测食管癌患者肿瘤组织中 EGFR EGFRvⅢ 表达情况, 并进行统计学分析, 以期为食管癌患者预后综合性的个体化治疗方案的制定及分子靶向治疗提供有力的理论依据 1 材料与方法 1.1 材料研究组 58 份食管癌组织标本来源于河南大学第一附属医院 2013 年 6 月年 12 月经食管 - 胃 - 十二指肠镜活检标本, 并经组织病理学证实为食管鳞状细胞癌其中, 男性 38 例, 女性 20 例 ; 年龄 37~83 岁, 中位年龄 64 岁所有病例术前均未经放疗化疗和免疫治疗另外取 20 份正常食管黏膜组织标本 ( 来源于同时期接受内镜检查活检的非食管癌病例 ) 作为对照组 1.2 试剂 Rabbit Anti-EGFR( 浓缩型 ) RabbitAnti-EGFRv Ⅲ( 浓缩型 ) 均购自北京博奥森生物技术有限公司, 即用型快捷免疫组织化学 Maxvision TM 2 检测试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司 1.3 方法组织标本经 10% 中性甲醛溶液固定脱水石蜡包埋后, 连续切片 3 张, 厚 4μm,1 份作 HE 染色,1 份作 EGFRv Ⅲ 免疫组织化学染色,1 份作 EGFR 免疫组织化学染色免疫组织化学采用 Maxvision TM 二步方法, 所有标本在同一条件下染色 DAB 显色 ( 滴加一抗浓度为 1 600), 选用公司提供的已知 EGFRvⅢ EGFR 阳性表达的食管癌切片在同一条件下染色作为阳性对照, 以 PBS 代替一抗作为阴性对照免疫组织化学 Maxvision TM 二步方法 :165 烤片 4h 2 石蜡切片脱蜡和水化 3PBS 液冲洗 3 次, 每次 3min 4 抗原修复 : 浸泡于枸橼酸盐缓冲液 (ph 6.0) 中, 高压锅中煮沸 2min, 放至室温后用蒸馏水冲洗 2min 5 室温下浸泡于 3%H 2 O 2 中 10 min, 以消除内源性过氧化物酶活性 6PBS 冲洗,3 min 3 次 7 每张切片滴加 1 滴适当浓度的一抗 Rabbit Anti-EGFR 或一抗 Rabbit Anti-EGFRvⅢ 试剂, 室温下孵育 2h 8PBS 冲洗,2 min 3 次 9 每张切片滴加 1 滴即用型 Maxvision TM 2 试剂, 室温下孵育 30min 10PBS 冲洗,3 min 3 次 11 除去 PBS 液, 每张切片滴加 2 滴配置后的 DAB 显色液, 室温 25 显色, 显微镜下观察 3~5 min, 蒸馏水洗涤 12 自来水充分冲洗, 苏木素复染,PBS 冲洗返蓝 13 脱水, 透明, 封片 1.4 结果判定光学显微镜观察染色结果观察, 采用双盲法, 由 2 位病理科医生在不知临床资料的情况下读片, 在全切片的上下左右中随机选取一个 400 倍视野, 观察 5 个视野中阳性细胞的染色强度并计算阳性细胞数, 计算细胞总数不少于 1000 个, 按阳性细胞所占百分数分为 : 阳性细胞百分率 <5% 为阴性 (-);5% ~24% 为弱阳性 (+);25%~50% 为中度阳性 (++);> 50% 为强阳性 (+++) 1.5 统计学方法采用 SPSS 17.0 统计软件进行数据分析, 组间分析用 χ 2 检验或 Fisher 确切概率法, <0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 EGFR EGFRvⅢ 在食管癌和正常组织的阳性表达正常食管黏膜组织的 EGFRvⅢ 无阳性染色 ( 见图 1),EGFR 的阳性染色主要位于基底膜, 呈棕色或棕褐色沉淀, 点片状分布 ( 见图 2); 食管癌组织的 EGFR 表达和 EGFRvⅢ 阳性染色主要位于细胞膜, 呈棕色或棕褐色沉淀, 点片状分布, 胞浆也可见阳性表达, 细胞核无染色 ( 见图 3 4) 食管癌组织 EGFR 表达的阳性率为 65.6%(38/58), 正常组织 EGFR 阳性率 30.0%(6/20), 两组比较差异有统计学意 ( <0.05) 食管癌组织 EGFRvⅢ 阳性率为 58.5%(34/58), 正常组织阳性率为 0%(0/20), 两组比较差异有统计学意 25

中国现代医学杂志第 26 卷图 1 正常食管黏膜组织的 EGFRvⅢ 阴性表达 ( 400) 图 2 正常食管黏膜组织的 EGFR 阳性表达 ( 400) 图 3 食管癌组织的 EGFRvⅢ 阳性表达

EGFR 表达阴性 χ 2 值值食管癌组织对照组 58 34 24 38 20.784 0.000 20 0 20 6 20 14 7.630 0.006 义 ( <0.01)( 见表 1 ) 2.

值值 G 1+G 2 24 10 41.7 11 45.8 4.851 0.028 G 3 34 24 70.6 27 79.4 7.021 0.008 淋巴结转移无 34 12 35.3 15 44.

3 中国现代医学杂志第 26 卷图 1 正常食管黏膜组织的 EGFRvⅢ 阴性表达 ( 400) 图 2 正常食管黏膜组织的 EGFR 阳性表达 ( 400) 图 3 食管癌组织的 EGFRvⅢ 阳性表达 ( 400) 图 4 食管癌组织的 EGFR 阳性表达 ( 400) 表 1 正常食管黏膜组织和食管癌组织中 EGFR 和 EGFRvIII 表达组别例数 EGFRvⅢ 表达阳性阴性 χ 2 值值阳性 EGFR 表达阴性 χ 2 值值食管癌组织对照组义 ( <0.01)( 见表 1 ) 2.2 EGFR EGFRvⅢ 与临床病理特征的关系 EGFR 和 EGFRvIII 在食管癌组织的表达与性别年龄肿瘤大小和生长部位均无相关 ( >0.05), 与胃癌的分化程度淋巴结转移远隔器官转移及临床分期相关 ( <0.05)( 见表 2 ) 表 2 EGFR 和 EGFRvⅢ 表达与临床病理特征的关系临床病理特征分化程度例数 EGFRvⅢ 表达 EGFR 表达阳性阳性率 /% χ 2 值值阳性阳性率 /% χ 2 值值 G 1+G G 淋巴结转移无有远处转移无有临床分期 0+Ⅰ+Ⅱ Ⅲ+Ⅳ

4 第 7 期朱彦红, 等 : 表皮生长因子受体及其 Ⅲ 型突变体在人食管癌的表达及意义续表 2 EGFRvⅢ 表达 EGFR 表达临床病理特征例数阳性阳性率 /% χ 2 值值阳性阳性率 /% χ 2 值值性别男女覮年龄 >60 岁岁肿瘤大小 >5 cm cm 生长部位中段下段注 : 覮 Fisher 确切概率法所得值 (χ 2 α) 3 讨论 EGFR 是原癌基因 c-erbb-1 (HE-1) 的表达产物, 是相对分子量为的跨膜受体蛋白研究表明 EGFR 在与其配体结合后可以引起细胞生长增殖和分化, 在正常的细胞生理过程中发挥十分重要的调控作用 EGFR 的活化可促进肿瘤细胞增殖血管生成浸润和转移, 以及抑制细胞凋亡目前已知 EGFRvⅢ 有 3 种突变体, 即 EGFRv Ⅰ EGFRv EGFRvⅢ, 其中,EGFRvⅢ 是 EGFR 最常见的删除突变型 EGF 受体相对于 EGFR 而言, EGFRvIII 基因中有 801 个碱基对被删除, 导致胞外区 6~273 位氨基的缺失, 而在融合交点新产生一个 [1] 甘氨酸, 导致受体不依赖于配体的组成性激活, 从而诱发细胞的异常增殖肿瘤的发生本研究中作者发现,EGFR 和 EGFRvⅢ 在食管癌的表达与患者的年龄性别肿瘤大小生长部位无相关 ( >0.05) 随着细胞分化程度的降低,EGFR 和 EGFRvⅢ 的阳性表达率明显增高, 表明肿瘤细胞恶性程度越高,EGFR 和 EGFRvⅢ 表达也越强 ; 伴有淋巴结转移的食管癌组织中 EGFR 和 EGFRvⅢ 阳性表达率明显高于未发生淋巴结转移者 ( <0.05); 伴有远隔器官转移的食管癌的 EGFR 及 EGFRvⅢ 表达明显高于无远隔器官转移者 ( <0.05); 临床分期为 Ⅲ 期和 Ⅳ 期食癌患者的 EGFR EGFRvⅢ 阳性表达率明显高于临床分期 Ⅰ 期和 Ⅱ 期者 ( <0.05) 这表明 EGFR 和 EGFRvⅢ 被激活并参与食管癌的浸润及淋巴结转移, 并随着肿瘤的浸润转移能力的增强和病情的进展,EGFR 和 EGFRvⅢ 表达也越强 ; 随着浸润转移能力的增强和病情的进展,EGFR 表达也增强, 且 EGFR 过度表达组的食管癌患者预后明 [2] 显较对照组为差 ;Zhang 等研究发现 EGFR 高表达的食管癌, 其生存率低于低表达,EGFR 可以作为食 [3] 管癌预后的预测指标 ; 王建正等研究也发现 EGFR 的高表达可能参与了食管癌的发生发展过程, 在食管癌的侵袭和转移过程中发挥了重要作用, 可作 [4] 为预测食管癌预后的重要指标 ; 王玉峰等 Wang [5] 等研究发现 EGFR 过表达与食管癌发生发展及预 [6] 后密切相关刘敏等研究发现 EGFRvⅢ 在食管癌特异性表达,EGFR 与 EGFRvⅢ 与食管癌发生发展密切相关这与该研究结果一致另外在其他一 [7] 些肿瘤的研究中, 如杨永滨等在乳腺癌的研究中认为 EGFRvⅢ 可能参与乳腺癌的发生, 可能在乳腺癌 [8] 的浸润过程中起重要作用 ; 蒋艳霞等在肝癌的研究中发现 EGFR 可以作为新的预测原发性肝癌浸润转移判断预后和指导临床靶向治疗的重要因子, 为肝癌的基因治疗提供理论依据可以推测,EGFR EGFRvⅢ 的表达是食管癌细胞逃避机体免疫监视和杀伤, 建立食管癌发生发展及复发转移的重要机制之一, 可作为手术切除后预测食管癌复发转移的参考指标 EGFRvⅢ 很早就被认为是一种肿瘤特异性表达 27

5 中国现代医学杂志第 26 卷 EGFR 突变体, 在胚胎神经等正常组织中不能检出目前已有很多研究提示在人类肿瘤细胞中检测到 [9] [6] [10] EGFRvⅢ, 如人肾透明细胞癌乳腺癌及胃癌等本研究中作者发现,EGFRvⅢ 在正常组织阳性染色率为 0%, 而在食管癌组织中阳性染色率为 58.6%, 提示 EGFRvⅢ 在正常组织中不表达, 而在食管癌组 [11] 织中特异性表达这与刘敏等在食管癌中的研究 [12] 及樊平等在胃癌的研究结果相类似 EGFRvⅢ 在正常组织不表达, 而在肿瘤组织中特异表达, 这可能使其成为抗癌治疗的理想靶点参考文献 : [1] Kim MA, Lee HS, Jeon YK, et al. EGFR in gastric carcinomas: prognostic significance of protein overexpression and high gene copy number[j]. Histopathology, 2008, 52(6): [2] Zhang W, Zhu H, Liu X, et al. Epidermal growth factor receptor is a prognosis predictor in patients with esophageal squamous cell carcinoma[j]. Ann Thorac Surg, 2014, 98(2): [3] 王建正, 冯笑山, 周福有, 等. 食管癌组织中 EGFR 和 PTEN 蛋白的表达 [J]. 肿瘤基础与临床杂志,2013, 26(2): [4] 王玉峰, 王新帅, 高社干, 等. 表皮生长因子受体在食管癌中的表达及临床意义 [J]. 中华实用诊断与治疗杂志,2012,26(9): [5] Wang J, Yu JM, Jing SW, et al. Relationship between EGFR over-expression and clinicopathologic characteristics in squamous cell carcinoma of the esophagus: a meta-analysis[j]. Asian Pac J Cancer Prev, 2014, 15(14): [6] 刘敏, 郭晓娟, 张红霞, 等. 表皮生长因子受体及 Ⅲ 型突变体在食管癌的表达及意义 [J]. 中国癌症杂志,2009, 19(10): [7] 杨永滨, 黄建霞, 宋文娅, 等.Her2/Neu 和 EGFRvIII 与乳腺癌发生及浸润的相关性研究 [J]. 医学研究与教育,2012, 29(1): [8] 蒋艳霞, 于文娟, 林东亮, 等. 原发性肝细胞癌中 EGFR Connexin43 和 E-cadherin 的表达及意义 [J]. 世界华人消化杂志,2013,21(22): [9] 段小艺, 王健生, 张明鑫, 等. 人肾透明细胞癌中 EGFRvlII 的表达及意义 [J]. 西安交通大学学报 ( 医学版 ),2008,29(4): [10] 王西川, 刘莉, 刘都礼. 胃癌组织中表皮生长因子受体和环氧合酶 -2 的表达及其临床意义 [J]. 实用医院临床杂志,2012, 9(2): [11] 刘敏, 郭晓娟, 张红霞, 等. 食管癌中 EGFRvIII MMP-2 的表达特点及意义 [J]. 现代肿瘤医学,2010,18(1): [12] 樊平, 邹赛英, 赵海华, 等.EGFR 和 EGFRvⅢ 在胃癌中的表达及意义 [J]. 现代生物医学进展,2009,25(16): ( 申海菊编辑 ) 28

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