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1 2011 年第 69 卷化学学报 Vol. 69, 2011 第 23 期, 2877~2881 ACTA CHIMICA SINICA No. 23, 2877~2881 研究论文在硅胶表面制备牛血红蛋白分子印迹聚合物郭敏杰 * 宋艾芳樊志么敬霞 ( 天津科技大学理学院化学系天津 ) 摘要采用表面印迹法, 以乙烯基三甲氧基硅烷修饰的硅胶为载体, 丙烯酰胺为功能单体, N,N'- 亚甲基双丙烯酰胺为交联剂, 并将改性聚乙烯醇 (PVA) 作为辅助识别聚合物链 (ARPCs) 引入聚合体系中, 制备了牛血红蛋白分子印迹聚合物 (MIP). 实验使用红外光谱分析了改性 PVA 的结构特征, 用扫描电镜 (SEM) 观察 MIP 的表面形貌, 考察了 ARPCs 的含量对 MIP 吸附性能的影响. 吸附动力学实验研究表明, 聚合体系中 ARPCs 的引入使 MIP 对模板牛血红蛋白 (BHb) 的吸附量明显提高 ; 十二烷基磺酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 结果显示, MIP 对 BHb 的特异性吸附能力明显提高. 关键词表面印迹 ; 辅助识别聚合物链 ; 聚乙烯醇 ; 硅胶 Imprinting Recognition of Bovine Hemoglobin with Assistant Recognition Polymer Chains on Silica Surface Guo, Minjie* Song, Aifang Fan, Zhi Yao, Jingxia (Department of Chemistry, College of Sciences, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin ) Abstract A new protein imprinted polymer was prepared on silica surface modified with vinyltrimethoxysilane, using acrylamide as the functional monomer, N,N'-methylene bisacrylamide as the cross linker and modified polyvinyl alcohol (PVA) as the assistant recognition polymer chains (ARPCs). The framework of ARPCs was analyzed by the infrared spectrum (IR). Scanning electron microscopy (SEM) images demonstrated the different morphologies. The effect of ARPCs contents on the MIP absorption ability was investigated. The study of adsorption kinetics showed that the adsorption capacity of molecularly imprinted polymers (MIPs) was obviously improved when ARPCs were introduced into the polymer matrix. Competitive adsorption experiments were used to investigate the selectivity to the template bovine hemoglobin (BHb) from the mixture of other proteins. The sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) results showed that MIPs had excellent specific adsorption ability to the template BHb. Keywords surface imprinting; assistant recognition polymer chain; polyvinyl alcohol; silica bead 分子印迹技术是一种制备对模板分子具有特异性识别能力聚合物的技术 [1~4], 大致分为包埋法表面印迹法和抗原决定基法 [5]. 包埋法操作简单, 但研磨会破坏印迹位点, 且印迹位点分布不均匀, 模板分子洗脱也较困难 [6,7]. 而表面印迹法则克服了上述缺点, 成为目前比较常用的制备分子印迹聚合物的一种方法 [8~12], 尤其在印迹识别生物大分子时更具有价值 [13~17]. 表面印迹技术可在聚合物表面或接近表面处形成空穴, 因此在印迹过程中保持了蛋白质大分子的生物活性和空间构象, 使得蛋白质的传递要容易得多 [18~20]. 聚乙烯醇 (PVA) 以其无毒性, 良好的生物相容性及水溶性等受到人们的关注, 被广泛应用于化妆品食品医药和农业等领域 [21,22]. PVA 及其改性产品可通过弱相互作用, 比如疏水作用和氢键作用, 与指定的模板分子 * guomj@tust.edu.cn Received June 6, 2011; revised August 1, 2011; accepted August 15, 国家自然科学基金 (No ) 天津市自然科学基金(No. 09JCYBJC06300) 资助项目.

2 2878 化学学报 Vol. 69, 2011 进行组装, 从而增强印迹聚合物对模板分子的识别能力. 在我们前期的工作中 [23~25], 课题组将聚乙烯醇接枝共聚物作为辅助识别聚合物链 (ARPCs) 引入聚合体系中, 借助于 ARPCs 链上随机分布的识别位点, 使印迹聚合物识别性能明显提高. 本文将 PVA 用丙烯酰氯 (AC) 改性得到辅助识别聚合物链, 辅助识别聚合物链上同时具有双键和羟基, 羟基可与模板蛋白形成弱作用, 双键则参与功能单体与交联剂的聚合反应, 形成三维立体空间结构, 从而达到对模板蛋白的专一性识别. 以乙烯基三甲氧基硅烷 (VTES) 修饰的硅胶为载体, 制备了牛血红蛋白分子印迹聚合物 (MIP). 1 实验部分 1.1 试剂及仪器 SiO 2 (40~80 目, 上海精纯试剂有限公司 ); 牛血红蛋白 (BHb) 牛血清蛋白(BSA) 卵清蛋白(OVA) 溶菌酶 (LYs) 和大豆蛋白酶抑制剂 (STI)( 天津市博美科生物技术有限公司 ), 电泳级 ; 聚乙烯醇 (PVA103, Kuraray Poval), 分析纯 ; 磷酸氢二钠磷酸二氢钠丙烯酰氯 (AC) 丙烯酰胺(AM) 和亚硫酸钠 ( 天津市北方天医化学试剂厂 ), 化学纯 ; 十二烷基硫酸钠 (SDS) 和过硫酸铵 ( 天津市博美科生物技术有限公司 ), 化学纯 ; N,N'- 亚甲基双丙烯酰胺 (MBA, 天津市傲然精细化工研究所 ), 化学纯 ; N,N,N',N'- 四甲基乙二胺和甘氨酸 (Sigma), 电泳级 ; 乙烯基三甲氧基硅烷 (VTES, 湖北武大有机硅新材料股份有限公司 ), 分析纯 ; 其余试剂均为国产分析纯试剂, 实验用水为二次蒸馏水. VECTOR 22 傅里叶红外光谱仪 ( 德国 Bruker 公司 ); TU-1800PC 紫外 - 可见分光光度计 ( 北京普析通用仪器有限公司 ); H1650 高速台式离心机 ( 长沙湘仪离心机有限公司 ); DYY-2C 电泳仪和 DYCZ-24DN 电泳槽 ( 北京市六一仪器厂 ); JSM-6380LV SEM 扫描电镜 ( 日本电子公司 ). 1.2 PVA 的改性将 g PVA 溶于 50 ml 二甲基亚砜 (DMSO) 中, 20 下滴加 1.50 ml AC, 恒温反应 5 h. 用 100 ml 乙醇沉淀, 离心. 将白色沉淀用乙醚洗 3 次, 室温下干燥至恒重, 得到 ARPCs. 1.3 SiO 2 的硅烷化将 g 干燥硅胶加入 50 ml 甲苯中, 加入 6.00 ml VTES, 氮气保护下 110 回流 10 h. 反应结束后, 用甲苯丙酮洗涤, 室温下干燥至恒重, 得到改性硅胶. 1.4 分子印迹聚合物的制备及模板蛋白的洗脱将 g 改性硅胶加入 10 ml 0.01 mol/l 磷酸缓冲溶液 (ph=6.2) 中, 再依次加入 AM g, MBA g, BHb g, ARPCs 用量见表 1, 搅拌 30 min. N 2 保护下再加入 g 过硫酸铵和 g 亚硫酸钠, 冰水浴中反应 4 h. 得到的分子印迹聚合物 (MIP) 用 10 g/l SDS 的 10% (V V) 乙酸溶液振荡洗脱, 用紫外 - 可见分光光度计在 405 nm 下检测无 BHb 吸收峰. 对比组分子印迹聚合物 (a-mip) 的制备, 除不加入 ARPCs 外, 其余步骤同上. 非印迹聚合物 (NMIP) 的制备, 除不加入 ARPCs 和 BHb 外, 其余步骤同上. a-mip 和 NMIP 的洗脱过程与 MIP 步骤相同. 1.5 吸附性能的检测称 g 的 MIP, 加入盛有 5.00 ml 0.20 mg/ml BHb 溶液的离心管中, 振荡吸附 14 h. 将离心管离心 5 min (10000 r/min), 吸取上层清液. 用紫外分光光度计测定吸附后的 BHb 溶液浓度, 计算印迹聚合物对模板蛋白的吸附量. 吸附容量 (Q) 由吸附前后溶液中牛血红蛋白浓度的变化溶液体积和聚合物的质量计算 : Q ( c c) V 0 = (1) m 其中 Q 为单位吸附量 (mg/g), c 0 为蛋白质原液的浓度 (mg/ml), c 为吸附后溶液中蛋白质的浓度 (mg/ml), V 为所取蛋白质溶液的体积 (ml), m 为所取印迹聚合物的质量 (g). 1.6 印迹聚合物的特异性吸附称 g 的 MIP, 加入浓度均为 0.50 mg/ml BHb, BSA, LYs 和 OVA 的混合溶液 5.00 ml, 振荡吸附 14 h. 离心 5 min (10000 r/min), 吸取上层清液. 用紫外分光光度计测定吸附后混合溶液中蛋白的浓度, 计算印迹聚合物对四种蛋白的吸附量. 称 g 的 MIP, 加入 BHb (0.20 mg/ml), BSA (0.50 mg/ml), STI (0.50 mg/ml) 和 OVA (0.50 mg/ml) 的混合溶液 5.00 ml, 振荡吸附 14 h. 离心分离聚合物后, 将聚合物用 0.01 mol/l 磷酸缓冲溶液 (ph=6.2) 洗去非特异性吸附的蛋白质, 再用 10 g/l SDS 的 10% (V V) 乙酸溶液洗去特异性吸附的蛋白质 [24]. 取该洗脱液 10 µl 上样, 恒流走十二烷基磺酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE), 然后进行考马斯亮蓝染色定性分析. 1.7 印迹聚合物的重复使用性能称 g 的 MIP, 加入 5.00 ml 浓度为 0.20 mg/ml 的 BHb 溶液, 振荡吸附 14 h. 依次用 0.01 mol/l 磷酸缓

由图 1 可以看出, 改性 PVA (PVA-AC) 在 1646 和 865 cm 1 附近出现了明显的吸收峰, 分别为 C=C 伸缩振动吸收峰和 C=C H 面外弯曲振动吸收峰, 证明在 PVA 链上成功引入双键. 该双键可参与功能单体与交联剂的聚合反应, 形成三维立体空间结构 ; 而 ARPCs 链上的羟基则可与模板蛋白作用, 形成特定的空穴, 从而达到对模板蛋白的专一性识别.

3 No. 23 郭敏杰等 : 在硅胶表面制备牛血红蛋白分子印迹聚合物 2879 冲溶液 (ph=6.2) 和 10 g/l SDS 的 10% (V V) 乙酸溶液振荡洗脱, 至用紫外分光光度计检测无 BHb 吸收峰. 然后将 MIP 用于多次吸附, 计算印迹聚合物对模板蛋白的吸附量. 2 结果与讨论 2.1 印迹聚合物的形成实验以 AM 为功能单体, MBA 为交联剂, 将 ARPCs 引入聚合体系, 在改性硅胶表面印迹识别牛血红蛋白. 通常仅以小分子物质为功能单体形成的印迹聚合体系作用力较为单一, 而大分子具有多官能团可与模板蛋白作用, 更易形成特异性印迹空穴. 由图 1 可以看出, 改性 PVA (PVA-AC) 在 1646 和 865 cm 1 附近出现了明显的吸收峰, 分别为 C=C 伸缩振动吸收峰和 C=C H 面外弯曲振动吸收峰, 证明在 PVA 链上成功引入双键. 该双键可参与功能单体与交联剂的聚合反应, 形成三维立体空间结构 ; 而 ARPCs 链上的羟基则可与模板蛋白作用, 形成特定的空穴, 从而达到对模板蛋白的专一性识别. 图 2 NMIP (a), a-mip (b) 和 MIP (c) 扫描电镜图 Figure 2 SEM images of NMIP (a), a-mip (b) and MIP (c) 图 1 PVA 改性前后的红外光谱对比图 Figure 1 FT-IR spectra of PVA and modified PVA (PVA-AC) 2.2 印迹聚合物的扫描电镜由扫描电镜图 2 可以看出, NMIP( 图 2a) 表面平整光滑, a-mip( 图 2b) 表面出现了微小的孔状结构, MIP( 图 2c) 表面则相对粗糙, 具有较大的孔面积. 这主要是由于加入 ARPCs 之后, 印迹聚合物的表面出现了明显凸起. 这些凸起使得印迹聚合物表面留有形状较为刚性的空间, 保证了聚合物对模板分子印迹的特异性. 2.3 ARPCs 的含量对印迹聚合物吸附量的影响表 1 给出了 ARPCs 的含量不同时, MIP 的吸附量. 在实验范围内当 ARPCs 的含量为 mg/ml 时, MIP 对模板蛋白的吸附量最高, 这主要是由于 ARPCs 有别于小分子功能单体, 在聚合体系内能够产生更多的有效位点. 而当聚合体系中存在过多 ARPCs 时, 这种高分子长链会将蛋白质完全包埋, 以至于影响洗脱过程, 进而影响吸附量. 在制备蛋白质分子印迹聚合物设计 ARPCs 时, ARPCs 的分子量是我们考虑的首要因素. 我 [23~25] 们曾将低分子量聚乙烯醇接枝共聚物作为辅助识别聚合物链引入聚合体系, 用来提高印迹聚合物的识别性能. 此处考虑到硅胶载体的尺寸及聚合物在硅胶表面被固定的效果, 我们适当地增加了聚乙烯醇的分子量. 表 1 ARPCs 的含量对印迹聚合物吸附量的影响 Table 1 Effect of ARPCs contents on adsorption capacity of MIP ARPCs 含量 /(mg ml -1 ) ARPCs/BHb 比值 /(mol mol -1 ) 吸附量 Q/(mg g -1 ) MIP 吸附动力学和重复使用性能由图 3 可以看出, 各样品的吸附量在最初 3 h 内均迅速增加, 在 5 h 时吸附基本达到饱和. 纯硅胶对于模板蛋白的吸附容量比较小, 并很快达到饱和, 其吸附过程主要是非特异性吸附. NMIP 对于模板蛋白的吸附趋势与纯硅胶相同, 吸附过程主要是非特异性吸附. a-mip

2880 化学学报 Vol. 69, 2011 的吸附容量比较小, 这可能是有效识别位点及孔穴较少的缘故. 加入了 ARPCs 之后不仅提高了印迹聚合物对模板蛋白的吸附量, 而且提高了印迹聚合物对模板蛋白的吸附速率, 这主要是因为加入 ARPCs 之后增加了聚合物表面的识别位点, 使模板蛋白更容易被特异性吸附.

图 3 纯硅胶, NMIP, a-mip 和 MIP 的吸附动力学曲线 Figure 3 Adsorption dynamic curve of BHb on pure silica, NMIP, a-mip and MIP, respectively 在分子印迹技术中, 印迹聚合物的循环利用性能是其重要指标之一.

4 2880 化学学报 Vol. 69, 2011 的吸附容量比较小, 这可能是有效识别位点及孔穴较少的缘故. 加入了 ARPCs 之后不仅提高了印迹聚合物对模板蛋白的吸附量, 而且提高了印迹聚合物对模板蛋白的吸附速率, 这主要是因为加入 ARPCs 之后增加了聚合物表面的识别位点, 使模板蛋白更容易被特异性吸附. 图 5 纯硅胶, NMIP, a-mip 和 MIP 分别对混合蛋白质溶液 (BHb, BSA, OVA 和 LYs) 的吸附 ( 图 5 更换 ) Figure 5 Competitive adsorption of protein mixture (BHb, BSA, OVA and LYs) on pure silica, NMIP, a-mip and MIP, respectively 图 3 纯硅胶, NMIP, a-mip 和 MIP 的吸附动力学曲线 Figure 3 Adsorption dynamic curve of BHb on pure silica, NMIP, a-mip and MIP, respectively 在分子印迹技术中, 印迹聚合物的循环利用性能是其重要指标之一. 实验采用 10 g/l SDS 的 10% (V V) 乙酸溶液对吸附饱和的印迹聚合物进行洗脱离心, 其吸附容量如图 4 所示, a-mip 对模板蛋白的二次吸附能力为 71.8%, 而 MIP 的二次吸附能力为 97.2%. 使用四个循环后, a-mip 对模板蛋白的吸附率为 54%, 而 MIP 对模板蛋白的吸附率仍保持在 90%, 表现出较好的特异性识别能力, 可以多次重复使用. 实验对 MIP, a-mip NMIP 和纯硅胶的乙酸洗脱液做 SDS-PAGE 分析, 此时溶液洗脱掉的是特异性吸附蛋白. 由图 6 可明显看出, 对比其它三种聚合物 MIP 吸附了更多的 BHb, 显示出对模板蛋白的特异性吸附能力, 这同样应归因于在交联聚合时引入了 ARPCs 的缘故, 具有一定分子量的 ARPCs 在体系交联聚合时能够有效的增加模板蛋白的识别位点. 图 4 BHb 分子印迹聚合物的重复吸附实验 Figure 4 Reproducibility of BHb-imprinted polymers 2.5 竞争吸附图 5 是 MIP, a-mip, NMIP 和纯硅胶对 4 种混合蛋白 (BHb, BSA, STI 和 OVA) 的平衡吸附实验结果. 很显然, 竞争蛋白几乎不影响 BHb 在 MIP 上的吸附, MIP 对于 BHb 具有专一性识别作用. 图 6 混合蛋白质竞争吸附洗脱实验 SDS-PAGE 结果 Figure 6 SDS-PAGE results of protein mixture competitive adsorption Lane 1, protein mixture (0.20 mg/ml BHb, 0.50 mg/ml BSA, 0.50 mg/ml STI and 0.50 mg/ml OVA); lane 2~5, 10 µl of the eluate from pure silica, NMIP, a-mip and MIP, respectively 2.6 印迹聚合物的特异性吸附如图 7 所示, 四个瓶子中分别是 BHb 原液, NMIP, a-mip 以及 MIP 吸附 BHb 后溶液外观. 很明显, NMIP 和 a-mip 的加入几乎未使溶液的颜色变化, 而加入 MIP 却明显变透明, 这就说明 MIP 对 BHb 的吸附作用较大,

5 No. 23 郭敏杰等 : 在硅胶表面制备牛血红蛋白分子印迹聚合物 2881 能够实现低浓度蛋白的富集. 图 7 BHb 溶液分别被 NMIP, a-mip 和 MIP 吸附后的外观图片 Figure 7 Photograph of BHb aqueous treated with NMIP, a-mip and MIP, respectively 3 结论实验以改性硅胶为载体, AM 为功能单体, MBA 为交联剂, 将 ARPCs 引入聚合体系中, 合成了牛血红蛋白分子印迹聚合物, 能够明显提高印迹聚合物对模板分子的特异性吸附. ARPCs 与模板蛋白在活化的硅胶表面通过疏水作用及氢键作用等弱相互作用形成三维空间结构, 增加了 MIP 对模板蛋白的识别位点. 而对于 BSA, LYZ, OVA 以及 STI, 由于它们与 MIP 的空穴大小不匹配, 因此 MIP 对它们的吸附量很低, 从而可将 BHb 从混合蛋白中有效的分离出来, 实现低浓度蛋白的富集. References 1 Toshifumi, T.; Takayuki, H. Org. Biomol. Chem. 2008, 6, Liu, Q. Y.; Li, W. Y.; He, X. W.; Chen, L. X.; Zhang, Y. K. Acta Chim. Sinica 2008, 66, 56 (in Chinese). ( 刘秋叶, 李文友, 何锡文, 陈朗星, 张玉奎, 化学学报, 2008, 66, 56.) 3 Chen, Z. Y.; Hua, Z. D.; Xu, L.; Huang, Y.; Zhao, M. P.; Li, Y. Z. J. Mol. Recognit. 2008, 21, Qiu, Z. Y.; Zhong, S. A. Acta Chim. Sinica 2010, 68, 246 (in Chinese). ( 邱增英, 钟世安, 化学学报, 2010, 68, 246.) 5 Zhang, W.; Qin, L.; He, X. W.; Li, W. Y.; Zhang, Y. K. J. Chromatogr. A 2009, 1216, Huang, J. T.; Zhang, J., Zhang, J. Q.; Zhang, S. H. J. Appl. Polym. Sci. 2005, 95, Tan, C. J.; Tong, Y. W. Anal. Bioanal. Chem. 2007, 389, Nishino, H.; Huang, C. S.; Shea, K. J. Angew. Chem., Int. Ed. 2006, 45, Bonini, F.; Piletsky, S.; Turner, A. P. F.; Speghini, A.; Bossi, A. Biosens. Bioelectron. 2007, 22, Yang, H.; Guo, T. Y.; Zhou, D. Z. Int. J. Biol. Macromol. 2011, 48, Yan, C. L.; Lu, Y.; Gao, S. Y. J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. 2007, 45, Zhang, Z. H.; Hu, Y. F.; Zhang, H. B.; Li, H.; Yao, S. Z. Acta Chim. Sinica 2009, 67, 2121 (in Chinese). ( 张朝晖, 胡宇芳, 张华斌, 李辉, 姚守拙, 化学学报, 2009, 67, 2121.) 13 Lin, Z.; Yang, F.; He, X. W.; Zhang, Y. K. J. Sep. Sci. 2009, 32, Fu, G. Q.; Yu, H.; Zhu, J. Biomaterials 2008, 29, Zhang, M. S.; Huang, J. R.; Tang, L. P. Acta Chim. Sinica 2009, 67, 2840 (in Chinese). ( 张茂升, 黄佳蓉, 唐丽萍, 化学学报, 2009, 67, 2840.) 16 Shiomia, T.; Matsuia, M.; Mizukamib, F.; Sakaguchia, K. Biomaterials 2005, 26, Li, Y.; Yang, H. H.; You, Q. H.; Zhuang, Z. X.; Wang, X. R. Anal. Chem. 2006, 78, Zhang, W.; Qin, L.; He, X. W.; Li, W. Y.; Zhang, Y. K. J. Chromatogr. A 2009, 1216, Xie, C. G.; Liu, B. H.; Wang, Z. Y.; Gao, D. M.; Guan, G. J.; Zhang, Z. P. Anal. Chem. 2008, 80, Xia, Y. Q.; Guo, T. Y.; Zhao, H. L.; Song, M. D.; Zhang, B. H.; Zhang, B. L. J. Biomed. Mater. Res. A 2009, 90A, Lee, J. A.; Kima, M. N. Polym. Degrad. Stab. 2003, 81, Demerlis, C. C.; Schoneker, D. R. Food Chem. Toxicol. 2003, 41, Guo, M. J.; Zhao, Z.; Fan, Y. G.; Wang, C. H.; Shi, L. Q.; Xia, J. J.; Long, Y.; Mi, H. F. Biomaterials 2006, 27, Guo, M. J.; Gao, T.; Fan, Z.; Yao, J. X.; Xia, J. J.; Mi, H. F. Sci. China, Ser. B 2010, 53, Guo, M. J.; Xia, J. J.; Fan, Z.; Zhao, Z.; Mi, H. F. J. Appl. Polym. Sci. 2009, 113, (A Qin, X.)

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