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雁耗松
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1 第 33 卷第 5 期大连海洋大学学报 Vol.33 No 年 1 0 月 JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITY Oct DOI: / j.cnki.dlhyxb 文章编号 : (2018) 菲律宾蛤仔橙蛤斑马蛤和白蛤群体酚氧化酶活性的比较研究 1 丁鉴锋 2 ꎬ 温嫱 1 1 ꎬ 霍忠明 2 1 ꎬ 聂鸿涛 ꎬ 闫喜武 (1 大连海洋大学水产与生命学院 ꎬ 辽宁大连 ꎻ 2 辽宁省贝类良种繁育工程技术研究中心 ꎬ 辽宁大连 ) 摘要 : 为研究酚氧化酶 (PO) 在贝类体色形成和非特异性免疫过程中的重要作用 ꎬ 检测了壳长为 (2 1± 0 3) cm 的 3 种壳色菲律宾蛤仔 Ruditapes philippinarum ( 橙蛤斑马蛤和白蛤 ) 血淋巴细胞和外套膜中的酚氧化酶活性 ꎬ 并对用脂多糖 (LPS) 和肽聚糖 (PGN) 刺激后其酶活性的变化进行了测定 ꎮ 结果表明 : 3 种壳色蛤仔血淋巴细胞中酚氧化酶活性均显著高于外套膜中的酶活性 ( P<0 05)ꎻ 注射脂多糖后 ꎬ 橙蛤斑马蛤和白蛤血淋巴细胞中酚氧化酶活性分别在 h 达到最大值 ꎬ 斑马蛤血淋巴细胞中酚氧化酶活性在 12 h 显著高于橙蛤 (P<0 05)ꎬ 橙蛤斑马蛤和白蛤外套膜中酚氧化酶活性分别在刺激后 h 时达到最大值 ꎻ 注射肽聚糖后 ꎬ 橙蛤血淋巴细胞中酚氧化酶活性在 24 h 达到最低值 ꎬ 斑马蛤和白蛤血淋巴细胞中的酚氧化酶活性分别在刺激后 12 h 和 6 h 达到最大值 ꎬ 白蛤血淋巴细胞中酚氧化酶活性在注射后 6 h 显著高于橙蛤和斑马蛤 (P<0 05)ꎬ 斑马蛤血淋巴细胞中酚氧化酶活性在刺激后 12 h 显著高于橙蛤和白蛤 (P<0 05)ꎬ 橙蛤外套膜组织中的酚氧化酶活性在注射肽聚糖后 12 h 达到最大值 ꎻ 不同壳色蛤仔体内酚氧化酶对细菌提取物刺激所表现出的不同反应模式 ꎬ 证实了蛤仔壳色形成过程与免疫能力可能具有重要的关联 ꎮ 本研究结果可为菲律宾蛤仔的壳色选育提供理论支持 ꎮ 关键词 : 菲律宾蛤仔 ꎻ 壳色 ꎻ 血淋巴细胞 ꎻ 外套膜 ꎻ 酚氧化酶中图分类号 : S 文献标志码 : A 贝壳是由贝类外套膜的边缘细胞所分泌的物质形成 ꎬ 其生长和色素形成受神经系统控制 [1] ꎮ 贝壳的多层结构由碳酸钙晶体及其中分布的蛋白成分和色素构成 ꎬ 色素是由外套膜细胞分泌并嵌入到生长边缘 ꎬ 随着壳的生长持续分泌到壳内 [2] ꎮ 贝类壳色形成的主要色素有黑色素卟啉和类胡萝卜素等 ꎬ 其合成可能直接由少数几个基因控制 [3] ꎮ 对不同壳色贝类的比较研究发现 ꎬ 黑色素形成途径的相关基因差异表达是贝类壳色多态性形成的一个重要原因 [3-5] ꎮ 在黑色素形成过程中 ꎬ 酚氧化酶 ( phenoloxi daseꎬ PO) 参与 L- 多巴或多巴胺向黑色素的转化过程 ꎬ 是黑色素形成的一种关键酶 [6] ꎮ 同时 ꎬ 酚氧化酶在无脊椎动物的免疫包裹黑化和识别自身 / 非自身等过程中也发挥重要作用 [7] ꎮ 由于无脊椎动物体内的黑变 (melanism) 过程与先天性免疫过程存在共同的黑色素生成 ( 也称为酚氧化酶级联反应 ) 途径 ꎬ 无脊椎动物的体色与酚氧化酶介导的免疫能力间必然存在密切关系 [8-9] ꎮ 对一些节肢动物的研究发现 ꎬ 具有较强黑化作用或表皮中含有较多黑色素的个体表现出更高的免疫能力 [10-12] ꎮ 这种免疫差异能够被细菌提取物肽聚糖 ( pepti doglycansꎬ PGN ) 脂多糖 ( lipopolysaccharidesꎬ LPS)ꎬ 以及真菌中提取的 β-1ꎬ 3- 葡聚糖等激活并表现出来 [9] ꎮ 贝类体内的酚氧化酶存在于多个组织中 ꎬ 外套膜合成和分泌的酚氧化酶可以转运到壳的棱柱层 ꎬ 参与黑色素的生物合成及色素形成过程 [13-15] ꎮ 有研究表明 ꎬ 贝类血淋巴细胞中的酚氧化酶也可能参与贝类的壳黑色素形成过程 [16-17] ꎮ 对太平洋牡蛎 Crassostrea gigas 栉孔扇贝 Chlamys farreri 菲律宾蛤仔 Ruditapes philippinarum 帘蛤 Venerupis variegata 和文蛤 Meretrix meretrix 的研究 ꎬ 证实了酚氧化酶在贝类抗菌感染中的重要作用 [18-22] ꎻ 对虾夷扇贝 Patinopecten yessoensis 和蜗牛收稿日期 : 基金项目 : 辽宁省教育厅科研项目 (L )ꎻ 国家 863 计划项目 (2012AA10A410-2) 作者简介 : 丁鉴锋 (1977 )ꎬ 男 ꎬ 博士 ꎬ 副教授 ꎮ jfding@ dlou edu cn 通信作者 : 闫喜武 (1962 )ꎬ 男 ꎬ 博士 ꎬ 教授 ꎮ yanxiwu@ dlou edu cn

2 第 5 期丁鉴锋 ꎬ 等 : 菲律宾蛤仔橙蛤斑马蛤和白蛤群体酚氧化酶活性的比较研究 559 Cepaea hortensis Theba pisana 和 Cornu aspersum maximum 的研究也发现 ꎬ 不同壳色贝类体内酚氧化酶活性表现出差异 [23-24] ꎮ 因此 ꎬ 贝类壳色形成与免疫过程可能以酚氧化酶为媒介存在某种关联 ꎮ 菲律宾蛤仔隶属于双壳纲帘蛤科缀锦亚科蛤仔属 ꎬ 是一种中国沿海广泛养殖的滩涂贝类 ꎬ 其壳面颜色千差万别 ꎬ 是双壳贝类中壳色多态性最复杂的种类之一 ꎮ 研究发现 ꎬ 不同壳色蛤仔在耐受性抗逆性和生长速率等方面表现出显著差异 ꎬ 并且能稳定遗传给下一代 ꎬ 但具体的作用机制尚不明确 [24-28] ꎮ 对不同壳色贝类的转录组研究发现 ꎬ 其差异表达基因分布在色素合成生长免疫和生物矿化等相关信号通路 ꎬ 色素形成信号通路主要集中在黑色素合成途径 [4-5] ꎮ 本研究中 ꎬ 以 3 种不同壳色且经转录组研究证实其外套膜组织酚氧化酶家族基因表达存在差异的菲律宾蛤仔为研究对象 ꎬ 检测在用细菌提取物肽聚糖和脂多糖刺激后其血淋巴和外套膜组织中酚氧化酶活性的变化情况 ꎬ 以期分析壳色与酚氧化酶活性的关联 ꎬ 为蛤仔的壳色形成和与抗逆性相关研究提供理论依据 ꎮ 1 材料与方法 1 1 材料试验用菲律宾蛤仔的斑马蛤白蛤和橙色家系为辽宁省贝类良种繁育工程技术研究中心繁育的蛤仔家系 ꎬ 壳长为 (2 1±0 3) cmꎬ 壳型完整且活力强 ꎬ 在 50 L 水体的养殖槽中暂养一周 ꎬ 养殖水温为 (18 0±0 5) ꎬ 盐度为 32ꎮ 暂养期间每天换水 1 次 ꎬ 并投喂螺旋藻粉 ꎬ 持续充氧 ꎮ 1 2 方法试验设计从 3 种壳色菲律宾蛤仔中各随机挑选 72 枚 ꎬ 每种壳色蛤仔分为 3 组 ꎬ 每组 24 枚 ꎮ 每种壳色的 3 组蛤仔按 50 μl / 枚的剂量分别注射免疫促进剂 LPS ( 100 μg / ml) 和 PGN ( 20 μg / ml)ꎬ 空白对照注射等量的 PBS 缓冲液 ꎬ 注射相同药品的蛤仔放入同一养殖槽中暂养 ꎬ 在注射后的 h 时从每种壳色蛤仔各注射组中随机选取 4 枚个体 ꎬ 采集样品组织用于后续分析 ꎮ 样品采集使用 1 ml 无菌注射器 ꎬ 从菲律宾蛤仔围心腔中分别抽取血淋巴 400 μlꎬ 于 4 下以 4000 r / min 离心 10 minꎬ 收集血淋巴细胞 ꎬ 液氮中冷冻后置于超低温冰箱 ( - 80 ) 中保存备用 ꎮ 分离采集血淋细胞后的蛤仔外套膜 200 mgꎬ 用液氮速冻后研成粉末 ꎬ 置于 -80 下保存备用 ꎮ 样品裂解向血淋巴细胞和外套膜样品中加入裂解液 500 μlꎬ 用匀浆机匀浆后 ꎬ 于 4 下以 1000 r / min 离心 45 minꎬ 收集上清液用于酶活性和总蛋白含量的测定 ꎮ 蛋白裂解液配制方法如下 : 150 mmol / L NaCl 10 mmol / L Tris 1 mmol / L EDTA 1 mmol / L EGTA 1% TritonX-100 和 0 5% Igepalꎬ 按照 1 片 / 25 ml 缓冲液的量加入不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂 (phosphatase inhibitor cocktail III 贝博生物 ) [29] ꎮ [20] 酚氧化酶活性测定采用 Le Bris 等的方法测定酚氧化酶活性 ꎬ 以 L-DOPA 为反应底物 ꎮ 具体操作如下 : 将 50 μl 裂解液 ( 包括血淋巴细胞和外套膜组织裂解上清液 ) 加入 96 孔酶标板孔中 ꎬ 再分别加入 50 μl Tris - HCl 缓冲液 ( 0 10 mol / Lꎬ ph 8 0)ꎬ 25 下孵育 10 minꎻ 每孔分别加入 100 μl 0 04 mol / L L-DOPAꎮ 混合均匀后置于酶标仪中 ꎬ 在 25 条件下反应 30 minꎬ 读取 492 nm 处的吸光度值 ꎮ L-DOPA 的自发氧化采用相同方法同时测定 ꎬ 反应物用纯水替代裂解液 ꎬ 计算时将自发氧化的结果从测定值中剔除 ꎮ 酚氧化酶的活性以每分钟吸光度值的增加量 (ΔA / min) 进行计算 ꎬ 公式为 PO 活性 (U / mg prot)= (ΔA / min 稀释倍数 ) / 总蛋白浓度 ꎮ 蛋白含量的测定使用 Bradford 法蛋白检测试剂盒 ( 南京建成生物有限公司 ) 测定总蛋白含量 ꎬ 用考马斯亮蓝 G-250 染色 ꎬ 在酶标仪上读取 595 nm 波长下蛋白样品的光密度值 ꎮ 以蛋白标准 (5 mg / ml BSA) 稀释液作为蛋白质浓度标准 ꎬ 计算血清总蛋白含量 ꎮ 1 3 数据处理用 SPSS 20 0 软件对数据进行分析处理 ꎬ 采用单因素方差分析进行差异显著性检验 ꎬ 采用 Dun can 法进行组间多重比较 ꎬ 不同时间点比较以 0 h 测定值为对照 ꎬ 同一壳色不同组织之间的比较采用 t 检验法 ꎬ 显著性水平设为 0 05ꎮ 2 结果与分析种壳色菲律宾蛤仔血淋巴细胞和外套膜中 PO 活性比较从图 1 可见 ꎬ 3 种壳色蛤仔血淋巴细胞中 PO

3 560 大连海洋大学学报第 33 卷活性均显著高于外套膜中的酶活性 (P<0 05)ꎬ 3 种壳色蛤仔血淋巴细胞中 PO 活性依次为白蛤 > 橙蛤 > 斑马蛤 ꎬ 外套膜中 PO 活性相差不大 ꎮ 注 : 标有不同小写字母者表示同一壳色不同组织间有显著性差异 (P<0 05) Note: Different lowercase letters represent significant differences be tween tissues in the same shell-color group (P<0 05) 图 1 3 种壳色菲律宾蛤仔血淋巴细胞与外套膜组织中酚氧化活性的比较 Fig 1 Comparison of the phenoloxidase activity in he mocytes and mantle of the three shell - color clams 种壳色菲律宾蛤仔注射 LPS 后血淋巴细胞和外套膜组织中 PO 活性比较注射 LPS 后 ꎬ 3 种壳色菲律宾蛤仔血淋巴细胞和外套膜中 PO 活性变化如图 2 所示 ꎮ 从图 2 可见 ꎬ 注射 LPS 后 ꎬ 随着时间的延长 ꎬ 3 种壳色血淋巴细胞中的 PO 活性均表现出先升高后降低的趋势 ꎬ 橙蛤在被刺激后 3 h 斑马蛤和白蛤在刺激后 12 h 时 ꎬ PO 活性均达到最大值且显著高于 0 h (P<0 05)ꎻ 48 h 时 ꎬ 3 种蛤仔 PO 活性恢复至接近 0 h 水平 ꎬ 且斑马蛤血淋巴 PO 活性显著高于橙蛤 (P<0 05)ꎮ 从图 2 还可见 ꎬ 注射 LPS 后 ꎬ 随着时间的延长 ꎬ 3 种壳色外套膜中的 PO 活性均表现出先升高后降低的趋势 ꎬ 橙蛤和斑马蛤在被刺激后 6 h 时 PO 活性达到最大值且显著高于 0 h (P<0 05)ꎬ 白蛤在被刺激后 24 h 时达到最大值且显著高于 0 h (P<0 05)ꎻ 48 h 时 3 种蛤仔 PO 活性均恢复至 0 h 水平 ꎮ 种壳色菲律宾蛤仔注射 PGN 后血淋巴细胞和外套膜组织 PO 活性比较注射 PGN 后 ꎬ 3 种壳色菲律宾蛤仔血淋巴细胞和外套膜中 PO 活性变化如图 3 所示 ꎮ 从图 3 可见 ꎬ 注射 PGN 后 ꎬ 随着时间的延长 ꎬ 橙蛤的 PO 活性表现出降低的趋势 ꎬ 在 24 h 时 PO 活性达到最低值 ꎬ 而斑马蛤和白蛤血淋巴细胞中 PO 活性均表注 : 标有不同大写字母者表示不同时间点与 0 h 比较有显著性差异 (P<0 05)ꎬ 标有不同小写字母者表示同一时间点不同组织间比较有显著性差异 (P<0 05)ꎬ 下同 Note: Different capital letters indicate significant difference between 0 h and different time points (P<0 05)ꎻ Different lowercase letters represent significant differences between tissues at the same time (P<0 05)ꎬ et sequentia 图 2 LPS 刺激后 3 种壳色菲律宾蛤仔血淋巴细胞和外套膜组织中 PO 活性的变化 Fig 2 Changes in phenoloxidase activity in hemocytes and mantles of the three shell-color clams injec ted with LPS 现出先升高后降低的趋势 ꎬ 斑马蛤在被刺激后 12 h 白蛤在刺激后 6 h 时 ꎬ PO 活性达均到最大值 (P<0 05)ꎻ 在注射后 6 h 时 ꎬ 白蛤血淋巴细胞中 PO 活性显著高于橙蛤和斑马蛤 (P<0 05)ꎬ 注射后 12 h 时 ꎬ 斑马蛤血淋巴细胞中 PO 活性显著高于橙蛤和白蛤 (P<0 05)ꎮ 从图 3 还可见 ꎬ 注射 PGN 后 ꎬ 随着时间的延长 ꎬ 3 种壳色外套膜中的 PO 活性均表现出升高的趋势 ꎬ 橙蛤在注射后 12 h 时达到最大值且显著高于 0 h (P<0 05)ꎬ 而其他两种壳色蛤仔外套膜中 PO 活性虽有升高但不显著 (P>0 05)ꎮ 3 讨论 3 1 菲律宾蛤仔外套膜和血淋巴细胞中 PO 的分布酚氧化酶又名酪氨酸酶 ꎬ 是一种含铜的酶 ꎬ 在哺乳动物体内通常称为酪氨酸酶 ꎬ 无脊椎动物一般称为 POꎬ 能够催化单酚羟化成二酚 ( 如多巴 )ꎬ

4 第 5 期丁鉴锋 ꎬ 等 : 菲律宾蛤仔橙蛤斑马蛤和白蛤群体酚氧化酶活性的比较研究 561 栉孔扇贝 C farreri 体内的 PO 被证实具有抗菌活 [19ꎬ 性 35] [36] [37] ꎮ Richard 等和 Le Bris 等用弧菌 V tapetis 刺激菲律宾蛤仔后其血淋巴 PO 活性也显著升高 [36-37] [34] ꎮ Aladaileh 等使用 LPS 刺激牡蛎 Sac costrea glomerata 后其血淋巴细胞中 PO 活性显著升高 ꎮ 此外 ꎬ 使用脂多糖刺激栉孔扇贝后其血淋巴中 PO 活性显著升高 [19] ꎮ 本研究中 ꎬ 在受到肽聚糖和脂多糖刺激后 ꎬ 3 种壳色蛤仔血淋巴细胞和外套膜中的 PO 活性均表现出升高的过程 ꎮ 表明蛤仔体内的 PO 在受到病原微生物的感染时 ꎬ 能够被激活并参与到对病原的免疫反应过程 [7] ꎮ 此外 ꎬ 本研究中蛤仔外套膜中 PO 的升高程度要低于血淋巴中的 POꎬ 这可能与 PO 在不同组织中的作用差异有关 [16] ꎮ 图 3 Fig 3 PGN 刺激后 3 种壳色菲律宾蛤仔血淋巴细胞和外套膜组织中 PO 活性的变化 Changes in phenoloxidase activity in hemocytes and mantles of the three shell-color clams injec ted with PGN 并把二酚氧化成醌 ꎮ 醌在非酶促条件下 ꎬ 形成最终的反应产物是黑色素 [30] ꎮ PO 在体内的不同组织中能够发挥不同的作用 ꎬ 如在血淋巴细胞中作为免疫效应因子 ꎬ 在血淋巴中作为化学递质 ꎬ 在鳃足和外套膜中参与黏附蛋白的组成及贝壳的形成和修复等过程 [16] ꎮ 本研究中 ꎬ 在菲律宾蛤仔的鳃和外套膜组织中均检测到 PO 活性 ꎬ 且 3 种壳色蛤仔外套膜中的 PO 活性均显著低于其血淋巴中的酶活性 ꎮ 究其原因主要可能与蛤仔外套膜细胞中较高的 Ca 2+ 水平有关 ꎮ 对节肢动物的研究发现 ꎬ 高浓度的 Ca 2+ 能够抑制酚氧化酶原的激活导致 PO 活性较低 [31-32] ꎬ 在一些血淋巴中含有较高 Ca 2+ 含量的蜗牛 Cepaea hortensis Theba pisana 和 Cornuaspersum maximum 体内也发现了类似的结果 [24] ꎮ 因此 ꎬ 作为贝类参与壳矿化过程主要细胞分布的组织 ꎬ 蛤仔外套膜中高浓度的 Ca 2+ 是导致其 PO 活性远远低于血淋巴的一个重要原因 [33] ꎮ 3 2 菲律宾蛤仔外套膜和血淋巴细胞中 PO 的免疫应答作用研究表明 ꎬ PO 是大多数贝类先天免疫防御系统中的重要酶之一 [16] ꎮ 双壳贝类体内的 PO 能够被真菌 β-1ꎬ 3- 葡聚糖及细菌的肽聚糖和脂多糖诱导 ꎬ 这一激活过程通常由病原模式识别受体 ( Pattern recognition receptorsꎬ PRRs) 所触发 [34] ꎮ 3 3 菲律宾蛤仔体内 PO 在蛤仔壳黑色素形成和免疫防御中的作用无脊椎动物体内的 PO 参与体内黑色素的形成过程 ꎬ 这一生化反应过程在机体的免疫和黑变 (melanism) 过程中具有关键作用 ꎬ 因此 ꎬ 无脊椎动物体内黑色素含量与免疫能力之间存在相关性 [8-9] ꎮ 对黄粉虫甲虫 Tenebrio molitor 的研究发现 ꎬ 黑色个体较黄褐色个体含有更多的黑色素 ꎬ 被脂多糖刺激后体内 PO 活性也显著高于黄褐色个体 ꎬ 能够更有效地抵御病原感染 [10] ꎮ 角质层黑色素含量较多的南方地蟋 Allonemobius socius 也表现出更卓越的以黑色素为基础的免疫能力 [38] ꎮ 对虾夷扇贝的研究发现 ꎬ 黑色素含量较多的黑色个体 PO 活性显著高于含黑色素较少的白色个体 [23] ꎮ Scheil [24] 等对 3 种蜗牛 Cepaea hortensis Theba pisana 和 Cornuaspersum maximum 的比较研究发现 ꎬ 深色蜗牛的血淋巴中 PO 活性远高于浅色个体 ꎮ 黑色素含量的差异也是贝类壳色多样性形成的重要原因之一 [3] [13] ꎮ Nagai 等在合浦珠母贝 Pinctada fucata 体内发现两种与壳黑色素形成相关的基因 Pfty1 和 Pfty2ꎬ 其编码的蛋白具有 PO 的活性 ꎮ 对贻贝 Meretrix meretrix 转录组的研究也发现 ꎬ 不同壳色贻贝的黑色素形成信号通路相关基因表达存在显著差异 [5] ꎮ 以上结果表明 : 不同壳色贝类基于黑色素合成途径的免疫能力也应存在差异 ꎮ 本研究中 ꎬ 3 种壳色蛤仔血淋巴中 PO 活性受病原刺激后均出现升高的过程 ꎬ 但升高的幅度存在差异 ꎬ 其中 ꎬ 斑马蛤在被刺激 12 h 后血淋巴中 PO 活性显著高于其他两种壳色 ꎬ 白蛤被肽聚糖刺激 6 h 后血淋巴中 PO 活性显著高于其他两种壳色 ꎮ 前期研究发现 ꎬ 不同

5 562 大连海洋大学学报第 33 卷壳色菲律宾蛤仔群体抗逆性存在着显著的差 [27ꎬ 异 39] ꎮ 因此 ꎬ 作为贝类壳中黑色素形成的关键酶 POꎬ 在不同壳色蛤仔受病原刺激后其活性变化表现出的差异 ꎬ 可能是不同壳色蛤仔抗逆性不同的重要原因之一 ꎬ 该结果初步证实了蛤仔壳色形成与免疫过程间存在关联 ꎬ 可为菲律宾蛤仔的壳色选育提供理论支持 ꎮ 参考文献 : [1] Boettiger AꎬErmentrout BꎬOster Gꎬet al.the neural origins of shell structure and pattern in aquatic mollusks[ J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of Americaꎬ 2009ꎬ106(16): [2] Budd AꎬMcDougall CꎬGreen Kꎬet al.control of shell pigmentation by secretory tubules in the abalone mantle[ J]. Frontiers in Zoolo gyꎬ2014ꎬ11:62. [3] Williams S T.Molluscan shell colour[ J].Biological Reviewsꎬ2017ꎬ 92(2): [4] Ding JunꎬZhao LeꎬChang Yaqingꎬet al.transcriptome sequencing and characterization of Japanese scallop Patinopecten yessoensis from different shell color lines [ J]. PLoS Oneꎬ 2015ꎬ 10 ( 2 ): e [5] Yue XinꎬNie QingꎬXiao Guoqiangꎬet al.transcriptome analysis of shell color-related genes in the clam Meretrix meretrix[ J].Marine Biotechnologyꎬ2015ꎬ17(3): [6] True J R. Insect melanism:the molecules matter[ J]. Trends in E cology & Evolutionꎬ2003ꎬ18(12): [7] Cerenius LꎬLee B Lꎬ Söderhäll K. The propo - system: pros and cons for its role in invertebrate immunity[ J].Trends in Immunolo gyꎬ2008ꎬ29(6): [8] Rolff JꎬSiva-Jothy M.Invertebrate ecological immunology[ J].Sci enceꎬ2003ꎬ301(5632): [9] Söderhäll KꎬCerenius L. Role of the prophenoloxidase - activating system in invertebrate immunity[ J].Current Opinion in Immunolo gyꎬ1998ꎬ10(1): [ 10] Armitage S A OꎬSiva-Jothy M T.Immune function responds to se lection for cuticular colour in Tenebrio molitor [ J]. Heredityꎬ 2005ꎬ94(6): [11] Barnes A IꎬSiva- Jothy M T. Density - dependent prophylaxis in the mealworm beetle Tenebrio molitor L. ( Coleoptera:Tenebrion idae):cuticular melanization is an indicator of investment in im munity[ J]. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sci encesꎬ2000ꎬ267(1439): [12] Cotter S CꎬKruuk L E BꎬWilson K. Costs of resistance:genetic correlations and potential trade-offs in an insect immune system [ J].Journal of Evolutionary Biologyꎬ2004ꎬ17(2): [13] Nagai KꎬYano MꎬMorimoto Kꎬet al. Tyrosinase localization in mollusc shells[ J].Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Biochemistry and Molecular Biologyꎬ2007ꎬ146(2): [14] Zhang GuofanꎬFang XiaodongꎬGuo Ximingꎬet al. The oyster ge nome reveals stress adaptation and complexity of shell formation [ J].Natureꎬ2012ꎬ490(7418): [15] Bai ZhiyiꎬZheng HanfengꎬLin Jingyunꎬet al.comparative analysis of the transcriptome in tissues secreting purple and white nacre in the pearl mussel Hyriopsis cumingii[ J].PLoS Oneꎬ2013ꎬ8( 1): e [16] Luna-Acosta AꎬBreitwieser MꎬRenault Tꎬet al. Recent findings on phenoloxidases in bivalves [ J ]. Marine Pollution Bulletinꎬ 2017ꎬ122(1-2):5-16. [17] Li ShiguoꎬLiu YangjiaꎬLiu Chuangꎬet al. Hemocytes participate in calcium carbonate crystal formationꎬtransportation and shell re generation in the pearl oyster Pinctada fucata[ J].Fish & Shell fish Immunologyꎬ2016ꎬ51: [18] Luna-Acosta AꎬBustamante PꎬGodefroy Jꎬet al. Seasonal varia tion of pollution biomarkers to assess the impact on the health sta tus of juvenile Pacific oysters Crassostrea gigas exposed in situ [ J]. Environmental Science and Pollution Researchꎬ 2010ꎬ 17 (4): [19] Zhou ZhiꎬNi DuojiaoꎬWang Mengqiangꎬet al. The phenoloxidase activity and antibacterial function of a tyrosinase from scallop Chlamys farreri[ J].Fish & Shellfish Immunologyꎬ2012ꎬ33( 2): [20] Le Bris CꎬPaillard CꎬStiger-Pouvreau Vꎬet al.laccase-like ac tivity in the hemolymph of Venerupis philippinarum:characteriza tion and kinetic properties [ J]. Fish & Shellfish Immunologyꎬ 2013ꎬ35(6): [21] Buffet P EꎬZalouk-Vergnoux AꎬChâtel Aꎬet al.a marine meso cosm study on the environmental fate of silver nanoparticles and toxicity effects on two endobenthic species: the ragworm Hediste diversicolor and the bivalve mollusc Scrobicularia plana[ J]. Sci ence of the Total Environmentꎬ2014ꎬ : [22] Matozzo VꎬBailo L.A first insight into haemocytes of the smooth venus clam Callista chione [ J]. Fish & Shellfish Immunologyꎬ 2015ꎬ42(2): [23] Sun XiujunꎬLiu ZhihongꎬZhou Liqingꎬet al. Integration of next generation sequencing and EPR analysis to uncover molecular mechanism underlying shell color variation in scallops[ J]. PLoS Oneꎬ2016ꎬ11(8):e [24] Scheil A EꎬHilsmann SꎬTriebskorn Rꎬet al.shell colour polymor phismꎬinjuries and immune defense in three helicid snail spe ciesꎬcepaea hortensisꎬtheba pisana and Cornuaspersum maximum [ J].Results in Immunologyꎬ2013ꎬ3: [25] 闫喜武 ꎬ 张国范 ꎬ 杨凤 ꎬ 等. 菲律宾蛤仔莆田群体两个壳色品系生长发育的比较 [ J]. 大连水产学院学报 ꎬ2005ꎬ20( 4): [26] 丁鉴锋 ꎬ 王锐 ꎬ 闫喜武 ꎬ 等. 菲律宾蛤仔 3 种壳色群体低盐耐受能力的比较研究 [ J]. 大连海洋大学学报 ꎬ2013ꎬ28( 3): [27] 丁鉴锋 ꎬ 杨霏 ꎬ 闫喜武 ꎬ 等. 不同壳色菲律宾蛤仔免疫机能的比较研究 [J]. 大连海洋大学学报 ꎬ2012ꎬ27(5): [28] Cabaret J.Natural infection of land-snails by protostrongylids on a pasture grazed by sheep in the Rabat area of Morocco[J].Veteri nary Parasitologyꎬ1988ꎬ26(3-4):

6 第 5 期丁鉴锋 ꎬ 等 : 菲律宾蛤仔橙蛤斑马蛤和白蛤群体酚氧化酶活性的比较研究 563 [29] Guévélou EꎬHuvet AꎬGalindo-Sánchez C Eꎬet al. Sex-specific regulation of AMP-activated protein kinase ( AMPK) in the Pa cific oyster Crassostrea gigas[ J].Biology of Reproductionꎬ2013ꎬ 89(4):100. [ 30] Sugumaran M.Roles of the insect cuticle in host defence reactions [M] / / Soderhall KꎬIwanaga SꎬVasta G R.New Directions in In vertebrate Immunology. FairHavenꎬ NJ: Sos Pubnsꎬ 1996: [31] Ashida MꎬIshizaki YꎬIwahana H.Activation of pro-phenoloxidase by bacterial cell walls or β- 1ꎬ3-glucans in plasma of the silk wormꎬbombyx mori [ J]. Biochemical and Biophysical Research Communicationsꎬ1983ꎬ113(2): [32] Söderháll K.Fungal cell wall β-1ꎬ3-glucans induce clotting and phenoloxidase attachment to foreign surfaces of crayfish hemocyte lysate [ J]. Developmental & Comparative Immunologyꎬ 1981ꎬ 5 (4): [33] Addadi LꎬJoester DꎬNudelman Fꎬet al.mollusk shell formation:a source of new concepts for understanding biomineralization processes[ J]. Chemistry - A European Journalꎬ 2006ꎬ 12 ( 4 ): [34] Aladaileh SꎬNair S VꎬRaftos D A.Induction of phenoloxidase and other immunological activities in Sydney rock oysters challenged with microbial pathogen-associate molecular patterns[ J].Fish & Shellfish Immunologyꎬ2007ꎬ23(6): [ 35] Xing JingꎬJiang JingweiꎬZhan Wenbin.Phenoloxidase in the scal lop Chlamys farreri:purification and antibacterial activity of its re action products generated in vitro[ J].Fish & Shellfish Immunolo gyꎬ2012ꎬ32(1): [36] Richard GꎬLe Bris CꎬGuérard Fꎬet al.immune responses of phe noloxidase and superoxide dismutase in the Manila clam Venerupis philippinarum challenged with Vibrio tapetis - part II: combined effect of temperature and two V. tapetis strains[ J].Fish & Shell fish Immunologyꎬ2015ꎬ44(1): [37] Le Bris CꎬRichard GꎬPaillard Cꎬet al.immune responses of phe noloxidase and superoxide dismutase in the Manila clam Veneru pis philippinarum challenged with Vibrio tapetis - part I: spatio - temporal evolution of enzymes activities post-infection[ J]. Fish & Shellfish Immunologyꎬ2015ꎬ42(1): [ 38] Fedorka K Mꎬ Lee Vꎬ Winterhalter W E. Thermal environment shapes cuticle melanism and melanin - based immunity in the ground cricket Allonemobius socius [ J ]. Evolutionary Ecologyꎬ 2013ꎬ27(3): [39] 闫喜武 ꎬ 张跃环 ꎬ 霍忠明 ꎬ 等. 不同壳色菲律宾蛤仔品系 F 2 的表型性状 [J]. 水产学报 ꎬ2010ꎬ34(6): A comparison of phenoloxidase activity in the orange-ꎬ zebra-and white-groups of Manila clam Ruditapes philippinarum DING Jian-feng 1ꎬ2 ꎬ WEN Qiang 1 ꎬ HUO Zhong-ming 1ꎬ2 ꎬ NIE Hong-tao 1ꎬ2 ꎬ YAN Xi-wu 1ꎬ2 (1. College of Fisheries and Life Scienceꎬ Dalian Ocean Universityꎬ Dalian ꎬ Chinaꎻ 2. Engineering Research Center of Shellfish Culture and Breeding in Liaoning Provinceꎬ Dalian ꎬ China) Abstract: Phenoloxidase ( PO) activity was determined in hemocytes and mantle tissues of Manila clam Ruditapes philippinarum with three shell colors( orangeꎬ zebra and white) with shell length of ( 2.1±0.3) cmꎬ and the hemo lymph phenoloxidase activity were also measured in the Manila clam with injection of lipopolysaccharide ( LPS) at a dose of 100 μg / ml and peptidoglycan (PGN) at a dose of 20 μg / ml 0ꎬ 3ꎬ 6ꎬ 12ꎬ 24ꎬ and 48 h after the adminis tration. The results showed that there was significantly higher PO activity in hemocytes than that in mantle in all the three shell-color groups(p<0.05)ꎬ the maximal level of PO activity in hemocytes of the clam injected with LPS at 3 h in orangeꎬ and 12 h in zebra and white clam groupsꎬ significant higher in zebra group than that in orange group at 12 h(p<0.05). In the mantleꎬ howeverꎬ the maximal level of PO activity was observed at 6 h in orange and ze bra shell groups and 24 h in white shell color group. The PO activity in hemocytes was found to be declined in or ange shell-color clam injected with PGNꎬ the minimal value at 24 hꎬ while the PO activity in hemocytes was clam enhanced in zebra and white color groupsꎬwith the maximal level at 12 h in zebra clam and 6 h in white color clamꎬ and significant higher in mantle of zebra color group than that in orange and white color groups(p<0.05). The max imal PO activity in the mantle was detected in the orange color group clam at 12 h after PGN injectionꎬ indicating that the responds of PO activity to pathogens are varied with clams with different shell colorsꎬ which is involved in close correlation between shell pigmentation and immunity in Manila clam. These findings will provide theoretical support for shell color selection of Manila clam. Key words: Ruditapes philippinarumꎻ shell colorꎻ hemocyteꎻ mantleꎻ phenoloxidase

2 : 111 ( Pinctada maxima), 13, 11,,,,,, 15, 25 cm, cm, 4 5 kg 1-2],,, 3-7] 24] 25-26],,, ] min, 1, 5 m 4 m, 20 m , 9-22],,, (

2 : 111 ( Pinctada maxima), 13, 11,,,,,, 15, 25 cm, cm, 4 5 kg 1-2],,, 3-7] 24] 25-26],,, ] min, 1, 5 m 4 m, 20 m , 9-22],,, ( 12 2 2 0 1 6 4 South China Fisheries Science Vol. 12, No. 2 Apr., 2016 doi: 10. 3969/ j. issn. 2095-0780. 2016. 02. 016,,,, (,,, 510300) : ( Pinctada maxima),,,, 54. 55%, 0 0. 25 m - 2, 0 70. 31 gm - 2,