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TruePrep TM DNA Library Prep Kit V2 for Illumina TD501-TD503 Vazyme Biotech Co., Ltd Web: Tel: 400-600-9335 Sales: sales@vazyme.com Support: support@vazyme.com Service: service@vazyme.com Vazyme biotech co., ltd. 使用说明书 Version 6.2

目录 Contents 01/ 产品概述 TruePrep TM DNA Library Prep Kit V2 for Illumina 是针对 Illumina 高通量测序平台定向开发的专用试剂盒 使用该试剂盒可以将 DNA 样品制备成 Illumina 高通量测序平台专用的测序文库 和传统文库构建方法相比,TruePrep TM 试剂盒采用新型的转座酶法进行 DNA 片段化, 将繁琐的 DNA 片段化 末端修复和接头连接反应等步骤变为一步简单的酶促反应, 显著降低了起始模板的投入量并缩短了文库构建时间 该试剂盒共有三种规格, 分别适用于起始模板 DNA 投入量为 50 ng 5 ng 和 1 ng 的反应, 使用者可根据实验类型自由选择 试剂盒中所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证, 最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性 02/ 产品组分 货号 TD501-01/02 TD502-01/02 TD503-01/02 规格 24/96 rxn 24/96 rxn 24/96 rxn 起始 DNA 量 50 ng 5 ng 1 ng TTE Mix V50 TTE Mix V5 TTE Mix V1 5 TS PPM Control DNA 24/96 μl 10/ 96/38 24/96 μl 10/ 96/38 24/96 μl 10/ 01/ 产品概述... 02 02/ 产品组分... 02 03/ 保存条件... 02 04/ 适用范围... 02 05/ 其他必备材料... 03 06/ 注意事项... 03 07/ 样品准备... 03 08/ 实验原理与流程概要... 04 09/ 使用方案...... 05 09-1/DNA 片段化... 05 09-2/PCR 富集... 07 09-3/ 扩增产物长度分选... 08 09-4/ 文库质量检测... 09 10/ 常见问题及解答... 10 产品组分表中标注的颜色代表各组分管盖颜色 TTE = TruePrep Tagment Enzyme; TTBL = TruePrep Tagment Buffer L; TS= Terminate Solution; PPM = PCR Primer Mix; = TruePrep Amplify Enzyme; TAB = TruePrep Amplify Buffer. Control DNA, Mouse Genomic DNA, 50 ng/μl. 03/ 保存条件 TD501: 所有组分 -20 C 储存 ; TD502:5 TS 室温储存, 其余组分 -20 C 储存 ; TD503:5 TS 室温储存, 其余组分 -20 C 储存 04/ 适用范围 本产品适用于将纯化的 DNA 样品制备成 Illumina 高通量测序平台专用文库 如 DNA 样品为 PCR 产物, 应保证其长度 >500 bp 因转座酶无法作用于 DNA 末端, 因此 PCR 产物最末端 50 bp 测序覆盖度可能会有所降低 推荐在制备 PCR 产物时将待测区域两末端各延长 50-100 bp, 以避免出现末端测序覆盖度降低的情况 01/ 02

05/ 其他必备材料 VAHTS TM DNA Clean Beads(Vazyme #N411); 磁力架 ; PCR 热循环仪 ; 低吸附 EP 管 PCR 管 ; 无水乙醇 ; 灭菌超纯水 ; TruePrep TM Index Kit V2 for Illumina (Vazyme #TD202) 或 TruePrep TM Index Kit V3 for Illumina (Vazyme #TD203) 08/ 实验原理与流程概要 TruePrep Tagment Enzyme Mix Adapter 1 Adapter 2 Tagmentation of input DNA 06/ 注意事项 磁珠操作注意事项 : 使用前将磁珠平衡至室温, 所有磁珠操作都应于室温进行, 切勿将磁珠置于 -20 C 冻存 ; 每次吸取磁珠前都应涡旋振荡充分混匀,DNA 样品加入磁珠后应保证与磁珠充分混匀 ; 移取上清时应在磁珠被彻底吸附后小心进行, 避免吸到磁珠而影响后续实验 ; 80% 乙醇应现配现用, 漂洗磁珠后应尽量吸干残留乙醇 ; 磁珠在洗脱前应充分干燥 ( 表面由光亮褐色变为磨砂褐色 ), 以免乙醇残留影响后续实验, 但也需避免磁珠过分干燥开裂而影响 DNA 样品洗脱效率 P5 N5 Index 2 (i5) Strand Displacement and Limited-Cycle PCR Index 1 (i7) N7 P7 Size-Selection and Purification 样品交叉污染注意事项 : 吸取不同样品时应更换枪头 ; 使用带滤芯的枪头 PCR 产物污染注意事项 : 将 PCR 反应体系配制区和 PCR 产物纯化区进行强制性的物理隔离 ; 使用专用的移液器等设备 ; 定时对各实验区域进行清洁 ( 使用 0.5% 次氯酸钠或 10% 漂白剂进行擦拭清理 ) 试剂使用注意事项 : 试剂应避免反复冻融, 首次使用后将剩余试剂小份分装冻存 07/ 样品准备 起始材料 : 纯化过的 DNA, 溶于灭菌超纯水中 DNA 浓度测定 : 因 TTE Mix 对 DNA 浓度非常敏感, 所以准确的 DNA 浓度测定对实验成功与否至关重要 推荐使用 Qubit 或荧光染料 PicoGreen 对 DNA 样品进行浓度测定, 请勿使用任何基于吸光度测量为基础的测定方法 DNA 纯度要求 : A260/A280 = 1.8-2.0 i5 index Read Read 1 Sequencing Strategy Read 2 i7 index Read Adapter 1 and Adapter 2, two oligos embedded in TruePrep Tagment Enzyme P5 and P7, two universal PCR Primers N5 and N7, two index primers containing index 2 (i5) and index 1 (i7) respectively TruePrep TM 文库构建基本原理 TruePrep Tagment Enzyme Mix (TTE Mix) 中包含转座酶和两种等摩尔的接头 Adapter 1 和 Adapter 2 将该预混液与 DNA 混合,55 C 下孵育 10 min, 即可实现 DNA 片段化的同时末端接上接头 这种片段化产物经 N5 (N5XX) 和 N7 (N7XX) 以及 P5 和 P7 (PCR Primer Mix, PPM) 两对引物扩增 扩增产物大小分选和纯化后即为可测序文库 文库结构 Index 2 (i5) 5 -AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACIIIIIIIITCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAG ACAG-NNNNNN-CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGACIIIIIIIIATCTCGTATGCCGTC TTCTGCTTG-3 Index 1 (i7) IIIIIIII: Index 2 (i5), 8 bases IIIIIIII: Index 1 (i7), 8 bases -NNNNNN-: 插入序列 03/ 04

TD501 (50 ng DNA Input) TD502/503 (5 ng/1 ng DNA Input) 2. 在灭菌 PCR 管中配置如下反应体系 : 50 ng DNA 片段化 片段化 5 ng / 1 ng DNA 组分 50 ng DNA TTE Mix V50 体积 TTE Mix V50 TTE Mix V5 / V1 To 50 μl ddh 2O To 50 μl ddh 2O To 20 μl 3. 使用移液器轻轻吹打 20 次充分混匀 ( 重要!) 4. 将反应管置于 PCR 仪中, 运行如下反应程序 : 55 C 孵育 10 min VAHTS TM DNA Clean Beads 纯化 PCR 富集纯化产物 2 PPM N5XX N7XX 扩增 5-9 个循环 VAHTS TM DNA Clean Beads 长度分选与纯化 55 C 孵育 10 min 加入 5 TS 终止反应 PCR 富集 ddh 2O 片段化产物 2 N5XX N7XX 扩增 8-15 个循环 VAHTS TM DNA Clean Beads 长度分选与纯化 温度时间 热盖 55 C 10 min 10 C 反应完成后应立即进行产物纯化, 否则 DNA 样品将过度片段化, 导致最终文库片段变小 5. 片段化产物使用 VAHTS TM DNA Clean Beads 进行纯化 1 涡旋振荡混匀 VAHTS DNA Clean Beads 并吸取 50 μl 至 50 μl 片段化产物中, 涡旋振荡或使用移液器吹打 10 次充分混匀, 室温孵育 5 min 2 将反应管短暂离心并置于磁力架上, 使磁珠与液体分离, 待溶液澄清后 ( 约 5 min) 小心移除上清 3 保持反应管始终处于磁力架上, 加入 200 μl 新鲜配制的 80% 乙醇漂洗磁珠, 室温孵育 30 sec, 小心移除上清 4 重复步骤 3, 总计漂洗两次 5 保持反应管始终处于磁力架上, 开盖空气干燥约 5 min 6 将反应管从磁力架上取出, 加入 26 μl 灭菌超纯水洗脱 涡旋振荡或使用移液器吹打 10 次充分混匀, 室温孵育 5 min 7 将反应管短暂离心并置于磁力架上, 使磁珠与液体分离, 待溶液澄清后 ( 约 5 min) 小心吸取 2 上清至新的灭菌 PCR 管中 除此之外, 片段化产物也可使用其他磁珠或柱纯化试剂盒进行纯化 6. 立即进行步骤 09-2/PCR 富集 1-B:5 ng 起始 DNA 片段化 ( 适用于试剂盒 TD502) 09/ 使用方案请在实验前仔细阅读本操作说明, 本说明书适用于三种规格的试剂盒, 分别对应起始模板 DNA 投入量为 50 ng 5 ng 和 1 ng 的反应 三种规格试剂盒中某些组分有差异, 相应的反应体系有细微差别, 实验操作过程中不可混用, 以免造成不必要的浪费或者实验进度的耽误! 09-1/DNA 片段化 ( 根据试剂盒货号选择合适的方案 ) 1-A:50 ng 起始 DNA 片段化 ( 适用于试剂盒 TD501) 1. 室温解冻, 上下颠倒混匀后备用 确认 5 TS 是否处于室温, 并轻弹管壁确认有无沉淀 如有沉淀,37 C 加热并涡旋振荡混匀, 沉淀即可溶解 1. 室温解冻, 上下颠倒混匀后备用 确认 5 TS 是否处于室温, 并轻弹管壁确认有无沉淀 如有沉淀,37 C 加热并涡旋振荡混匀, 沉淀即可溶解 2. 在灭菌 PCR 管中配置如下反应体系 : 组分体积 5 ng DNA TTE Mix V5 To 20 μl 3. 使用移液器轻轻吹打 20 次充分混匀 ( 重要!) 05/ 06

4. 将反应管置于 PCR 仪中, 运行如下反应程序 : 温度时间 热盖 55 C 10 min 10 C 5. 反应完成后立即向产物中加入 5 TS, 使用移液器轻轻吹打充分混匀, 置于室温放置 5 min 反应完成后应立即加入 5 TS 终止反应, 否则 DNA 样品将过度片段化, 导致最终文库片段变小 6. 立即进行步骤 09-2/PCR 富集 1-C:1 ng 起始 DNA 片段化 ( 适用于试剂盒 TD503) 1. 室温解冻, 上下颠倒混匀后备用 确认 5 TS 是否处于室温, 并轻弹管壁确认有无沉淀 如有沉淀,37 C 加热并涡旋振荡充分混匀, 沉淀即可溶解 2. 在灭菌 PCR 管中配置如下反应体系 : 组分体积 1 ng DNA TTE Mix V1 To 20 μl 2. 使用移液器轻轻吹打充分混匀, 将反应管置于 PCR 仪中, 运行如下反应程序 : 温度 72 C* 98 C 98 C 60 C 72 C 72 C 4 C 时间热盖 3 min 30 sec 15 sec 30 sec 3 min 5 min *72 C 孵育步骤用于进行链置换反应, 请勿删除该步骤 扩增循环数需根据实际情况自行选择, 选择原则如下 : 起始 DNA 量 50 ng 5 ng 1 ng 适用试剂盒 TD501 TD502 TD503 扩增循环数越少, 扩增 Duplication 越低, 但文库产量也相应降低 ; 不同循环数的扩增产物经过磁珠分选后能获得的文库总量可参考步骤 09-4/ 文库质量检测 3. PCR 反应结束后进行步骤 09-3/ 扩增产物长度分选 循环数 5-15 参考循环数 5-9 8-12 11-15 3. 使用移液器轻轻吹打 20 次充分混匀 ( 重要!) 4. 将反应管置于 PCR 仪中, 运行如下反应程序 : 温度 时间 热盖 55 C 10 min 10 C 5. 反应完成后立即向产物中加入 5 TS, 使用移液器轻轻吹打充分混匀, 置于室 温放置 5 min 反应完成后应立即加入 5 TS 终止反应, 否则 DNA 样品将过度片段化, 导致最终文库片段变小 6. 立即进行步骤 09-2/PCR 富集 09-2/PCR 富集 1. 将 PCR 管置于冰上, 配置如下反应体系 : 试剂盒货号 TD501 TD502/TD503 09-1 2 2 PPM N5XX* N7XX* *TruePrep TM Index Kit V2 for Illumina (Vazyme #TD202) 中提供 8 种 N5XX 和 12 种 N7XX, 可根 据样品数量和 Index 搭配策略自行选择 09-3/ 扩增产物长度分选推荐使用 VAHTS TM DNA Clean Beads 对扩增产物进行长度分选, 使用前请将磁珠平衡至室温并涡旋振荡充分混匀 初始 PCR 产物体积为 50 μl, 因 PCR 过程中样品蒸发导致产物体积不足 50 μl 进行分选操作前必须使用灭菌蒸馏水将体积补齐至 50 μl, 否则分选片段的长度可能与预期不一致 扩增产物长度分选中两轮磁珠的使用量 (R1 和 R2) 参见下表 : 文库平均总长度 ~ 350 bp ~ 450 bp ~ 550 bp 文库平均插入长度 ~ 230 bp ~ 330 bp ~ 430 bp 文库总长度分布范围 250 bp - 450 bp 300 bp - 700 bp 400 bp - 900 bp 第一轮磁珠用量 R1 = 35.0 μl (0.70 ) R1 = 30.0 μl (0.60 ) R1 = 25.0 μl (0.50 ) 第二轮磁珠用量 R2 = 7. (0.15 ) R2 = 7. (0.15 ) R2 = 7. (0.15 ) 磁珠用量是依据 PCR 产物初始体积计算而得, 如使用 0.60 进行分选, 则 R1:0.60 50 μl = 30.0 μl, R2:0.15 50 μl = 7. 1. 涡旋振荡混匀 VAHTS DNA Clean Beads 并吸取 R1 体积至 50 μl PCR 产物中, 涡旋振荡或使用移液器吹打 10 次充分混匀, 室温孵育 5 min 磁珠比较粘稠, 请准确移取相应的体积, 否则可能导致分选片段的长度与预期不一致 2. 将反应管短暂离心并置于磁力架上, 使磁珠与液体分离, 待溶液澄清后 ( 约 5 min) 小心转移上清至新的灭菌 PCR 管中, 丢弃磁珠 3. 涡旋振荡混匀 VAHTS DNA Clean Beads 并吸取 R2 体积至上清中, 涡旋振荡或使用移液器吹打 10 次充分混匀, 室温孵育 5 min 07/ 08

4. 将反应管短暂离心并置于磁力架上, 使磁珠与液体分离, 待溶液澄清后 ( 约 5 min) 小心移除上清 5. 保持反应管始终处于磁力架上, 加入 200 μl 新鲜配制的 80% 乙醇漂洗磁珠 室温孵育 30 sec, 小心移除上清 6. 重复步骤 5, 总计漂洗两次 7. 保持反应管始终处于磁力架上, 开盖空气干燥磁珠约 5 min 8. 将反应管从磁力架上取出, 加入 22 μl 灭菌超纯水洗脱 涡旋振荡或使用移液器吹打 10 次充分混匀, 室温孵育 5 min 9. 将反应管短暂离心并置于磁力架上, 使磁珠与液体分离, 待溶液澄清后 ( 约 5 min) 小心吸取 20 μl 上清至新的灭菌 PCR 管中,-20 C 保存 此外, 如需获得长度分布更集中的文库, 扩增产物可使用胶回收试剂盒进行片段长度分选和纯化 如对文库长度分布范围无特殊要求, 扩增产物也可不进行长度分选直接使用磁珠或柱纯化试剂盒进行纯化 09-4/ 文库质量检测文库浓度测定为了得到高质量的测序结果, 必须对文库浓度进行精确测定 推荐使用 Realtime PCR 的方式对文库浓度进行绝对定量 此外, 文库浓度还可以使用基于特异性识别双链 DNA 的荧光染料法进行测定 ( 如 Qubit 或荧光染料 PicoGreen ), 最终使用下表推荐的近似公式换算文库的摩尔浓度 请勿使用任何基于吸光度测量为基础的方法 文库平均总长度近似转换公式 350 bp 1 ng/μl = 4.3 nm 450 bp 1 ng/μl = 3.3 nm 550 bp 1 ng/μl = 2.7 nm TruePrep TM DNA Library Prep Kit V2 for Illumina 文库产出参照表 : TD501 (50 ng DNA Input) 扩增循环数 : 5 6 7 8 9 TD502 (5 ng DNA Input) 扩增循环数 : 8 9 10 11 12 TD503 (1 ng DNA Input) 扩增循环数 : 11 12 13 14 15 文库产出 ( 不进行片段长度分选, ng): 250 400 600 1000 1500 文库产出 ( 进行片段长度分选, ng): 100 150 250 500 800 表中所述 ng 数为文库总质量 文库质量浓度可由该数值除以文库终体积计算而得 文库摩尔浓度可根据文库平均长度由文库质量浓度计算而得 文库长度分布检测将制备好的文库在 Agilent 2100 Bioanalyzer 上进行长度分布检测 Agilent 2100 Bioanalyzer 文库质量分析使用 TruePrep TM DNA Library Prep Kit V2 for Illumina (TD501, PCR 扩增 9 个循环 ) 制备的人基因组文库 红色线 :PCR 产物不进行片段长度分选, 直接使用 1 磁珠纯化后得到的文库 ; 紫色线 : 通过磁珠分选得到的 ~ 350 bp 文库 ; 绿色线 : 通过磁珠分选得到的 ~ 450 bp 文库 ; 黄色线 : 通过磁珠分选得到的 ~ 550 bp 文库 10/ 常见问题及解答 1. 该试剂盒是否包含打断步骤? 答 : 包含 TruePrep TM 试剂盒采用新型的转座酶法进行 DNA 片段化, 将繁琐的 DNA 片段化 末端修复和接头连接反应等步骤变为一步简单的酶促反应, 显著缩短了实验耗时 2. TruePrep 系列试剂盒利用转座酶打断 DNA 是否存在偏好性? 答 : 转座酶打断时存在一定的偏好性, 但测试表明其并不影响测序结果及数据分析 3. 可否采用 TD502 或 TD503 构建 50 ng 起始的 DNA 文库? 答 : 不推荐这么做,TD501 TD502 TD503 分别对应的模板投入量为 50 ng 5 ng 和 1 ng, 相应试剂盒中酶的浓度不同 如采用 TD502 或 TD503 构建 50 ng 起始的 DNA 文库, 将使模板 DNA 片段化不完全或者大小偏大, 导致最终的文库与预期相差较远 因此强烈建议根据实际 DNA 起始量选择相应规格的产品 4. 使用 TD501/502/503 构建 DNA 文库时,55 C 反应 10 min 后可否不用磁珠纯化或 TS 溶液终止反应, 而直接进行 PCR 文库扩增? 答 : 请按照说明书流程进行纯化或终止反应, 否则片段化反应不能有效终止, 可能导致最终的文库总长度与预期相比偏小 文库质量较差等 5. TruePrep 系列能提供多少 index 组合? 答 : 最多提供 384 种 index 组合 其中 TruePrep TM Index Kit V2 for Illumina (Vazyme #TD202) 包含 8 种 N5XX 和 12 种 N7XX, 可提供 96 种 index 组合 ;TruePrep TM Index Kit V3 for Illumina (Vazyme #TD203) 包含 16 种 N6XX 以及 24 种 N8XX, 可提供 384 种 index 组合 09/ 10