RevertAid 第一链 cdna Synthesis 试剂盒 #K1621, #K1622 分析证明书 #K1621 Lot 质量控制 采用 100 fg 对照 GAPDH RNA 和对照引物进行 RT-PCR 反应, 通过在 1% 琼脂糖上进行凝胶电泳和溴 化乙锭染色显示得到足够量的 496 bp 的产物 质量认证人 :Jurgita Zilinskiene 目录 页码试剂盒组成.2 存储条件.2 产品说明.2 注意事项...3 操作步骤...6 RT-PCR.6 合成 cdna 用于克隆.. 7 实验对照.8 问题分析与解决...10 Page 1
试剂盒成分 RevertAid 第一链 cdna 合成试剂盒 20 次 100 次 #K1621 #K1622 RevertAid M-MuLV 反转录酶 (200 u*/μl) 25 μl 120 μl RiboLock RNA 酶抑制剂 (20 u**/μl) 25 μl 120 μl 5 反应缓冲液 (250 mm Tris-HCl (ph 8.3), 250 mm KCl, 20 mm MgCl 2, 50 mm DTT) 150 μl 500 μl 10mM dntp 混合物 50 μl 250 μl Oligo(dT) 18 引物 100 μm, 0.5 μg/μl (15 A 260 u/ml) 25 μl 120 μl 随机六聚体引物 100 μm, 0.2 μg/μl (6 A260 u/ml) 25 μl 120 μl GAPDH 正向引物, 10 μm 5 CAAGGTCATCCATGACAACTTTG 3 20 μl 20 μl GAPDH 反向引物, 10 μm 5 GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG - 3 20 μl 20 μl 对照 GAPDH RNA 1.3 kb 3 -poly(a) tailed RNA transcript, 0.05 μg/μl 20 μl 20 μl 无核酸酶高纯度水 2x1.25 ml 2x1.25 ml * 一个单位的 RevertAid M-MLV 逆转录酶在 37 10 分钟将 1 nmol 的 dtmp 转化为多核苷酸组分 ( 吸附在 DE81 上 ) ** 一个单位的 RiboLock RNase 酶抑制剂抑制 5ng RNA 酶 A 50% 的活性 存储条件 试剂盒中所有组分应存储在 -20 C 对照用 RNA 可存储于 -70 C 以便长期使用 产品说明 RevertAid 第一链 cdna 合成试剂盒以 mrna 或者总 RNA 为模板, 高效合成第一链 cdna 本试剂盒使用 RevertAid M-MuLV 反转录酶, 它的 RNA 酶 H 的活性与 AMV 反转录酶相比较低 该反转录酶可耐受 42-50 C 温度, 合成的 cdna 片段长度达 13kb 试剂盒中含有 RiboLock 重组 RNA 酶抑制剂, 防止 RNA 降解, 可耐受 55 C 高温 试剂盒同时含有 oligo(dt) 18 和随机六聚体引物 随机六聚体引物与模板非特异性地结合, 以总 RNA 中任何 RNA 为模板合成 cdna oligo(dt) 18 选择性和 RNA 3 poly(a) 配对结合, 只以有 poly(a) 尾巴的 mrna 为模板合成 cdna 使用本试剂盒也可采用序列特异性引物 合成的第一链 cdna 能直接用作 PCR 或荧光定量 PCR 的模板, 第二链 cdna 的合成或线性 RNA 扩增, 也可用于需要用带有放射性或非放射性核苷酸标记第一链 cdna 的实验, 比如将标记好的第一链 cdna 作为杂交实验中的探针或者用于微阵列分析 Page 2
注意事项 避免核酸酶污染 RNA 的纯度和完整性对于合成全长 cdna 至关重要 RNA 很容易被 RNA 酶 A 降解, 而 RNA 酶 A 广泛稳定地存在于实验室中 试剂盒中的所有成分都经过了无 RNA 酶的严格验证并保证不含有 RNA 酶 为防止污染, 实验室和所有实验准备工作都必须保证没有 RNA 酶污染 避免 RNA 酶污染的常规建议 : 用 DEPC 处理实验用到的所有管子和枪头, 或者购买已经证明无核酸酶的实验用具 整个实验过程戴手套, 因为皮肤是 RNA 酶的一个常见来源 并经常更换手套 使用无 RNA 酶的试剂, 即使是超纯水也要确保无 RNA 酶 ( 比如 #R0581, 无 RNA 酶的高纯度水 ) 使用 RNA 酶抑制剂, 比如试剂盒中提供的 Fermentas RiboLock RNA 酶抑制剂来保护 RNA 试剂盒如不使用, 要严格密封保存 在反转录过程中, 所有管子要确保扣严 模板 RNA 通过标准方法得到的细胞总 RNA 可用本试剂盒获得第一链 cdna 纯化过的 RNA 要保证不含有盐, 金属离子, 乙醇和苯酚, 因为以上成分会干扰第一链 cdna 的合成反应 可采用乙醇沉淀 RNA 的方法去除掉痕量污染物 ( 然后再用 75% 冷乙醇冲洗沉淀两次 ) 如果要进行 RT-PCR, 模板 RNA 要确保没有 DNA 污染 在进行 cdna 合成前, 模板 RNA 必须用无 RNA 酶的 DNA 酶 I(#EN0521) 处理去除掉痕量 DNA 实验过程要设置无 RT 对照反应, 即此对照反应中含有除逆转录酶以外的其他所有 RT-PCR 成分 (RT- 对照 ) 去除 RNA 中基因组 DNA 的实验步骤 : 1. 将以下成分加入到一个无 RNA 酶的管子中 : RNA 1μg 10 反应缓冲液 ( 含有 MgCl 2 ) 1μl DNA 酶 I, 无 RNA 酶 (#EN0521) * 1μl(1u) 无核酸酶的高纯度水加到 10μl * 对于每 1μg RNA, 不要使用超过 1u 的 DNA 酶 I( 不含 RNA 酶的 ) 2. 37 C 孵育 30 分钟 3. 加入 50 mm EDTA,65 C 孵育 10 分钟 在含有二价阳离子 (1) 而缺乏螯合剂的环境中,RNA 会水解 或者可采用酚 / 氯仿试剂抽提的方法来替代加 EDTA 孵育这一步骤 4. 使用制备好的 RNA 为模板进行逆转录反应 RNA 样品品质在进行 cdna 合成前, 要先评估 RNA 的完整性 最经常使用的方法是跑变性的琼脂糖凝胶, 然后用溴化乙锭 ( 简称 EB, 以下同 ) 染色 如果来源于真核细胞的总 RNA 在跑完胶后可清晰看到 18s 和 28s rrna Page 3
的条带, 可认为 RNA 是完整的 28s rrna 的条带亮度约为 18s rrna 的两倍 任何拖尾条带都是 mrna 降解的信号 如果这种拖尾条带出现, 需要重新提取总 RNA 样品 为了进行 RT-PCR, 需要评价纯化的 RNA( 人类, 小鼠或大鼠 ) 的适用性 常用方法是在 RT-PCR 中设置对照, 此对照含有试剂盒中提供的模板 RNA 和对照用 GAPDH 引物 GAPDH 特异性引物与人, 小鼠, 大鼠的 GAPDH 基因完全互补,RT-PCR 扩增后得到 496bp 的产物 RNA 样品用量 0.1 ng - 5 μg 的总 RNA 或者 1 ng - 500 ng 的 poly(a) mrna 作为模板合成第一链 cdna, 此反应可作为两步法 RT-PCR 中的起始步骤 使用 1 μg 分离纯化的 mrna 作为模板合成的第一链 cdna, 可用于第二链合成或者后续克隆反应 引物合成第一链 cdna 使用的引物可为 oligo(dt) 18 引物, 随机六聚体引物或者基因特异性引物中的任意一种 Oligo(dT) 18 引物针对具有 3 poly(a) 尾巴的真核 mrna 随机六聚体引物适用于总 RNA(rRNA 或者 mrna) 因此, 相对 Oligo(dT) 18, 使用随机六聚体引物会得到更复杂的第一链 cdna 混合物, 这样会降低后续 PCR 实验的特异性和精确性 但是随机引物在以下几种情况中是有优势的 : 比如没有 poly(a) 尾巴的 mrna 或者使用富含 poly(a) 结构的 RNA 为模板 基因特异性引物用于从总 RNA 或者 mrna 混合物中合成特异性的某条或者几条 cdna, 这种特异引物需要使用者自己提供 第一链 cdna 合成过程第一链 cdna 合成可进行单样本反应, 可以使用不同的模板平行进行多样本反应 因此, 准备反应混合物可每种反应组分单独加入, 也可使用 master mix(master mix 含有除去模板 RNA 的以外的其他反应组分 ) 取决于 RNA 模板结构的情况, 将变性和退火分开操作可能会提高 RT-PCR 的特异性和精确度 下面图表描述的是第一链 cdna 合成的主要步骤 详细步骤请见第六页 图表中描述了包括 RNA 变性步骤的单样本反应和使用不同模板的多样本反应流程 与单样本反应相比, 多样本反应采用相同的反应体系 (20ul) 和相同的试剂用量, 但试剂的加入顺序有所不同 ( 见下图 ) Page 4
图表 1. 合成 cdna 的单样本反应和多样本反应的实验过程概述 有 RNA 变性 单样本反应 无 RNA 变性 ( 简化的操作步骤 ) 多样本反应无 RNA 变性有 RNA 变性 ( 简化的操作步骤 ) 混合 RNA 和引物, 混合 RNA 和引物, 至 12μl 至 5μl 准备无 RNA 的反 应混合液 65 变性处理 5 分 65 变性处理 5 分 钟, 置于冰上 钟, 置于冰上 将上述反应液加 准备无 RNA 和引 到管子中 物的反应混合液 加入缓冲液, RNA 酶抑制剂, dntp, RevertAid TM 酶 加入 RNA, 引物, buffer,rna 酶抑制剂,dNTP, RevertAid TM 酶 将上述反应液 RNA 和引物加到管子中 ( 共 20μl) 加入模板 RNA ( 共 20μl) ( 共 20μl) ( 共 20μl) 在 42 下孵育 60 分钟 ( 对于 oligo(dt) 18 引物或基因特异性引物 ) 或 在 25 下孵育 5 分钟在 42 下孵育 60 分钟 ( 对于随机引物 ) 在 70 下孵育 5 分钟终止反应 Page 5
操作步骤 开始前请先阅读第 3-5 页的注意事项 RT-PCR I. 第一链 cdna 合成 融化后, 将试剂盒中各组分混匀并稍微离心, 离心后置于冰上 1. 在置于冰上的无菌无核酸酶的 PCR 管中, 按照顺序加入下面的反应物 模板 RNA 总 RNA 或者 poly(a) mrna 或者特异性 RNA 0.1 ng - 5 μg 10 pg - 0.5 μg 0.01 pg - 0.5 μg 引物 oligo (dt) 18 引物随机六聚体引物基因特异性引物 15-20 pmol 无核酸酶的高纯水 到 12μl 总体积 12μl 2. 可选优化步骤 如果 RNA 模板 GC 含量高或者含有二级结构, 将模板和引物的混合液轻轻混匀, 短暂离心,65 C 孵育 5 分钟, 冰上冷却, 离心, 再置于冰上冷却 3. 将下列组分按照顺序加入 5X Reaction Buffer RiboLock RNA 酶抑制剂 (20 u/μl) 10 mm dntp Mix 4 μl 2 μl RevertAid M-MuLV 逆转录酶 (200 u/μl) 总体积 20 μl 4. 轻轻混匀, 离心 5. 如果使用 oligo(dt) 18 或者基因特异型引物,42 C 孵育 60 分钟 如果使用随机六聚体引物,25 C. 先孵育 5 分钟, 随后 42 C 孵育 60 分钟 注意 : 高 GC 含量的模板反应温度可升高至 45 C 6. 70 C 加热 5 min 终止反应 反应产物可直接用于 PCR 反应或者在 -20 C 保存少于一周的时间 如想延长保存时间, 建议使用 -70 C 保存 II. 第一链 cdna 的 PCR 扩增合成的第一链 cdna 可直接用于 PCR 或 qpcr 第一链 cdna 反应液体积不能超过 PCR 反应体系的 1/10 通常 50 μl 的 PCR 反应体系中, 第一链 cdna 反应液加入 2μl Taq DNA 聚合酶,PCR Master Mix Page 6
(2X) 或者 PyroStart Fast PCR Master Mix (2X) 可用于扩增小于 3kb 的片段 DreamTaq DNA 聚合酶扩增至 6kb 长的片段 对于 20 kb 的长片段, 建议使用 Long PCR Enzyme Mix 和 High Fidelity PCR Enzyme Mix 合成 cdna 用于克隆 I. 第一链 cdna 合成 融化后, 将试剂盒中各组分混匀并短暂离心, 离心后置于冰上 1. 在置于冰上的无菌无核酸酶的 PCR 管中, 按照顺序加入下面的反应物 模板 RNA poly(a) mrna 1 μg 或特异性 RNA 0.5-1 μg 引物 oligo (dt) 18 引物或随机六聚体引物或基因特异性引物 100 pmol 无核酸酶的高纯水 至 12μl 总体积 12μl 2. 可选优化步骤 如果 RNA 模板 GC 含量高或者含有二级结构, 轻轻混匀, 短暂离心,65 C 孵育 5 分钟, 冰上冷却, 离心, 再置于冰上冷却 3. 将下列成分按照顺序加入 5X Reaction Buffer 4 μl RiboLock RNA 酶抑制剂 (20 u/μl) 10 mm dntp Mix 2 μl RevertAid M-MuLV 逆转录酶 (200 u/μl) 总体积 20 μl 4. 轻轻混合, 离心 5. 如果使用 oligo(dt) 18 或者基因特异型引物,42 C 孵育 60 分钟 如果使用随机六聚体引物,25 C. 先孵育 5 分钟, 随后 42 C 孵育 60 分钟 注意 : 高 GC 含量的模板反应温度可升高至 45 C 6. 70 C 加热 5 min 终止反应 反应产物可直接用于 PCR 反应或者在 -20 C 保存少于一周 如想延长保存时间, 建议使用 -70 C 保 存 II. 第二链 cdna 合成 1. 在冰上将下表的组分加入到 20 μl 第一链 cdna 反应混合液中 : Page 7
10X Reaction Buffer( 适用于 DNA 聚合酶 I) 8 μl RNA 酶 H, E.coli (#EN0201) 1u DNA 聚合酶 I, E.coli (#EP0041) 30u 无核酸酶的高纯水至 100 μl 总体积 100 μl 2. 轻轻混匀, 短暂离心 3. 15 C 孵育 2 小时 温度不要高于 15 C 4. 加入 12.5 u T4 DNA 聚合酶 (#EP0061),15 C 孵育 5 min 5. 加入 5 μl of 0.5 M EDTA, ph 8.0 (#R1021) 终止反应 6. 通过酚 / 氯仿抽提纯化平端的 cdna, 以用于的克隆相关实验, 比如 : 接头连接, 磷酸化, 片段大小分离, 连接和转化 实验对照 应该采用阴性和阳性对照来验证第一链 cdna 合成的结果 无逆转录酶的阴性对照 (RT-) 在 PCR 或者 qpcr 反应中很重要, 它可用于评估基因组 DNA 对 RNA 样品的污染状况 RT- 对照组不含有逆转录酶, 但含有实验所需的其他组分 无模板的阴性对照 (NTC) 对于检测反应试剂的污染情况很重要 NTC 对照组不含有 RNA 模板, 但含有实验所需的其他组分 阳性对照试剂盒中已经提供阳性对照所需的 RNA 模板和基因特异性引物 人 GAPDH 对照 RNA(1.3kb) 是通过体外转录方式得到的 GAPDH 特异性引物与人, 小鼠, 大鼠的 GAPDH 基因完全互补,RT-PCR 后的产物长度大约 496bp 下面是阳性对照的操作步骤 I. 阳性对照第一链 cdna 的合成反应 融化后, 将试剂盒中各组分混匀并短暂离心, 离心后置于冰上 1. 在置于冰上的无菌无核酸酶的 PCR 管中, 按照顺序加入下面的反应物 对照 GAPDH RNA (50 ng/μl) 2 μl Oligo (dt) 18 引物 或随机六聚体引物 或基因特异性引物 5X Reaction Buffer 4 μl RiboLock RNA 酶抑制剂 (20 u/μl) 10 mm dntp Mix 2 μl RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase (200 u/μl) 无核酸酶的高纯水 9 μl 总体积 20 μl Page 8
2. 轻轻混匀离心 3. 如果使用 oligo(dt) 18 或者基因特异型引物,42 C 孵育 60 分钟 如果使用随机六聚体引物,25 C. 先孵育 5 分钟, 随后 42 C 孵育 60 分钟 4. 70 C 加热 5 min 终止反应 5. 短暂离心, 按照第九页的操作步骤进行对照 PCR 扩增 II. 对照 PCR 扩增 1. 将第一链 cdna 合成反应液 ( 第 8 页 ) 按照 1:1000 的比例用无核酸酶的水高纯水稀释 2. 其他组分融化后, 轻微震荡混匀并离心 3. 薄壁 PCR 管置于冰上, 加入下列试剂 : 从对照 RT 反应得到的 cdna (1:1000 dilution) 2 μl 10X PCR buffer 5 μl 10 mm dntp Mix (0.2 mm each) 25 mm MgCl 2 3 μl 正向 GAPDH Primer 1.5 μl 反向 GAPDH Primer 1.5 μl Taq DNA polymerase (5 u/μl) 0.5 μl 无核酸酶的高纯水 35.5 μl 总体积 50 μl 4. 进行 PCR 反应,PCR 仪要有加热的盖子, 或者在 PCR 管中加入 25μl 的矿物油 步骤 温度, C 时间 循环数 初始变性 94 3 分钟 1 变性 94 30 秒 退火 58 30 秒 35 延伸 72 45 秒 5. 将 5-10 μl RT-PCR 产物上 1% 琼脂糖电泳 EB 染色后应该清晰可见 496 bp PCR 产物 Page 9
问题分析与解决 存在问题产物产量低或者没有 RT-PCR 产物 RT-PCR 产物比预计的长阴性对照中含有 RT-PCR 产物 原因和解决办法 RNA 模板降解 RNA 的纯度和完整性对于合成全长 cdna 非常重要 不要忘记在进行 cdna 合成实验前检测 RNA 的完整性, 真核细胞的 RNA 在跑完变性胶后可看到 18s 和 28s rrna 的锐利条带 参考第 3 页的建议避免 RNA 酶的污染 模板纯度低 RNA 纯化过程中使用的一些痕量成分可能会残存在溶液中并抑制第一链合成, 比如 SDS,EDTA, 胍盐, 磷酸盐, 焦磷酸盐, 聚胺, 亚精胺 可采用乙醇沉淀方法去除掉痕量污染物 ( 乙醇重新沉淀 RNA, 再用 75% 冷乙醇冲洗沉淀 ) RNA 模板量不够模板增加到建议使用量 随后才用 DNA 酶 I 处理, 在 EDTA 存在下 ( 螯合镁离子 ), 加热失活终止反应, 具体操作见第 3 页 在缺乏螯合剂的加热的环境中,RNA 会水解 (1) 引物选择不正确使用针对 RNA 模板的正确引物 细菌 RNA 或者不含有 poly(a) 尾巴的 RNA, 使用随机六聚体引物替代 oligo(dt) 18 确保序列特异性引物与模板的 3 端互补 模板 GC 含量高如果模板 GC 含量高或者富含二级结构, 将反转录温度提高到 45 C. RNA 模板被基因组 DNA 污染基因组 DNA 中的内含子被扩增 在进行反转录之前用 DNA 酶 I 进行消化 ( 详见第 3 页操作步骤 ) 为避免基因组 DNA 的扩增, 引物设计在外显子和内含子连接区 RNA 模板被基因组 DNA 污染 PCR 产物在 RT- 阴性对照中表明反应中有基因组 DNA 污染 在进行反转录之前用 DNA 酶 I 进行消化 ( 具体详见第三页操作步骤 ) 参考文献 1. Wiame, I., et al., Irreversible heat inactivation of DNaseI without RNA degradation, BioTechniques, 29, 252-256, 2000. RevertAid, RiboLock, PyroStart and DreamTaq 均为 Fermentas 持有的商标 产品使用限制说明本产品用于体外科学研究之用, 不可用于诊断或者药物研发, 也不可用于人类或者动物体 请登录 www.fermentas.com 查询此产品材料安全数据表 Page 10