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遂斋
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1 第一章 PCR 和 RT-PCR 基础 PCR 基础聚合酶链式反应 (PCR) 过程利用模板变性, 引物退火和引物延长的多个循环来扩增 DNA 序列这是一个指数增长的过程, 因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板, 使其成为检测核酸的一种非常灵敏的技术一般, 经过个循环得到的扩增产物就足够在溴化乙锭染色的凝胶上观察到反应包括几个成分 ( 表 1) 模板可以为纯化的基因组或质粒 DNA; 由 RNA 转化得到的 cdna; 或未经纯化的粗制生物样品, 如细菌克隆或噬菌斑引物确定了扩增产物的序列和长度最常用的热稳定聚合酶是 Taq DNA 聚合酶这种酶适用于常规扩增, 但是使用其他热稳定聚合酶会改善结果扩增反应还包括缓冲液, 三磷酸脱氧核苷及镁离子镁离子浓度影响酶的活性引物退火模板和 PCR 产物的熔点 (Tm), 忠实性以及引物二聚体的形成等在随后的章节中将讨论这些成分循环参数以及其他参与作用的因子相互间各种作用对于成功 PCR 的影响表 1. 反应成分 Component Final Concentration Template Primer 1 Primer 2 10X Reaction buffer Magnesium dntp mix Thermostable DNA polymerase 10^4-10^6 copies of DNA template µM µM 1X mM 200 mm each dntp 1-4 units/100 ml reaction RT-PCR 基础 RT-PCR 将以 RNA 为模板的 cdna 合成同 PCR 结合在一起, 提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法 RT-PCR 用于对表达信息进行检测或定量另外, 这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建 cdna 文库克隆 cdna RT-PCR 比其他包括 Northern 印迹 RNase 保护分析原位杂交及 S1 核酸酶分析在内的 RNA 分析技术, 更灵敏, 更易于操作 RT-PCR 的模板可以为总 RNA 或 poly(a)+ 选择性 RNA 逆转录反应可以使用逆转录酶, 以随机引物 oligo(dt) 或基因特异性的引物 (GSP) 起始 RT-PCR 可以一步法或两步法的形式进行在两步法 RT-PCR 中, 每一步都在最佳条件下进行 cdna 的合成首先在逆转录缓冲液中进行, 然后取出 1/10 的反应产物进行 PCR 在一步法 RT-PCR 中, 逆转录和 PCR 在同时为逆转录和 PCR 优化的条件下, 在一只管中顺次进行这本指南阐述了成功 RT-PCR 和 PCR 的关键高灵敏性 ( 从小量样品中得到足量结果 ) 和高特异性 ( 选择性地仅得到所需的产物 ) 是成功 PCR 的标志可以通过仔细的实验设计 ( 如选择恰当的酶, 设计最理想的引物, 使用不同的缓冲液和添加剂, 确定循环参数及制备高质量的模板等 ) 以获得最佳的 RT-PCR 和 PCR

2 第二章增加 RT-PCR 灵敏度分离高质量 RNA 成功的 cdna 合成来自高质量的 RNA 高质量的 RNA 至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂, 如 EDTA 或 SDS RNA 的质量决定了你能够转录到 cdna 上的序列信息量的最大值一般的 RNA 纯化方法是使用异硫氰酸胍 / 酸性酚的一步法 Trizol 试剂法 ( 见下图 ) 将一步法加以提高, 可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解 RNA Trizol 试剂法可以从最少 100 个细胞或 1mg 组织中提取 RNA TRIzol 试剂步骤略图

总 RNA 和 poly(a)+ RNA 在 RT-PCR 中的比较以 5 或 1μg Hela 细胞总 RNA( 分别为泳道 1 和 2) 或 500ng 和 50ng Hela 细胞 poly(a)+ RNA( 分别为泳道 3 和 4) 使用 oligo(dt) 引物和 SuperScriptⅡ 逆转录酶合成

3 一般不必使用 oligo(dt) 选择性分离 poly(a)+rna 不管起始模板是总 RNA 还是 poly(a)+ RNA, 都可以检测到扩增结果 ( 图 2) 另外, 分离 poly(a)+ RNA 会导致样品间 mrna 丰度的波动变化, 从而使信息的检出和定量产生偏差然而, 当分析稀有 mrna 时,poly(A)+ RNA 会增加检测的灵敏度图 2. 总 RNA 和 poly(a)+ RNA 在 RT-PCR 中的比较以 5 或 1μg Hela 细胞总 RNA( 分别为泳道 1 和 2) 或 500ng 和 50ng Hela 细胞 poly(a)+ RNA( 分别为泳道 3 和 4) 使用 oligo(dt) 引物和 SuperScriptⅡ 逆转录酶合成 cdna 扩增对象为 DNA 聚合酶 εmrna 5' 端 377bp 片段和复制酶 A mrna 的 643bp 片段, 两者都为中等丰度将 1/10 的 cdna 合成反应产物使用 Taq DNA 聚合酶扩增 30 个循环为了防止痕量 RNase 的污染, 从富含 RNase 的样品 ( 如胰脏 ) 中分离到的 RNA 需要贮存在甲醛中以保存高质量的 RNA, 对于长期贮存更是如此从大鼠肝脏中提取的 RNA, 在水中贮存一个星期就基本降解了, 而从大鼠脾脏中提取的 RNA, 在水中保存 3 年仍保持稳定另外, 长度大于 4kb 的转录本对于痕量 RNase 的降

解比小转录本更敏感为了增加贮存 RNA 样品的稳定性, 可以将 RNA 溶解在去离子的甲酰胺中, 存于 -70 用于保存 RNA 的甲酰胺一定不能含有降解 RNA 的杂物来源于胰脏的 RNA 至少可以在甲酰胺中保存一年当准备使用 RNA 时, 可以使用下列方法沉淀 RNA: 加入 NaCl 至 0.

4 解比小转录本更敏感为了增加贮存 RNA 样品的稳定性, 可以将 RNA 溶解在去离子的甲酰胺中, 存于 -70 用于保存 RNA 的甲酰胺一定不能含有降解 RNA 的杂物来源于胰脏的 RNA 至少可以在甲酰胺中保存一年当准备使用 RNA 时, 可以使用下列方法沉淀 RNA: 加入 NaCl 至 0.2M 及 4 倍体积的乙醇, 室温放置 3-5 分钟,10,000 g 离心 5 分钟在逆转录反应中经常加入 RNase 抑制剂以增加 cdna 合成的长度和产量 RNase 抑制剂要在第一链合成反应中, 在缓冲液和还原剂 ( 如 DTT) 存在的条件下加入, 因为 cdna 合成前的过程会使抑制剂变性, 从而释放结合的可以降解 RNA 的 RNase 蛋白 RNase 抑制剂仅防止 RNase A,B,C 对 RNA 的降解, 并不能防止皮肤上的 RNase, 因此尽管使用了这些抑制剂, 也要小心不要从手指上引入 RNase 使用无 RNaseH 活性 (RNaseH-) 的逆转录酶逆转录酶催化 RNA 转化成 cdna 不管是 M-MLV 还是 AMV, 在本身的聚合酶活性之外, 都具有内源 RNaseH 活性 RNaseH 活性同聚合酶活性相互竞争 RNA 模板与 DNA 引物或 cdna 延伸链间形成的杂合链, 并降解 RNA: DNA 复合物中的 RNA 链被 RNaseH 活性所降解的 RNA 模板不能再作为合成 cdna 的有效底物, 降低了 cdna 合成的产量和长度因此消除或大大降低逆转录酶的 RNaseH 活性将会大有裨益 SuperScriptⅡ 逆转录酶,RNaseH- 的 MMLV 逆转录酶及 ThermoScript 逆转录酶,RNaseH- 的 AMV, 比 MMLV 和 AMV 得到更多量和更多全长的 cdna( 图 3) RT-PCR 灵敏度会受 cdna 合成量的影响 ThermoScript 比 AMV 的灵敏性强得多 ( 图 4) RT-PCR 产物的大小受限于逆转录酶合成 cdna 的能力, 尤其是克隆较大的 cdna 时同 MMLV 相比,SuperScripⅡ 显著提高了长 RT-PCR 产物的产量 ( 图 5) RNaseH- 的逆转录酶同时增加了热稳定性, 所以反应可以在高于正常的的温度下进行图 3 逆转录酶对 cdna 第一链产量的影响在建议的合成条件下, 使用 oligo(dt) 引物和 10μCi 的 [α- P]dCTP 第一链的总产量使用 TCA 沉淀法计算全长 cdna 使用在碱性琼脂糖胶上将大小分类的条带切除并计数的方法分析

图 4 逆转录酶对 RT-PCR 灵敏度的影响图 5 逆转录酶对长模板 RT-PCR 灵敏度的影响以 oligo(dt) 为引物, 使用 ThermoScriptⅡ 或 AMV, 在人 tuberous scherosis ⅡmRNA(5.

oligo(dt) 为引物, 由 5μg Hela 细胞总 RNA 合成 cdna 样品使用 RNaseH 处理, 然后使用 ELONGASE?

较高的保温温度有助于 RNA 二级结构的打开, 增加了反应的产量对于多数 RNA 模板, 在没有缓冲液或盐的条件下, 将 RNA 和引物在 65 保温, 然后迅速置于冰上冷却, 可以消除大多数二级结构, 从而使引物可以结合然而某些模板仍然会存在二级结构, 即使热变性后也是如此

5 图 4 逆转录酶对 RT-PCR 灵敏度的影响图 5 逆转录酶对长模板 RT-PCR 灵敏度的影响以 oligo(dt) 为引物, 使用 ThermoScriptⅡ 或 AMV, 在人 tuberous scherosis ⅡmRNA(5.3kb) 和人 DNA 聚 50 下由 Hela 细胞总 RNA 合成 cdna 使用 Platinum 合酶 εmrna 的全长 cdna 的合成由 SuperScriptⅡ 和 Taq DNA 聚合酶和人 DNA 聚合酶 ε 引物进行 35 个循环 MMLV 催化利用 oligo(dt) 为引物, 由 5μg Hela 细胞总 RNA 合成 cdna 样品使用 RNaseH 处理, 然后使用 ELONGASE? Enzyme Mix 将 1/10 的 cdna 合成反应产物扩增 35 个循环 RNaseH 产生的障碍 RNaseH 对第一链 cdna 的影响 RNaseH 在 cdna 合成期间降解 RNA:DNA 复合体中的 RNA 红色箭头代表潜在的酶切位点提高逆转录保温温度较高的保温温度有助于 RNA 二级结构的打开, 增加了反应的产量对于多数 RNA 模板, 在没有缓冲液或盐的条件下, 将 RNA 和引物在 65 保温, 然后迅速置于冰上冷却, 可以消除大多数二级结构, 从而使引物可以结合然而某些模板仍然会存在二级结构, 即使热变性后也是如此对这些困难模板的扩增可以使用 ThermoScript 逆转录酶, 并将逆转录反应置于较高温度下进行以改善扩增 ( 图 6) 较高的保温温度也可以增加特异性, 尤其是当使用基因特异性引物 (GSP) 进行 cdna 合成时 ( 见第三章 ) 如果使用 GSP, 确保引物的 Tm 值与预计的保温温度相同不要在高于 60 时使用 oligo(dt) 和随机引物随机引物需要在增加到 60 前在 25 保温 10 分钟除了使用较高的逆转录温度外, 还可以通过直接将 RNA/ 引物混合物从 65

变性温度转到逆转录保温温度, 并加入预热的 2 的反应混合物提高特异性 (cdna 热启动合成 ) 这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对使用 PCR 仪可以简化 RT-PCR 所需的多种温度切换图 6 温度对不同模板的影响使用 ThermoScript 或 AMV, 以 18S rrna 基因特异性引物, 由 10ng 大豆总 RNA 在所示温度合成 cdna 将 1/10 的

6 变性温度转到逆转录保温温度, 并加入预热的 2 的反应混合物提高特异性 (cdna 热启动合成 ) 这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对使用 PCR 仪可以简化 RT-PCR 所需的多种温度切换图 6 温度对不同模板的影响使用 ThermoScript 或 AMV, 以 18S rrna 基因特异性引物, 由 10ng 大豆总 RNA 在所示温度合成 cdna 将 1/10 的 cdna 反应产物使用高保真 Platinum Taq DNA 聚合酶进行 40 个 PCR 反应循环表 2. 逆转录保温温度 Reverse Transcriptase Incubation Temperature AMV 37 C-45 C M-MLV 37 C SuperScript II RT 37 C-50 C ThermoScript RT 42 C-65 C RNA 在高于 65 时开始水解, 对于 1kb 的 RNA 第一链合成温度可以为 70, 对于 >1kb 的 RNA 则需要 <65 Tth 热稳定聚合酶在 Mg 存在条件下作为 DNA 聚合酶, 在 Mn 存在条件下作为 RNA 聚合酶它可以在最高 65 条件下保温然而,PCR 过程中 Mn 的存在会降低忠实性, 这使得 Tth 聚合酶不太适合用于高精确度的扩增, 如 cdna 的克隆另外,Tth 的逆转录效率较低, 这会降低灵敏度, 而且, 既然单个酶就可以进行逆转录和 PCR, 那么没有逆转录的对照反应就不能用来将 cdna 的扩增产物同污染的基因组 DNA 的扩增产物区分开来促进逆转录的添加剂包括甘油和 DMSO 在内的添加剂加到第一链合成反应中, 可以减低核酸双链的稳定并解开 RNA 二级结构, 最多可以加入 20% 的甘油或 10% 的 DMSO 而不影响 SuperScriptⅡ 或 MMLV 的活性 AMV 也可以耐受最多 20% 的甘油而不降低活性为了在 SuperScriptⅡ 逆转录反应中最大限度提高 RT-PCR 的灵敏度, 可以加入 10 % 的甘油并在 45 保温如果 1/10 的逆转录反应产物加入到 PCR 中, 那甘油在扩增反应中的浓度为 0.4 %, 这不足以抑制 PCR

RNaseH 处理在 PCR 之前使用 RNaseH 处理 cdna 合成反应可以提高灵敏度对于某些模板, 据认为 cdna 合成反应中的 RNA 会阻止扩增产物的结合, 在这种情况下,RNaseH 处理可以增加灵敏度一般当扩增较长的全长 cdna 目标模板时,RNaseH 处理是必需的, 比如低拷贝的 tuberous scherosisⅡ( 图 7) 对这种困难模板,RNaseH

tuberous sclerosisⅡmrna (5.3kb) 的全长 cdna, 反应产物的一半使用 RnasH 处理 30 分钟, 使用 ELONGASE Enzyme Mix 对相当于起始 RNA 0.

7 RNaseH 处理在 PCR 之前使用 RNaseH 处理 cdna 合成反应可以提高灵敏度对于某些模板, 据认为 cdna 合成反应中的 RNA 会阻止扩增产物的结合, 在这种情况下,RNaseH 处理可以增加灵敏度一般当扩增较长的全长 cdna 目标模板时,RNaseH 处理是必需的, 比如低拷贝的 tuberous scherosisⅡ( 图 7) 对这种困难模板,RNaseH 的处理加强了 SuperScriptⅡ 或 AMV 合成的 cdna 所产生的信号对于多数 RT-PCR 反应,RNaseH 处理是可选的, 因为 95 保温的 PCR 变性步骤一般会将 RNA:DNA 复合物中的 RNA 水解掉图 7 RNaseH 处理对 RT-PCR 的影响使用 SuperScriptⅡ(S) M-MLV(M) 或 AMV(A), 由 5μg Hela RNA 合成人 tuberous sclerosisⅡmrna (5.3kb) 的全长 cdna, 反应产物的一半使用 RnasH 处理 30 分钟, 使用 ELONGASE Enzyme Mix 对相当于起始 RNA 0.5% 的经处理及未处理逆转录产物进行 35 个循环的扩增小量 RNA 检测方法的提高当仅有小量 RNA 时,RT-PCR 尤其具有挑战性在 RNA 分离过程中加入的作为载体的糖元有助于增加小量样品的产量可以在加入 Trizol 的同时加入无 RNase 的糖元糖元是水溶性的, 可以同 RNA 保持在水相中以辅助随后的沉淀对于小于 50mg 的组织或 106 个培养细胞的样品, 无 RNase 糖元的建议浓度为 250μg/ml 在使用 SuperScriptⅡ 的逆转录反应中加入乙酰化 BSA 可以增加灵敏度 ( 图 8), 而且对于小量 RNA, 减少 SuperScriptⅡ 的量并加入 40 单位的 RnaseOut 核酸酶抑制剂可以提高检测的水平如果在 RNA 分离过程中使用了糖元, 仍然建议在使用 SuperScriptⅡ 进行逆转录反应时加入 BSA 或 RNase 抑制剂图 9 一步法 RT-PCR 的灵敏度使用 SuperScriptⅡOne-Step RT-PCR System 从 0,0.1,1,10,102,103pg Hela 总 RNA( 分别为泳道 1-6) 扩增 β-actin 片段反应在 50 保温 30 分钟 ;94 2 分钟 ; 然后秒,55 30 秒,68 90 秒进行 40 个循环 ; 随后在 68 保温 5 分钟反应中包含 200 nm 正义和反义引物

一步法同两步法 RT-PCR 的比较两步法 RT-PCR 比较常见, 在使用一个样品检测多个 mrna 时比较有用然而一步法 RT-PCR 具有其他优点 ( 表 3) 一步法 RT-PCR 在处理大量样品时易于操作, 有助于减少残余污染, 因为在 cdna 合成和扩增之间不需要打开管盖一步法可以得到更高的灵敏度, 最低可以达到 0.

8 一步法同两步法 RT-PCR 的比较两步法 RT-PCR 比较常见, 在使用一个样品检测多个 mrna 时比较有用然而一步法 RT-PCR 具有其他优点 ( 表 3) 一步法 RT-PCR 在处理大量样品时易于操作, 有助于减少残余污染, 因为在 cdna 合成和扩增之间不需要打开管盖一步法可以得到更高的灵敏度, 最低可以达到 0.1pg 总 RNA, 这是因为整个 cdna 样品都被扩增 ( 图 9) 对于成功的一步法 RT-PCR, 一般使用反义的基因特异性引物起始 cdna 合成表 3. 一步法和两步法 RT-PCR 的比较两步法步骤起始第一链 cdna 合成使用 : Oligo(dT) 随机六聚体 GSP 引物优点灵活引物选择扩增酶的选择困难 RT-PCR 的优化能力同 Platinum 酶结合提高特异性同 Platinum Pfx Taq DNA 聚合酶结合提高忠实性适用于在单个样品中检测几个 mrna 关于扩增酶和产物大小应注意 : 对于小于 4kb 的产物使用 Taq DNA 聚合酶或 Platinum Taq DNA 聚合酶一步法步骤起始第一链合成使用 GSP 引物优点方便扩增酶同逆转录酶预先混合转管步骤少, 减少污染可能性高灵敏度适用于大量样品分析适用于定量 PCR 对于小于 12kb 的产物使用 Platinum Pfx Taq DNA 聚合酶或 Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity 对于大于 12kb 的产物使用 ELONGAE Enzyme Mix 对于一步法 RT-PCR, 如果产物小于 3.5kb, 使用 Taq DNA 聚合酶或 Platinum Taq DNA 聚合酶 ; 如果产物小于 9kb, 使用 Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity 图 9 一步法 RT-PCR 的灵敏度使用 SuperScriptⅡOne-Step RT-PCR System 从 0,0.1,1,10,102,103pg Hela 总 RNA( 分别为泳道 1-6) 扩增 β-actin 片段反应在 50 保温 30 分钟 ;94 2 分钟 ; 然后秒,55 30 秒,68 90 秒进行 40 个循环 ; 随后在 68 保温 5 分钟反应中包含 200 nm 正义和反义引物

9 第三章增加 RT-PCR 特异性起始 cdna 合成第一链 cdna 合成的起始可以使用三种不同的方法, 各种方法的相对特异性影响了所合成 cdna 的量和种类随机引物法是三种方法中特异性最低的引物在整个转录本的多个位点退火, 产生短的, 部分长度的 cdna 这种方法经常用于获取 5' 末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的 RNA 模板获得 cdna 为了获得最长的 cdna, 需要按经验确定每个 RNA 样品中引物与 RNA 的比例随机引物的起始浓度范围为 50 到 250ng 每 20μl 反应体系因为使用随机引物从总 RNA 合成的 cdna 主要是核糖体 RNA, 所以模板一般选用 poly(a)+rna Oligo(dT) 起始比随机引物特异性高它同大多数真核细胞 mrna 3' 端所发现的 poly(a) 尾杂交因为 poly(a)+rna 大概占总 RNA 的 1% 到 2%, 所以与使用随机引物相比,cDNA 的数量和复杂度要少得多因为其较高的特异性,oligo(dT) 一般不需要对 RNA 和引物的比例及 poly(a)+ 选择进行优化建议每 20μl 反应体系使用 0.5μg oligo(dt) oligo(dt)12-18 适用于多数 RT-PCR ThermoScript RT-PCR System 提供了 oligo(dt)20, 因为其热稳定性较好, 适用于较高的保温温度基因特异性引物 (GSP) 对于逆转录步骤是特异性最好的引物 GSP 是反义寡聚核苷, 可以特异性地同 RNA 目的序列杂交, 而不象随机引物或 oligo(dt) 那样同所有 RNA 退火用于设计 PCR 引物的规则同样适用于逆转录反应 GSP 的设计 ( 见第五章 ) GSP 可以同与 mrna3' 最末端退火的扩增引物序列相同, 或 GSP 可以设计为与反向扩增引物的下游退火对于部分扩增对象, 为了成功进行 RT-PCR, 需要设计多于一个反义引物, 因为目的 RNA 的二级结构可能会阻止引物结合建议在 20μl 的第一链合成反应体系中使用 1pmol 反义 GSP 提高逆转录保温温度为了充分利用 GSP 特异性的全部优点, 应该使用有较高热稳定性的逆转录酶热稳定逆转录酶可以在较高温度保温以增加反应严谨性比如, 如果一个 GSP 退火温度为 55, 那么如果使用 AMV 或 M-MLV 在低严谨性的 37 进行逆转录,GSP 所带有的特异性就没有完全利用然而 SuperScripⅡ 和 ThermoScript 可以在 50 或更高进行反应,( 表 2) 这就会消除较低温度时产生的非特异性产物 ( 图 10) 为获得最大的特异性, 可以将 RNA/ 引物混合物直接从 65 变性温度转移到逆转录保温温度, 并加入预热的 2 反应混合液 (cdna 合成热启动 ) 这有助于防止低温时分子间碱基配对使用 PCR 仪可以简化 RT-PCR 所需的多种温度转换

图 10. 逆转录温度对 RT-PCR 特异性的影响使用 ThermoScript 和设计用来同人 DNA 聚合酶 εmrna 退火的 GSP, 由 1μg Hela RNA 合成 cdna Thermoscript 加入到预热的反应混合液中, 使用 Platinum Taq DNA 聚合酶对 1/10 的 cdna 进行 35 个循环的 PCR 减少基因组 DNA 污染 RT-PCR

10 图 10. 逆转录温度对 RT-PCR 特异性的影响使用 ThermoScript 和设计用来同人 DNA 聚合酶 εmrna 退火的 GSP, 由 1μg Hela RNA 合成 cdna Thermoscript 加入到预热的反应混合液中, 使用 Platinum Taq DNA 聚合酶对 1/10 的 cdna 进行 35 个循环的 PCR 减少基因组 DNA 污染 RT-PCR 所遇到的一个潜在的困难是 RNA 中沾染的基因组 DNA 使用较好的 RNA 分离方法, 如 Trizol Reagent, 会减少 RNA 制备物中沾染的基因组 DNA 为了避免产生于基因组 DNA 的产物, 可以在逆转录之前使用扩增级的 DNaseⅠ 对 RNA 进行处理以除去沾染的 DNA 将样品在 2.0mM EDTA 中 65 保温 10 分钟以终止 DNase Ⅰ 消化 EDTA 可以螯合镁离子, 防止高温时所发生的依赖于镁离子的 RNA 水解为了将扩增的 cdna 同沾染的基因组 DNA 扩增产物分开, 可以设计分别同分开的外显子退火的引物来源于 cdna 的 PCR 产物会比来源于沾染的基因组 DNA 的产物短另外对每个 RNA 模板进行一个无逆转录的对照实验, 以确定一个给定片段是来自基因组 DNA 还是 cdna 在无逆转录时所得到的 PCR 产物来源于基因组第四章 RT-PCR 应用 5' 和 3' RACE RACE(cDNA 末端快速扩增,Rapid Ampliphication of cdna Ends) 是一种获得转录本 5' 或 3' 未知序列的方法不象普通 RT-PCR 那样使用两个序列特异性的引物,RACE 使用一个序列特异性的引物和或者 mrna 的 poly(a) 尾 (3' RACE) 或者加到 cdna 末端的多聚同聚体 (5' RACE)( 图 11) RACE 已经被用于扩增和克隆稀有 mrna RACE 的产物可以用来克隆, 直接测序, 制备探针或连接在一起得到全长 cdna 其中一个连接 5' 和 3' RACE 产物的方法是使用由 5' 及 3' RACE 得到的序列信息设计新的引物, 以扩增全长的 cdna

使用 RNaseH- 的逆转录酶和高保真的热稳定聚合酶可以对较长的序列进行高保真的扩增, 从而得到全长 cdna 克隆 5' RACE 步骤概要第一链引物,GSP1, 同 mrna 退火使用 SuperScriptⅡ 将 mrna 转录成 cdna 使用 RNase 混合物降解 RNA 使用 GlassMAX Spin Cartridge 纯化 cdna 使用 dctp 和 TdT 对纯化的

11 使用 RNaseH- 的逆转录酶和高保真的热稳定聚合酶可以对较长的序列进行高保真的扩增, 从而得到全长 cdna 克隆 5' RACE 步骤概要第一链引物,GSP1, 同 mrna 退火使用 SuperScriptⅡ 将 mrna 转录成 cdna 使用 RNase 混合物降解 RNA 使用 GlassMAX Spin Cartridge 纯化 cdna 使用 dctp 和 TdT 对纯化的 cdna 加尾使用简并的锚定引物和巢式 GSP2 PCR 扩增带有 dc 尾的 cdna 使用 AUAP,UAP 和巢式 GSP 重新扩增初步 PCR 产物图 11. 5' RACE 步骤概要 5' RACE 比 RT-PCR 更具有挑战性, 特异性也较低, 因为只有一个引物是基因特异性的 5' RACE 的产物可能是单一产物多个产物, 甚至是不能分辨的连续条带结果的质量取决于用来合成第一链和扩增的 GSP 的特异性扩增所使用锚定引物的特异性目的 mrna 的复杂度和丰度及产物的长度使用巢式引物扩增 ( 最多可以三轮巢式扩增 ), 并在连续几轮扩增中使用长度选择性的扩增产物作为模板可以增加 5' RACE 的特异性 ( 见第五章, 巢式 PCR) 增加逆转录保温温度和 PCR 退火温度, 并降低扩增反应中的镁离子浓度可以促进特异性 5' RACE 的灵敏度受所使用的逆转录酶和 cdna 3' 末端抑制 cdna 加尾 (tailing) 的二级结构影响 cdna 的不完全合成降低了全长产物的产量, 并导致某些模板产生连续条带因为 SuperScriptⅡ 产生更多的全长 cdna, 所以可以提高 5' 末端序列检测的水平, 尤其是对于小于 1kb 的转录本双链 3' 末端和发卡结构会通过减少用于加尾的 3' 羟基而破坏 cdna 的加尾 cdna 的起始保温温度在 94 并随后在冰上冷却有助于破坏二级结构一些困难模板可能需要加入 DMSO 辅助加尾 ( 图 12) 加尾酶末端脱氧核苷转移酶可以耐受最多 20% 的 DMSO 图 12. 5'RACE

12 在 45 使用 SuperScriptⅡ 从 5μg Hela 总 RNA 合成 cdna 10μl 纯化的 cdna 在 10%DMSO 中加尾使用人 tuberous scleosis 的引物和 ELONGASE Enzyme Mix( 初步 PCR 2.8kb; 泳道 1) 对 1μl 加尾反应产物直接扩增 40 个循环在 2.8kb 条带周边移取 10μl 的凝胶使用 1μl 限定大小的 PCR 产物进行巢式 PCR( 巢式 PCR 2.7kb; 泳道 2) 凝胶使用 SYBR Green Ⅰ 染色巢式 PCR 后如果看不到产物或仅观察到连续条带, 可以使用 Southern 印迹检测产物这需要了解序列内部信息以制备探针仅扩增全长 cdna 末端的高级 RACE 方法为了获得全长的 cdna 5' 及 3' 末端序列, 许多研究人员使用称之为 cdna 末端快速扩增, 或 RACE 的方法传统的 RACE 方法得到的 PCR 产物含有全长及断裂的 cdna 产物 GeneRacerTM 试剂盒确保只得到含有全长 cdna 末端的完整序列, 使您得到更高效的结果并节省时间 GeneRacer 的优点确定一个基因的全长序列对于研究异源转录起始和得到用于蛋白表达的开放阅读框至关重要 GeneRacer 是一种高级 RACE 技术, 提高了扩增全长 cdna 末端序列的效率使用 GeneRacerTM 试剂盒, 可以得到完整序列克隆基因片段的全长 5' 和 3' 末端以构建完整的 cdna 序列灵敏得到每个细胞中拷贝数低至 30 的稀有转录本的全长 5' 和 3' 末端长度可以由转录本得到长度至少为 9kb 的 cdna 仅通过一轮 PCR 反应就可以得到这些结果一般不需进行巢式 PCR 全长 5' 末端选择

传统的 RACE 会得到多个 PCR 结果, 因为其所使用的 cdna 来源于断裂及全长 mrna 研究人员必须鉴定每一个 PCR 产物以获得带有全长 5 末端序列的产物 GeneRacer 只针对全长的 5 加帽 mrna, 从而节省了花费在筛选大量 PCR 产物上的时间图 13 示意 GeneRacerTM 的工作原理 RNA 样品经 CIP 和 TAP 处理, 保证 GeneRacer

13 传统的 RACE 会得到多个 PCR 结果, 因为其所使用的 cdna 来源于断裂及全长 mrna 研究人员必须鉴定每一个 PCR 产物以获得带有全长 5 末端序列的产物 GeneRacer 只针对全长的 5 加帽 mrna, 从而节省了花费在筛选大量 PCR 产物上的时间图 13 示意 GeneRacerTM 的工作原理 RNA 样品经 CIP 和 TAP 处理, 保证 GeneRacer 寡聚 RNA 仅同全长转录本连接然后使用 SuperScriptⅡ 逆转录酶对这些转录本逆转录, 得到的 cdna 做为 PCR 的模板 GeneRacer 寡聚 RNA 序列做为 GeneRacerTM 5 引物结合位点, 这样, 只有具有全长 5 末端的 cdna 才会被扩增使用 GeneRacer 步骤及高保真度 Platinum Taq DNA 聚合酶, 就可以确保得到最高效的实验结果图 13 GeneRacer 步骤

图 14 稀有转录本和长转录本的扩增结果 3.5mg Hela 总 RNA 经 GeneRacer 步骤处理, 利用 GeneRacer 的 Oligo dt 引物和 SuperScriptⅡ 得到 cdna, 然后使用 GeneRacerTM 5 引物和基因特异性的引物 PCR 扩增基因经过 30-35 个循环的一轮 PCR 扩增 50ml PCR 扩增产物中的 15ml 在 1.

14 图 14 稀有转录本和长转录本的扩增结果 3.5mg Hela 总 RNA 经 GeneRacer 步骤处理, 利用 GeneRacer 的 Oligo dt 引物和 SuperScriptⅡ 得到 cdna, 然后使用 GeneRacerTM 5 引物和基因特异性的引物 PCR 扩增基因经过个循环的一轮 PCR 扩增 50ml PCR 扩增产物中的 15ml 在 1.2%E-Gel 琼脂糖凝胶电泳检测, 在紫外光下观察泳道 1: HPRT( 次黄嘌呤磷酸核糖转移酶 ),1.3kb,30 拷贝 / 细胞泳道 2:SMAP( 胸腺激素受体共激活蛋白 ),3.1kb 泳道 3:Cleavage and polyadenylation specificity factor,4.5kb 泳道 4:TFRC( 转铁蛋白受体 ),5.0kb 泳道 5:IGFⅡR( 类胰岛素生长因子 Ⅱ 受体 ),9kb,5 末端 GC 含量 90% 敏感性和扩增长度为了说明 GeneRacer 试剂盒获取全长 5 末端的能力, 我们扩增了带有已知转录起始位点的基因的 5 末端使用总 RNA, 遵循 GeneRacer 步骤, 我们扩增了一个长转录本 (9kb) 和一个浓度为 0.01%, 即 30 拷贝 / 细胞的稀有 mrna 长度超过 GenBank 序列除了可以获得已知转录起始位点基因的全长 5 末端,GeneRacer 还可以获得未知转录起始位点基因的 5 末端将 GeneRacer 所得到的序列同 GenBank 列出的 mrna 序列相比较,GenBank 的序列一般来源于使用传统方法构建的文库中的 cdna, 这导致末端核苷酸的缺失从表 4 可以明显看出, 使用 GeneRacer 得到的 5 cdna 末端要比 GenBank 中列出的序列长 16 到 116 碱基 Gene GeneRacer GenBank Size(kb) Sequence Beyond Number(mRNA) GenBank Heterogeneous nuclear ribonuclear protein complex K protein(hnrnp K) S Subunit for coatomer complex X Muscle phosphofructokinase(pfkm) M ADP-ribosylation factor 4(ARF4) M Isoleucil-tRNA synthetase U Putative tumor suppressor(luca 15) U Thyroid hormone receptor coactivating NM_

15 protein(smap) Cleavage and polyadenylation specificity factor U Human insulin-like growth factor 2 receptor NM 表 4 说明列出的基因使用 GeneRacer 步骤扩增 PCR 产物使用 S.N.A.P. 凝胶回收柱回收并克隆至 pcr 4-TOPO 载体 (Invitrogen) 对每一个基因都随机挑选了 12 个克隆并测序序列同 GenBank 数据库中的序列相比较, 确定 5 末端超出的序列使用每个基因所获得的最长序列比较统计超出 GenBank 序列第一个碱基的超出碱基的数目获得全长的 cdna 序列 GeneRacer 试剂盒确保您成功获得 mrna 转录本的全长 5 和 3 序列每个 GeneRacer 试剂盒中包含 CIP TAP RNA 连接酶 SuperScriptⅡ 逆转录酶等酶类及其缓冲液,GeneRacer 寡聚 RNA,GeneRacer Oligo dt 引物,GeneRacer PCR 引物及 RNase 抑制剂同时试剂盒中还包括 S.N.A.P. 凝胶纯化柱以纯化 PCR 产物, 还有 TOPO Cloning 试剂盒以进行下游测序使用 GeneRacerTM 试剂盒, 您可以高效地得到全长的 cdna 5 和 3 末端序列, 而不必浪费时间筛选部分缺失或断裂的序列 mrna 表达定量 mrna 表达定量是一种挑战性的 RT-PCR, 但是提供了超越传统 RNA 分析方法的优点 RT-PCR 比 Northern 印迹或核酸酶保护分析更灵敏, 需要的 RNA 量及序列信息较少但是 RT-PCR 涉及两个酶反应, 这会导致 RT-PCR 产物量的波动 RNA 转化成 cdna 的量会影响产量, 但定量 PCR 的主要困难是 PCR 的指数增长的特点, 样品间很小的差异会被转化成产物产量间很大的差异两个常用的 mrna 丰度定量方法是竞争性定量 PCR 和实时 PCR 在竞争性 PCR 中, 逆转录之前加入一个外源的 RNA 转录本 ( 内部标准 RNA) 作为样品间差异的对照内部标准 RNA 被逆转录并同目的模板一起扩增, 作为 cdna 转化和扩增效率差异的对照通过将特异性的目的序列同已知浓度的内部标准 RNA 一起扩增进行定量通过比较由内部标准获得的信号和目的模板所获得的信号可以确定目的模板的丰度内部标准 RNA 同目的模板有同样的引物识别位点有几种现行的方法可以得到内部标准最简单的方法是使用 PCR 在非特异性的 spacerdna 上建立引物识别位点产物可以克隆至带有 T7 或 SP6 RNA 聚合酶启动子的载体上, 或者将 RNA 启动子序列加到正向引物, 从而可以通过 PCR 构建序列然后可以通过体外转录得到 RNA 标准竞争性定量 PCR 可以使用 GSP 在一步法 RT-PCR 中进行, 或使用 GSP 或 oligo(dt) 在两步法 RT-PCR 中进行可以向反向引物中加入 poly(dt) 序列得到 oligo(dt) 序列竞争性 RT-PCR 是一种终点分析法, 需要目的模板和内部标准的扩增效率相同需要预先了解起始目的模板的部分信息以建立内部标准的浓度范围为了精确定量, 需要进行内部标准比目的模板多及少的反应

实时 RT-PCR 是非竞争性的, 在产物形成的同时就进行了检测几种探针可以用于产物量的分析, 如荧光标记的 5' 核酸酶探针和 Molecular Beacon 第一种方法基于 Taq DNA 聚合酶的 5' 核酸酶活性, 其可以切除延伸过程中在分支点的杂交探针分析使用两种荧光标记的探针, 一种染料作为报告基团, 另外一种在探针被切除时淬灭信号 Molecular Beacon 包含一个

PCR 的每个循环实时检测荧光发出的荧光的量同 PCR 产物的量成正比当释放的荧光的量超出了一个制定的荧光基线, 这个循环称为阈循环或 CT CT 同起始目的模板的量成反比因此, 高拷贝数的样品会有一个低的 CT 值, 而低拷贝数对应高 CT 值 ( 图 15) 图 15.

16 实时 RT-PCR 是非竞争性的, 在产物形成的同时就进行了检测几种探针可以用于产物量的分析, 如荧光标记的 5' 核酸酶探针和 Molecular Beacon 第一种方法基于 Taq DNA 聚合酶的 5' 核酸酶活性, 其可以切除延伸过程中在分支点的杂交探针分析使用两种荧光标记的探针, 一种染料作为报告基团, 另外一种在探针被切除时淬灭信号 Molecular Beacon 包含一个 5' flurophore 和 3' quencher 这些探针设计有一个带有荧光的发卡结构和紧邻的 quencher 以淬灭荧光主干结构包括 5 到 7 个核苷且富含 GC 外层环状结构包含 15 到 30 个核苷且同把序列互补当存在靶序列时,molecular beacon 同靶序列结合, 发卡结构松散开, 从而产生荧光对于两种探针, 使用与光激发检测装置耦联的 PCR 仪, 在 PCR 的每个循环实时检测荧光发出的荧光的量同 PCR 产物的量成正比当释放的荧光的量超出了一个制定的荧光基线, 这个循环称为阈循环或 CT CT 同起始目的模板的量成反比因此, 高拷贝数的样品会有一个低的 CT 值, 而低拷贝数对应高 CT 值 ( 图 15) 图 15. 眼癌 mrna 的实时 PCR 定量使用 Platinum Quantitative RT-PCR ThermoScript One-Step System( 在 60 进行 cdna 合成 ) 对 Hela 总 RNA 的相同两份样品进行 PCR 在 ABI Prism 7700 上使用 FAM 标记的 Molecular Beacon 探针 (400nM) 进行检测 A 组. PCR 期间两份样品的相对荧光密度 B 组. 标准曲线为了对 mrna 进行绝对定量, 可以使用体外转录 RNA 得到标准曲线通过不同浓度的体外转录 RNA 可以确定 CT 值然后 CT 值可以同 RNA 浓度作图得到标准曲线, 以定量未知样品的表达水平 ( 图 15,B 组 ) 实时 RT-PCR 提供了超越竞争性 RT-PCR 的优点通过对大范围目的模板浓度进行线性剂量响应 ( 图 15), 荧光监测高度灵敏, 高度精确样品不需要进行扩增后分析, 仅需要预先知道很少的目的模板的丰度信息可以使用两步法 RT-PCR 对一个 RNA 样品中的多个 mrna 定量, 在处理大量样品时, 为了方便, 可以使用一步法脱颖而出的定量 RT-PCR Platinum Quantitative RT-PCR ThermoScript One-Step 系统整合了最好的逆转录和 PCR 技术, 提供了全方位的高品质其产量特异性和灵敏度都卓尔不群您会得到 mrna 最精确的实时定量

17 如您所需怎样做才能得到最好的定量 RT-PCR(qRT-PCR) 结果? 把实时定量的逆转录和 PCR 的领先技术结合在一起就可以了使用了 Platinum Quantitative RT-PCR ThermoScript One-Step 系统, 您就拥有了两种高品质的酶,ThermoScript 逆转录酶和 Platinum Taq DNA 聚合酶, 以预先混合的方式, 为精确可靠的扩增反应而优化高效的 cdna 合成 ThermoScript 逆转录酶, 一种克隆的鸟类 RNase H- 逆转录酶, 通过基因工程处理, 可以在最高 65 进行高特异性的 cdna 合成, 其最适温度为 50 因为降低了 RNase H 活性,ThermoScript 逆转录酶增加了全长 cdna 的产量因为其较高的热稳定性, 可以克服高 GC 含量和 RNA 二级结构的障碍, 在较高温度下进行高效的 cdna 合成 ( 图 16) 图 16 带有延伸二级结构的富 GC RNA 的 RT-PCR 得到高产量使用 ThermoScript 逆转录酶或 AMV 逆转录酶, 根据生产厂商的建议, 由 10 ng 总 RNA 合成 cdna 将反应产物的 1/10 使用高保真 Platinum Taq DNA 聚合酶扩增圈出的带 (414bp) 表示核糖体大亚基 RNA 5' 端 (84% GC) 含量的扩增高产量和特异性在 ThermoScript 逆转录酶后, 您会用到 Platinum Taq DNA 聚合酶, 其在 PCR 一步中提供了抗体介导的自动热启动功能 ( 图 17) 这项技术明显减少了错误配对和非特异性扩增, 在高特异性的同时提供了高产量 cdna 合成和扩增的优异结果一起成为成功 qrt-pcr 的基础

18 图 17 室温条件下 DNA 聚合酶活性的完全抑制对 Taq DNA 聚合酶和 Platinum Taq DNA 聚合酶的活性分析在 37 进行 5 个小时一步得到高灵敏度 Platinum Quantitative RT-PCR ThermoScript One-Step 系统提供的步骤可以高灵敏度地检测起始物质仅需在反应混合物中加入总 RNA 或 poly(a)+, 基因特异性逆转录和扩增引物及荧光探针, 然后就可以开始实验了您可以精确定量到最低 10 个目的 RNA 分子或从 1pg 总 RNA( 图 18) 除了高特异性外, 一步法步骤减少了反应变量, 降低了污染可能性, 适合高通量应用图 18 一步法 RT-PCR β-actin mrna 的定量使用 Platinum Quantitative RT-PCR ThermoScript One-Step 系统扩增六份不同量的 Hela 总 RNA, 然后在 ABI PRISM 7700 上, 使用 6-FAM 标记的 TaqMan 探针检测使用了 TAMRA 做为报告信号 (Rn) 均一化的被动参考超越竞争对手总而言之, 领先的逆转录和 PCR 技术同一步法整合在一起会尽您所需, 产量特异性和灵敏度, 得到高水平的 qrt-pcr 图 19 将使用 Platinum Quantitative RT-PCR ThermoScript One-Step 系统与使用竞争者系统得到的结果做了比较 Platinum 系统表现出更低的 Ct( 阈循环 ) 和更高的产量, 使其对于检测低拷贝的 mrna 转录本更敏感图 19 使用 Platinum Quantitative RT-PCR ThermoScript One-Step 系统获得高产量使用 Platinum Quantitative RT-PCR ThermoScript One-Step 系统 ( 蓝点 ) 或竞争对手 P 的 Quantitative One-Step RT-PCR 系统 ( 红点 ), 按生产厂商的建议, 对 145bp 的 β-actin 片段进行 qrt-pcr 分析起始 RNA 从 5μg 到 50fg 按 10 倍递增变化使用 TAMRA 做为被动参考收集均一化的相对荧光 (Rn) 图版 A: 线性量扩增图图版 B: 标准曲线图获得一步法的成功 Platinum Quantitative RT-PCR ThermoScript One-Step 系统提供了实时定量中领先的逆转录和 PCR 技术

2004级研究生现代免疫学实验技术结业报告

2004级研究生现代免疫学实验技术结业报告 PCR PCR PCR RT-PCR PCR (Polymerase Chain Reaction,PCR) 80 DNA, DNA PCR PCR PCR DNA PCR -- -- DNA DNA 93 DNA PCR DNA DNA ( ) DNA 55 DNA DNA -- TaqDNA dntp DNA -- -- PCR PCR DNA DNA Y (1 X) n Y DNA X (Y)