2015-02-25 DOI: 10.3724/SP.J.1145.2014.08019 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol 2015,21 ( 1 ) : 1-9 产甲烷生化代谢途径研究进展 * 方晓瑜 1, 2, 3 李家宝 4, 5 芮俊鹏 4, 5 李香真 1, 2** 1 中国科学院环境与应用微生物重点实验室 ( 成都生物所 ) 成都 610041 2 中国科学院成都生物研究所环境微生物四川省重点实验室成都 610041 3 中国科学院大学北京 100049 4 中国科学院山地生态恢复与生物资源利用重点实验室 ( 成都生物所 ) 成都 610041 5 中国科学院成都生物研究所生态系统恢复与生物多样性保育四川省重点实验室成都 610041 摘要微生物产甲烷过程产生的甲烷约占全球甲烷产量的 74%. 产甲烷过程对生物燃气生产和全球气候变暖等都有着重要的意义. 本文综述了产甲烷菌的具体生化代谢途径, 其本质是产甲烷菌利用细胞内一系列特殊的酶和辅酶将 CO 2 或甲基化合物中的甲基通过一系列的生物化学反应还原成甲烷. 在这一过程中, 产甲烷菌细胞能够形成钠离子或质子跨膜梯度, 驱动细胞膜上的 ATP 合成酶将 ADP 转化成 ATP 以获得能量. 根据底物类型的不同, 可以将该过程分为 3 类 : 还原 CO 2 途径 乙酸途径和甲基营养途径. 还原 CO 2 途径是以 H 2 或甲酸作为主要的电子供体还原 CO 2 产生甲烷, 其中涉及到一个最新的发现 电子歧化途径 ; 乙酸途径是乙酸被裂解产生甲基基团和羧基基团, 随后, 羧基基团被氧化产生电子供体 H 2 用于还原甲基基团 ; 甲基营养途径是以简单甲基化合物作为底物, 以外界提供的 H 2 或氧化甲基化合物自身产生的还原当量作为电子供体还原甲基化合物中的甲基基团. 通过这 3 种途径产甲烷的过程中, 每消耗 1mol 底物所产生 ATP 的顺序为还原 CO 2 途径 > 甲基营养途径 > 乙酸途径. 由于产甲烷菌自身难以分离培养, 未来将主要通过现代的生物技术和计算机技术, 包括基因工程和代谢模型构建等最新技术来研究产甲烷菌的生化代谢过程以及其与其它菌群之间的相互作用机制, 以便将其应用于生产实践. 图 3 表 1 参 86 关键词产甲烷菌 ; 生化代谢 ; 还原 CO 2 途径 ; 乙酸途径 ; 甲基营养途径 CLC Q939.9 Research progress in biochemical pathways of methanogenesis* FANG Xiaoyu 1, 2, 3, LI Jiabao 4, 5, RUI Junpeng 4, 5 1, 2** & LI Xiangzhen 1 Key Laboratory of Environmental and Applied Microbiology, Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences, Chengdu 610041, China 2 Environmental Microbiology Key Laboratory of Sichuan Province, Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences, Chengdu 610041, China 3 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China 4 Key Laboratory of Mountain Ecological Restoration and Bioresource Utilization, Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences, Chengdu 610041, China 5 Ecological Restoration Biodiversity Conservation Key Laboratory of Sichuan Province, Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences, Chengdu 610041, China Abstract Microbial methanogenesis accounts for approximately 74% of natural methane emission. The process plays a major role in global warming and is important for bioenergy production. This paper reviews the biochemical pathways of methanogenesis. It is currently recognized that methanogenesis proceeds via three biochemical pathways depending on the carbon sources, including hydrogenotrophic, aceticlastic, and methylotrophic methanogenesis. Multiple enzymes and coenzymes are involved in the process, during which Na + or proton gradient is created across the cell membrane, contributing to limited ATP synthesis. In the hydrogenotrophic pathway, CO 2 is reduced to methane with H 2 or formate as an electron donor. In the aceticlastic pathway, acetate is split into methyl and carboxyl group, then the carboxyl group is oxidized to produce H 2 which is used as the electron donor to reduce methyl group. In the methylotrophic pathway, methyl group is reduced with external H 2 or reducing equivalent from the oxidation of its own methyl group. The ATP gained from per mol substrate for different pathways are as follows: hydrogenotrophic > methylotrophic > aceticlastic pathway. Due to the unculturability of most archaeal methanogens, understandings of the biochemical pathways of methanogenesis and the relationships between methanogens and other microbial communities will have to depend on new technologies including bioinformatics, gene engineering and metabolic modelling. Keywords methanogen; biochemical pathways; CO 2 -reducing methanogenesis; aceticlastic methanogenesis; methylotrophic methanogenesis 收稿日期 Received: 2014-08-19 接受日期 Accepted: 2014-10-11 * 国家重点基础研究发展规划项目 (973 项目,2013CB733502) 和国家自然科学基金项目 (31300447,41371268) 资助 Supported by the State Key Basic R & D Program of China (973 Program, 2013CB733502 ), and the National Natural Science Foundation of China (31300447, 41371268) ** 通讯作者 Corresponding author (E-mail: lixz@cib.ac.cn)
2 产甲烷生化代谢途径研究进展 1 期 产甲烷菌在地球碳循环中扮演着重要角色, 是有机物厌氧降解的末端功能类群, 能够将有机碳转化为甲烷. 它们广泛分布于地球的无氧环境中, 从土壤到湖泊沉积物, 从陆地到海洋, 从零下的低温环境到 100 以上的高温环境, 都有产甲烷菌的存在. 进化研究表明产甲烷菌是地球上最为古老的菌群, 目前有两个不同的假说均认为产甲烷菌是真核生物的祖先 [1-2]. 与细菌和真核生物相比, 产甲烷菌以甲烷作为其厌氧呼吸终产物, 具有更加独特的生化代谢特性. 另一方面, 甲烷作为一种清洁能源, 正越来越受到关注 [3]. 同时, 甲烷的高红外吸收以及对臭氧层的影响使之成为第二大温室效应气体, 其产生的温室效应是 CO 2 的 20-30 倍 [4-5]. 目前全球的甲烷排放量约为 5 10 9-6 10 9 kg/ 年 [6], 其中大约 74% 的甲烷排放来自生物产甲烷 [7], 大气中的甲烷含量正以每年 2% 的速度递增 [8]. 因此研究产甲烷菌的生化代谢途径不仅能够增加我们对古菌特殊代谢途径的了解, 而且能够为解决全球能源紧缺以及气候变暖等问题提供理论依据. 产甲烷菌能够利用的底物非常有限, 仅能够利用 CO 2 乙酸和简单甲基化合物这 3 类物质作为碳源产甲烷. 本文即综述产甲烷菌利用这 3 类底物产甲烷的具体代谢过程, 详细阐述其中涉及到的能量转化过程 电子传递途径以及参与的关键酶和辅酶, 介绍最新发现的电子歧化途径, 即包含 FDA 蛋白的复合体介导电子在脱氢 酶和氧化还原酶之间转移, 从而完成能量储存的过程 ; 同时 还对目前通过一些新技术和新方法对产甲烷菌生化代谢过 程研究的进展情况予以总结. 1 产甲烷菌的特点 产甲烷菌是严格厌氧的原核生物, 是已知的唯一一种 能够代谢产甲烷的生物. 系统发育学上属于古菌域广古门 菌门 (Euryarchaeota) [9]. 已知的产甲烷菌分为 7 个目 : 甲烷杆 菌目 (Methanobacteriales) 甲烷球菌目 (Methanococcales) 甲烷微菌目 (Methanomicrobiales) 甲烷八叠球菌目 (Methanosarcinales) 甲烷火球菌目 (Methanopyrales) Methanocellales 和 Methanoplasmatales( 图 1). 前 5 个目中已经 分离到很多纯菌种, 研究较多 [8]. Sakai 等于 2008 年从稻田里 分离得到了一种仅利用 H 2 或甲酸还原 CO 2 生长产甲烷的菌 株, 提出了 Methanocellales 目 [10] ;Paul 等于 2012 年在白蚁肠道 中分离得到的一种与热原体目类似的菌, 仅能够利用甲醇作 为底物生长产甲烷, 于是提出了 Methanoplasmatales 目 [11]. 产甲烷菌分布广泛, 主要存在于厌氧生态系统中, 如 : (1) 湖泊 沼泽湿地 水稻田 污泥等 ;( 2) 生物体内, 如反 刍动物的瘤胃和人类 昆虫等的肠道内 ;(3) 土壤中的厌氧 Methanoculleus marisnigri JR1 Methanomicrobium mobile BP Methanocorpusculum labreanum Z Methanomicrobiales Methanoregula formicica SMSP Methanolinea tarda Methanosphaerula palustris E1 9c Methanocella arvoryzae MRE50 Methanocellales Methanocella paludicola SANAE Methanosarcina acetivorans C2A Methanosarcina barkeri str. Fusaro Methanohalobium evestigatum 7303 Methanococcoides burtonii DSM 6242 Methanosarcinales Methanomethylovorans hollandica DSM 15978 Methanolobus psychrophilus Methanosalsum zhilinae DSM 4017 Methanosaeta concilii Methermicoccus shengliensis Methanococcus maripaludis Methanothermococcus okinawensis IH1 Methanococcales Methanotorris formicicus Mc S 70 Methanocaldococcus jannaschii DSM 2661 Methanobrevibacter ruminantium M1 Methanosphaera stadtmanae DSM 3091 Methanobacteriales Methanobacterium sp. SWAN Methanothermobacter marburgensis 图 1 根据已经进行了全基因组测序的产甲烷菌的 16S rrna 基因序列构建的系统进化树. 粗竖线后面代表产甲烷菌所对应的产甲烷菌目. 数据来源于 Silva (http://www.arb-silva.de/) [12]. Fig. 1 Phylogenetic tree based on 16S rrna gene sequences of selected methanogens with sequenced genomes. Words behind thick vertical lines represent the order of methanogens. Data are from Silva (http://www.arb-silva.de/) [12]. 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol
21 卷方晓瑜等 3 团粒, 如森林中的土壤团粒 ;(4) 人工生物降解设施, 如沼气池和生物反应器 ;( 5) 一些极端环境, 如热泉 含硫热液口 [8, 水底的热流等 13-14]. 尽管产甲烷菌在自然界中分布广泛, 但其不能利用复杂的有机物作为能量来源, 仅能够利用几种简单化合物作为产甲烷的底物, 这些物质主要是 CO 2 乙酸和简单甲基化合物. 根据其利用的底物可以将产甲烷菌分为 3 类 :(1) 还原 CO 2 型, 主要利用 H 2 甲酸作为电子供体还原 CO 2 产甲烷, 例如 Methanobrevibacter [15] ;( 2) 甲基营养型, 通过 H 2 还原甲基化合物中的甲基产甲烷或通过甲基化合物自身的歧化作用产甲烷, 例如 Methanococcus [16] ;( 3) 乙酸型, 通过裂解乙酸, 将乙酸的羧基氧化为 CO 2, 甲基还原为甲烷, 例如 Methanosaeta [17-18]. Methanococcales Methanobacteriales Methanomicrobiales 和 Methanopyrales 目中几乎所有的甲烷 菌都利用 H 2 和 CO 2 途径产甲烷, 其中很多种也利用甲酸. Methanosarcinales 由甲基营养型甲烷菌构成, 利用含甲基的化 合物如乙醇 甲胺等, 其中 Methanosarcina 和 Methanosaeta 属 能够利用乙酸, 有些种还可以同时利用 H 2 /CO 2, 是代谢多样 性最高的甲烷菌群. 多数甲烷菌是中温菌, 但也有些为嗜热 菌和耐低温菌. 2 产甲烷菌的生化代谢途径 甲烷菌的产甲烷过程包括一系列步骤, 有众多酶参与 ( 图 2), 最终将 CO 2 或 C 1 化合物中的甲基还原成 CH 4. 图 2 产甲烷的生化代谢途径 [27]. 图中反应 (12) 和 (13) 是所有生物产甲烷过程必需的生化代谢过程 ; 反应 (1) 至 (5) 是氢型甲烷菌 CO 2 还原途径产甲烷过程所特有的 ; 反应 (6) 为甲基营养途径所特有的 ; 反应 (7) 至反应 (11) 是乙酸途径所特有的生化过程. Fd: 铁氧化还原蛋白 ;MF: 甲烷呋喃 ; H 4 MPT: 四氢甲烷蝶呤 ;H 4 SPT: 四氢八叠蝶呤 ;F 420 : 辅酶 F 420 氧化态 ;F 420 H 2 : 辅酶 F 420 还原态 ;HS-CoM: 辅酶 M;HS-CoA: 辅酶 A;HS-CoB: 辅酶 B; CoM-S-S-CoB: 异质二硫化物. Fig. 2 Biochemical pathways of methanogenesis [27]. Reaction (12) and (13) are essential for all methanogens; reaction (1) to (5) exists in CO 2 -reducing pathway of hydrogenotrophic methanogen; reaction (6) exists in methylotrophic pathway; reaction (7) to (11) exists in aceticlastic pathway. Fd: ferredoxin; MF: methanofuran; H 4 MPT: tetrahydromethanopterin; H 4 SPT: tetrahydrosarcinapterin; F 420 : oxidized form coenzyme F 420 ; F 420 H 2 : reduced form coenzyme F 420 ; HS- CoM: coenzyme M; HS-CoA: coenzyme A; HS-CoB: coenzyme B; CoM-S-S-CoB: heterodisulfide of CoM and CoB. Chin J Appl Environ Biol 应用与环境生物学报
4 产甲烷生化代谢途径研究进展 1 期 2.1 关键酶 2.1.1 辅酶生物产甲烷过程需要多种酶和辅酶共同参与. 这些辅酶根据其功能的不同可以分为两类, 一类是 C 1 的携带者, 主要包括甲烷呋喃 (MF) 四氢甲烷蝶呤 (H 4 MPT) 四氢八叠甲烷蝶呤 (H 4 SPT) 辅酶 M(HS-CoM). 另一类是电子载体, 主要包括铁氧化还原蛋白 (Fd) 辅酶 B(HS- CoB) 辅酶 F 430 细胞色素 FAD 甲烷吩嗪 (MP) 辅酶 F [18-20] 420. 下面就生物产甲烷过程中的几种特殊辅酶进行简单介绍. MF 包含一个呋喃环和一个氨基基团, 其中氨基碳用于结合 CO 2 ;H 4 MPT 和 H 4 SPT 类似, 均为四氢叶酸的衍生物, 用于甲酰 甲叉和甲基水平上 C 1 的转移, 其转移方式与四氢叶酸类似 [21]. HS-CoM 是辅酶中分子量最小的一种, 化学名称为 2- 巯基乙磺酸 (HS-CH 2 CH 2 SO - 3 ) [22], 在甲基转移酶的作用下巯基上的氢原子被甲基基团取代, 是甲烷形成过程中的末端甲基载体. HS-CoB 的化学名称为磷酸 -7- 巯基庚基苏氨酸 (7-mercaptoheptanoylthreonine phosphate), 它包含一个巯基和磷酸基团, 其中巯基为其活性部位. 辅酶 F 430 是一种位于细胞膜上的含镍的类卟吩 (Porphinoid) 化合物, 其中 Ni 为其活性中心, 它具有 3 个价态 (+1 +2 和 +3), 通过这 3 个价态的相互转变实现电子的转移 [23]. MP 是一种仅存在于甲烷八叠球菌目中的一种辅酶, 其功能与其它细菌呼吸链中的醌类相 [20, 似 23]. 辅酶 F 420 是一种去氮黄素衍生物, 其在波长为 420 nm 的紫外光下发出蓝绿色荧光, 可以利用这一特点初步鉴定是否存在产甲烷菌细胞 [24-25]. 辅酶 F 420 的电势较低, 既可作为氢化酶 甲酸脱氢酶和一氧化碳脱氢酶的电子受体, 又可作为 NADP + 还原酶的电子供体 [26]. 2.1.2 关键酶图 2 中反应 (12) 和反应 (13) 是生物产甲烷过程中共有的步骤. 其中反应 (12) 是生物产甲烷过程的最后一步, 它是由含镍的甲基辅酶 M 还原酶 (Mcr) 催化, 以 HS- CoB 为直接的电子供体还原 CH 3 -S-CoM 产生甲烷和 CoB-S-S- CoM 的过程. 甲基辅酶 M 还原酶是产甲烷菌所特有的一种酶 ( 除甲烷营养型古菌外 ) [28]. 因此, 编码 Mcr 其中的一个亚基基因 (mcra) 可用于产甲烷菌的分类学研究 [29-31]. Mcr 由 α β 和 γ 三种不同的亚基组成一个 (αβγ) 2 六聚体结构, 同时, 每分子 Mcr 中含有 2 分子位于酶的活性中心的含镍辅酶 F [32-33] 430. 目前通过对该酶的晶体结构分析推测该酶的催化过程分为 3 步,Ni(I) 亲核攻击 CH 3 -S-CoM 形成中间产物 HS-CoM 和 [F 430 ] Ni(III)-CH 3, 随后,Ni(III) 氧化 HS-CoM 形成硫自由基 (Thiyl radical) S-CoM 和 [F 430 ]Ni(II)-CH 3, 最后,HS-CoB 作为电子供体还原 S-CoM 形成 CoB-S-S-CoM 并将多余的电子转移给 Ni (II) 产生 Ni(I),H + [18, 裂解 [F 430 ]Ni(II)-CH 3 产生甲烷 34]. Mcr 具有两种系统发育不同的同工酶, 分别为 McrI 和 McrII. Sabine 等通过对 Methanobacterium thermoautotrophicum 的研究发现, 该菌中同时具有两种 Mcr, 在 H 2 浓度高时, 该菌以 McrII 为主, 而在氢浓度低时, 主要以 McrI 为主起催化作用 [35]. 后期研究表明 M. thermoautotrophicum 中编码这两种同工酶的操纵子在该菌的生长初期主要编码合成 McrII, 而在该菌的生长后期则主要编码合成 McrI, 但对这个过程的具体机制目前还不清楚 [36-37]. 反应 (13) 也是所有生物产甲烷所必需的. 其中 CoB-S- S-CoM 可以被视为产甲烷过程的末端电子受体, 它被异质二硫化物还原酶 (Hdr) 还原, 重新释放出 HS-CoB 和 HS-CoM, 其反应方程式为 CoB-S-S-CoM + 2e - + 2H + CoB-SH + CoM- SH [38]. Hdr 是一种与膜相结合的蛋白, 目前发现有两种类型, 一类是从 Methanosarcina barkeri 中分离得到的 HdrED, 它由一个细胞色素, 两个嵌膜的 Hdr 亚基组成 [39]. HdrED 在还原 CoB-S-S-CoM 时以 H 2 F 420 H 2 或 Fd red 作为电子供体, 通过细胞色素和甲烷吩嗪来传递电子, 在这个过程中会消耗细胞质中的质子, 产生跨膜质子梯度用于合成 ATP. 这种酶对于利用乙酸的产甲烷菌是必须的. 另一类是从 Methanothermobacter thermoautotrophicum 和 Methanothermobacter marburgensis 中分离得到的 HdrABC. 含有 HdrABC 的甲烷菌能够利用 CO 2 + H 2 生长, 不能合成细胞色素和甲烷吩嗪 [40]. Thauer 等利用模型推测, 在这些没有细胞色素的产甲烷菌中存在由 HdrABC 中的黄素 (Flavin) 介导的电子歧化 (Bifurcation) 过程, 认为 HdrABC 不直接参与能量的储存, 而是与产甲烷过程第一步中的铁氧化还原蛋白 (Ferredoxin) 的还原过程相偶联, 产生钠离子梯度, 用于 ATP 的合成 [19]. Buckel 等对这个过程进行了详细阐述 [41], 具体过程见图 3. Buan 等通过对 5 种 Methanosarcinales 进行测序发现, 这些菌株的基因组中含有 hdred 基因, 也包含 hdracb 基因, 但是通过生化方法在 Methanosarcinales 中还未发现 HdrABC; 他们推测要么 HdrED 或 HdrABC 对细胞的生长条件存在偏好性, 要么 HdrED 或 HdrABC 具有特殊的生理功能 [42]. 2.2 生化代谢过程 2.2.1 还原 CO 2 途径还原 CO 2 途径广泛存在于自然界中, 除少数几种产甲烷菌没有还原 CO 2 途径外, 绝大多数产甲烷均可以利用该途径产甲烷 [19]. 在还原 CO 2 途径中, 绝大部分产甲烷菌以 H 2 作为电子供体, 在氢酶作用下将电子传递给 Fd ox 还原 CO 2, 因此这些菌又被称作氢营养型产甲烷菌 (Hydrogenotrophic methanogen). 大多数产甲烷菌也能够利用甲酸作为电子供体还原 CO 2, 它们通过依赖 F 420 的甲酸脱氢酶和 F 420 还原性氢酶将 4 分子甲酸转化为 4CO 2 和 4H 2, 再利用 H 2 和 CO 2 产甲烷 [43]. 也有少数产甲烷菌利用 CO 作为电子供体, 在这个过程中 3CO 先被氧化为 3CO 2 产生电子, 用于 CO 2 还原产甲烷 [44-45]. 下面就氢营养型产甲烷菌的生化过程进行详细介绍. 在图 2 中, 反应 (1) 至 (5) 是利用 H 2 还原 CO 2 途径的反应过程. 反应 (1) 至 (4) 由位于细胞质中的酶复合体催化 ; 反应 (5) 是由位于细胞膜上的蛋白复合体催化. 反应 (1) 由甲酰甲烷呋喃脱氢酶 (Fdh) 以还原的铁氧化还原蛋白 (Fd red ) 作为电子供体, 还原 CO 2 为甲酰基共价连接于甲烷呋喃 (MF) 的氨基基团形成 CHO-MF 和氧化的铁氧化还原蛋白 (Fd ox ) [46],Fd ox 随后利用 H 2 作为电子供体, 在能量转化 [NiFe] 氢酶 (Ech) 的催化下产生 Fd red, 这个过程需要消耗能量或需要反向电子流 (Reverse electron transfer). 不同产甲烷菌的 Fdh 的结构具有一定的差异, 但是其催化功能基本相似 [47]. 接下来四氢甲烷蝶呤甲酰转移酶催化甲酰甲烷呋喃上的甲酰基转移到 H 4 MPT 的 N 5 基团上形成 CHO-H 4 MPT [ 反应 (2)]. 随后甲酰四氢甲烷蝶呤环化水解酶和甲酰四氢甲烷蝶呤脱氢酶催化完成反应 (3). 其中甲酰四氢甲烷蝶呤脱氢酶 (Mtd) 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol
21 卷方晓瑜等 5 图 3 Methanothermobacter marburgensis 中 MvhADG-HdrABC 复合体的结构和功能示意图 [41]. 该复合体存在于大多数甲烷菌中 (Methanomicrobiales 中的一些种除外 ), 可以进行黄素介导的电子歧化过程 (Flavinbased electron bifurcation, 即包含 FDA 蛋白的复合体介导电子在脱氢酶和氧化还原酶之间转移 ). Fd 的氧化还原电势低于 FAD, 通常情况下, 高电势的 FAD 不能还原低电势的 Fd. 而在电子歧化过程中, 高电势的电子供体 FAD 利用比自己有更高电势的电子供体 ( 如 CoM-S-S-CoB) 使自己部分氧化, 而使另一部分的氧化还原电势降低, 然后用来还原电势较低的 Fd. 图中 Fd 的结合位点是随意选择的, 绿色部分是氢酶的 [NiFe] 中心, 红色部分为推测的电子传递过程. Fd: 铁氧化还原蛋白 ;Mvh: 甲基紫精 (Methyl viologen) 还原性氢酶 ;Hdr: 异质二硫化物还原酶. Fig. 3 Schematic representation of the structure and function of the MvhADG-HdrABC complex from Methanothermobacter marburgensis [41]. The complex is found in most methanogenic archaeas, except several members of the Methanomicrobiales. It can conduct the process of flavin-based electron bifurcation (heterodimeric FAD containing proteins mediating electron transport between a dehydrogenase and an oxidoreductase). The potential of Fd is lower than FAD; higher potential FAD usually cannot catalyze the reduction of the low potential Fd. However, in flavin-based electron bifurcation, part of FAD is oxidized by giving electron to other electron donor with higher potential, for example CoM-S-S-CoB, and the other part of FAD is reduced, so that it can catalyze the reduction of Fd with lower potential. The binding site for Fd at HdrA is chosen arbitrarily. The [NiFe] center of the hydrogenase is highlighted in green. The guessed electron transfer pathway is highlighted in red. Fd: ferredoxin; Mvh: methyl viologen reducing hydrogenase; Hdr: heterodisulfide reductase. 根据其利用的电子供体分为两类 : 一类是辅酶 F 420 依赖型, 以辅酶 F 420 H 2 作为电子供体 [48] ; 另一类是 H 2 依赖型, 以 H 2 作为 电子供体. 随后由甲酰四氢甲烷蝶呤还原酶以辅酶 F 420 H 2 作 为电子供体催化完成反应 (4). 研究发现该酶是辅酶 F 420 依 赖型酶, 由一个亚基组成, 没有检测到辅基 [49-50]. 最后辅酶 M 甲基转移酶 (Mtr) 催化完成反应 (5) 将甲基基团转移到 HS- CoM 的硫醇基上形成 CH 3 -S-CoM, 伴随着甲基的转移会产生 钠离子梯度, 用于 ATP 的合成 [51]. Mtr 是由 mtrecdbafgh 操 纵子编码的, 由 8 个亚基组成的嵌膜蛋白复合体 [52]. 其中亚基 MtrA 中含有一个钴胺素 (I) 辅基, 它在催化循环中不断地被 甲基化和去甲基化, 去甲基化的过程中伴随着钠离子被泵出 细胞膜, 产生钠离子梯度 [53] ; 从 Mtr 复合体中分离得到的 MtrH 能够利用 CH 3 -H 4 MPT 催化自由钴胺素 (I) 辅基转变为甲基化 的钴胺素 (I) 辅基 [54] ; 亚基 MtrE 被认为能够将 MtrA 中的类咕琳 (Corrinoid) 辅基上的甲基基团转移到辅酶 M 的巯基上, 该反应是依赖钠离子的反应 [55]. 2.2.2 乙酸途径自然界中约 2/3 的生物产甲烷来自于乙酸途径, 然而仅 Methanosarcina 和 Methanosaeta 能够利用乙酸途径产甲烷 [27]. 它们通过裂解乙酸, 还原甲基碳产 CH 4, 同时氧化其羧基碳产生 CO 2. 在乙酸转变为乙酰辅酶 A 的过程中, 这两种产甲烷菌具有不同的反应机制. Methanosarcina 通过乙酸激酶 [ 催化反应 (7)] 和磷酸转乙酰酶 [ 催化反应 (8)] 利用 1 分子 ATP 催化乙酸转变为乙酰辅酶 A; 而 Methanosaeta 则通过乙酰辅酶 A 合成酶利用 2 分子 ATP 催化乙酸转变为乙酰辅酶 A [56]. 乙酰辅酶 A 再由一氧化碳脱氢酶 / 乙酰辅酶 A 合成酶复合体 (Codh/Acs) 催化以 Fd ox 作为电子受体完成反应 (9), 产生 CO 2 和 CH 3 -H 4 SPT. Codh/Acs 是解乙酸途径中的关键酶, 用于剪切乙酰辅酶 A 上的 C C 和 C S 键. 在将甲基基团转移到 H 4 SPT 上形成 CH 3 -H 4 SPT 的同时, 利用 Fd ox 作为电子受体氧化 CO 产生 CO 2 和 Fd red, 并将甲基基团转移到 H 4 SPT 上形成 CH 3 - H 4 SPT. 不同的产甲烷菌所具有的 Codh/Acs 结构有所差别, Methanosarcina thermophila 中该酶由 5 个亚基 (α β γ δ ε) 组成, 包含 α 和 ε 亚基组成的 Ni/Fe-S γ 和 δ 亚基组成的 Co/Fe-S 以及 β 亚基这 3 个部分 [57] ;M. barkeri 中的 Codh/Acs 与其结构相似 [58-59], 但它包含一个独特的类咕琳蛋白, 推测其功能为接收甲基基团 [60] ; 而在 Methanothrix soehngenii 中仅由一个类似 M. thermophila 中 Ni/Fe-S 部分的 α 2 β 2 组成 [61]. 产生的 Fd red 在 Ech 的催化下产生 H 2 和 Fd ox 用于后续反应, 这个过程伴随着离子梯度的产生. 反应 (9) 中产生的 CO 2 可以在碳酸酐酶的作用下与 H 2 O 反应生成碳酸 [ 反应 (10)], 这个过程可以移去细胞质内多余的 CO 2, 增加产甲烷的效率. 随后四氢八叠甲烷蝶呤甲基辅酶 M 转移酶催化完成反应 (11) 产生 CH 3 -S-CoM, 这个过程与反应 (5) 相似, 也能够产生钠离子梯度, 用于合成 ATP. 2.2.3 甲基营养途径自然界中, 仅甲烷八叠球菌目以及甲烷球菌目中的 Methanosphaera 能够利用甲基营养途径产甲烷 [27]. 该途径包含两种代谢模式, 第一种为 H 2 依赖型代谢模式, 它以 H 2 作为电子供体, 还原甲基化合物中的甲基基团产甲烷 [62-63]. 第 2 种模型为严格的甲基营养型, 一部分甲基化合物被氧化产生 CO 2 以及还原当量, 用于还原甲基化合物中的甲基基团产甲烷 [18, 21]. 这也是大多数甲基营养型产甲烷菌的代谢途径, 它们仅以甲基化合物为底物产甲烷, 具体反应过程见图 2. 甲基化合物首先在特殊的辅酶 M 甲基转移酶系统 (Mt) 的作用下以 HS-CoM 作为电子供体, 将甲基基团转移到 HS- CoM 的巯基上产生 CH 3 -CoM [ 反应 (6)]. 不同的底物所对应的 Mt 不同, 甲基营养型产甲烷菌能够利用的底物主要包括甲醇 (Mta) [64] 一甲胺 (Mtm) [65] 二甲胺 (Mtb) [66] 三甲胺 (Mtt) [67] 甲硫醇 (Mts) [68]. 每种 Mt 均包含一个具有底物特异性的类咕琳蛋白和两个不同的甲基转移酶, 分别表示为 MT1(MtaB MtmB MtbB 和 MttB) 和 MT2(MtaA MtbA 和 MtsA), 其中 MT1 催化还原态的类咕琳蛋白甲基化,MT2 催化类咕琳蛋白上的甲基基团转移到 HS-CoM 上, 仅二甲硫醚所具有的 Mt 是由两个相同的 MtsA 组成 [69-70]. 通过对这些甲基转移酶系统的基因序列对比分析发现,MT2 蛋白序列具有高度相似性, 其活性中心均含有锌, 同时其对应的类咕琳蛋白 Chin J Appl Environ Biol 应用与环境生物学报
6 产甲烷生化代谢途径研究进展 1 期 的序列也具有一定的相似性, 而用于激活底物的 MT1 蛋白不 具有系统发育相似性 [23]. 随后, 在 H 2 存在的条件下,CH 3 -CoM 利用 H 2 作为电子 供体经反应 (12) 和 (13) 产甲烷 ; 在没有 H 2 的条件下, 一部 分 CH 3 -CoM 经过反应 (4) 至反应 (1) 的逆反应被氧化产生 CO 2 F 420 H 2 和 H 2, 另一部分 CH 3 -CoM 利用 F 420 H 2 和 H 2 作为电 子供体经反应 (12) 和 (13) 产 CH 4. 2.3 能量产生比较产甲烷菌的能量产生主要依赖于钠离子或质子跨膜梯 度, 驱动位于细胞膜上的 ATP 合成酶将 ADP 转化成 ATP, 反应 (1) ( 5) ( 9) (11) (12) (13) 与钠离子或质子转运相 偶联. 不同途径生物产甲烷过程的总反应方程式及其自由能 见表 1, 其中还原 CO 2 产甲烷途径产生的净能量最高, 甲基营 养型次之, 乙酸途径最低. 在绝大多数产甲烷过程中, 甲基转移过程是能量储存的 关键步骤, 它能够直接驱动钠离子异位. 然而甲基营养型和 氢营养型产甲烷菌的能量储存过程存在一定的差异 [71]. 甲基 营养型甲烷菌具有细胞色素和一个质子移位电子传输链, 它 们用于在反应最后储存产甲烷过程中释放的能量. 而氢营养型产甲烷菌不具备这些组分, 同时, 其反应第一步 [ 反应 (1)] 是耗能反应, 还不清楚在能量储存过程中如何获得反应 (1) 所需的能量. 近期,Thauer 等提出了电子歧化机制 ( 即释能的 电子流动直接驱动耗能的电子流动 ) 来解释这个问题 [19]. 它 们将利用 H 2 / 甲酸还原 CO 2 产甲烷的途径根据菌体中是否含 有细胞色素分为两类 (I 类 : 不含细胞色素 ;II 类 : 含有细胞色 素 ). 总体而言, 这两类途径中涉及到能量消耗过程均为反 应 (1), 储能的过程均为反应 (5) ( 12) ( 13). 但是这两 类途径在反应 (1) 和反应 (13) 的能量消耗和储存过程中存 在一定的差异. I 类途径利用黄素介导的电子歧化过程, 利用 Ech 和 Hdr 酶复合体以及黄素蛋白和 Fd 作为电子载体, 将反应 (1)Fd ox 的还原过程 ( 耗能过程 ) 与反应 (13) 异质二硫化物 的还原过程 ( 产能过程 ) 偶联在一起, 并产生钠离子梯度 [41]. II 类途径反应 (1) 和反应 (13) 独立进行. 反应 (1) 所需的能 量直接由钠离子所产生的电化学电势提供, 反应 (13) 利用 甲烷吩嗪还原性氢酶氧化 H 2, 并且以甲烷吩嗪和细胞色素作 为电子载体, 还原 CoB-S-S-CoM, 这个过程会产生钠离子梯 度 [23]. II 类途径产生的能量略高于 I 类途径 [19]. 对比表 1 数据可知, 在甲基营养型产甲烷途径中, 利用甲 醇产甲烷过程中产生的净能量相对于其它甲基化合物更高, 并且含氮的甲基化合物所产生的能量相近, 但是都明显低于 还原 CO 2 途径. 甲基营养途径中, 由于产生 CO 2 的过程是反应 (5) 至反应 (1) 的逆反应, 故产生 CO 2 的过程是耗能反应 [27]. 因此甲基营养途径产生的净能量低于还原 CO 2 途径. 对于乙酸途径, 其消耗能量的过程为反应 (7), 至少 需要 1 个 ATP 用于活化乙酸 ; 其能量产生的过程为反应 (9) (12) 和 (13), 其中反应 (12) 和 (13) 产生的能量与另两个途 径相近, 而反应 (9) 产生的能量较低, 从而导致其为产生净 能量最低的产甲烷途径. 3 产甲烷菌的基因改造及代谢模型 近年来, 通过传统研究方法主要包括菌种分离技术 酶分离技术 同位素示踪等方法已分离了约 208 个产甲烷菌 种, 研究了其生理特征 关键酶以及电子传递过程等, 对产 甲烷菌的基本代谢途径已经有了深入系统的认识. 但是, 自 然界中仍然还存在许多难以分离的产甲烷菌, 其可能具有 某些特殊的代谢途径. Andrew 等在海洋沉积物中分离到 3 株 Methanococcoides, 它们能够通过部分脱甲基化作用, 利用甜 菜碱作为底物产甲烷 [72]. 同时, 由于部分产甲烷菌中的酶难 以分离, 因此一些认识是基于生物信息学比对或理论推测得 到的. 随着基因改造 基因组测序 转录组测序和生物信息学 等新技术的发展, 对产甲烷菌的代谢途径和过程调控的认识 已越来越深入全面. Methanococcus 和 Methanosarcina 这两个 属分别代表 H 2 /CO 2 和甲基营养 ( 包括乙酸 ) 途径, 对这两个 属已经开发了一些遗传工具, 研究其生化代谢和遗传特征, 表 1 产甲烷反应的自由能及参与不同过程的代表菌属 Table 1 Free energy and representative methanogens inmethanogenesis reactions 产甲烷反应 Methanogenesis reaction G /kj mol -1 CH 4 部分代表菌属 Representative methanogens Ⅰ. 还原 CO 2 途径 CO 2 -reducing pathway 4H 2 + O 2 CH 2 + 2H 2 O -135 Methanothermus, Methanocaldococcus 4HCOOH CH 4 + 3O 2 + 2H 2 O -130 Methanobacterium, Methanothermococcus 4O + 2H 2 O CH 4 +3CO 2-196 Methanothermobacter, Methanosarcina Ⅱ. 甲基营养途径 Methylotrophic pathway 4CH 3 OH 3CH 4 + CO 2 + 2H 2 O -105 Methanosarcina, Methanohalobium CH 3 OH + H 2 CH 4 + H 2 O -113 Methanomicrococcus blatticola, Methanosphaera 2(CH 3 ) 2 - S + 2H 2 O 3CH 4 + CO 2 + 2H 2 S -49 Methanosalsum, Methanomethylovorans 4CH 3 - NH 2 + 2H 2 O 3CH 4 + CO 2 + 4NH 3-75 Methanococcoides, Methanosarcina 2(CH 3 ) 2 NH + 2H 2 O 3CH 4 + CO 2 + 2NH 3-73 Methanococcoides, Methanosarcina 4(CH 3 ) N + 6H 2 O 9CH 4 + 3CO 2 + 4NH 3-74 Methanosarcina, Methanohalobium 4CH 3 NH 3 Cl + 2H 2 O 3CH 4 + CO 2 + 4NH 4 Cl -74 Methanosalsum, Methanohalophilus Ⅲ. 乙酸途径 Aceticlastic pathway CH 3 COOH CH 4 + CO 2-33 Only Methanosarcina and Methanosaeta G : 标准自由能, 是在 ph = 7 时对离子形式计算的自由能, 例如 CO 2 是按照 HCO 3 - + H +,HCOOH 是按照 HCOO - + H + 的形式在 ph = 7.0 时计算的自由能. G : The standard free energy is calculated based on the free energy of formation of the most abundant ionic species at ph 7. For instance, CO 2 is HCO 3 - + H +,and HCOOH is HCOO - + H +. 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol
21 卷方晓瑜等 7 包括可复制的穿梭载体 [73-74] [75-76] [75, 77] 反选择和异位整合等 基因操作技术. Farkas 等对古菌基因工程技术的方法及应用 进行了总结 [78]. 基因工程改造不仅可以拓宽产甲烷菌的代谢 底物 [79], 也有助于发现新的代谢途径 [80]. Daniel 等通过基因 工程的方法成功地将好氧细菌 Pseudomonas veronii 中的酯酶 ( 可以水解多种酯键 ) 基因转入 Methanosarcina acetivorans 菌中, 取得了良好的效果, 使得产甲烷菌能够利用乙酸甲酯和丙酸甲酯产甲烷 [81]. Welander 等通过对 Methanosarcina barkeri 中一系列涉及产甲烷途径中编码 C 1 氧化 / 还原酶的基 因进行突变研究, 发现当甲醇和乙酸同时作为底物时, 产甲 烷的过程中存在一个新的 Mtr/Mer 代谢旁路 [80]. Rotaru 等通 过宏转录组等手段分析啤酒厂废水处理器中的菌群结构后, 提出 Geobacter 和 Methanosaeta 这两种菌种间存在一种新的 种间电子传递途径, 即直接的电子传递途径 (DIET) [82], 打 破了传统的观念, 即产甲烷菌与其他菌群种间电子传递必须 由 H 2 或甲酸作为电子传递载体. 另一方面, 代谢模型重组方 法的提出使得利用计算机对产甲烷的生化代谢过程进行模 拟 构建和预测成为可能. Adam 等首先基于代谢底物最为广 泛的 Methanosarcina barkeri 基因组构建了生物产甲烷的代谢 重组模型 [83], 与现有的实验数据具有较高的相似度, 证明了代谢重组可以用于古菌代谢状况的模拟和构建. Gonnerman 等在此基础上, 利用现有的数据对其进一步进行了完善 [84]. Kumer 等对基因组最大的古菌 Methanosarcina acetivorans 进 行了代谢模型构建, 其准确率达到了 93.3% [85] [86]. Oberhardt 等 对基因组代谢重组的具体方法以及应用进行了详细总结. 目 前已测序的产甲烷菌大约有 32 个种, 然而对产甲烷菌的生理 生化性质研究并不完整, 基因代谢模型重组方法的预测还存 在一定的偏差, 但是, 该方法在研究生物产甲烷代谢途径方 面具有较大的发展前景. 4 结论与展望 产甲烷菌生长在严格厌氧的环境中, 具有独特的生物化 学代谢途径, 但由于产甲烷菌难于分离培养, 也难于对其进 行遗传改造, 加上产甲烷菌自身的代谢也相当复杂. 因此, 目 前对于产甲烷菌的生化代谢过程及调控还有很多工作要做. 本文对目前的研究状况进行了总结, 认为未来对产甲烷菌的 研究将主要集中在以下几个方面 :(1) 产甲烷菌的生理生化 特征研究, 包括高效产甲烷菌的分离以及产甲烷菌中关键酶 的研究等 ;( 2) 利用新技术和新方法发现 改造及模拟生物 产甲烷的代谢通路 ;( 3) 产甲烷菌的生态学研究, 如利用各 种分子生物学技术, 研究环境中产甲烷菌的分布 与其它菌 群的关系及对全球变化的响应机制. 参考文献 [References] 1 Ferry JG, House CH. The stepwise evolution of early life driven by energy conservation [J]. Mol Biol Evol, 2006, 23 (6): 1286-1292 2 Battistuzzi FU, Feijao A, Hedges SB. A genomic timescale of prokaryote evolution: insights into the origin of methanogenesis, phototrophy, and the colonization of land [J]. BMC Evol Biol, 2004, 4 (44): 1-14 3 Ferry JG. Fundamentals of methanogenic pathways that are key to the biomethanation of complex biomass [J]. Curr Opin Microbiol, 2011, 22 (3): 351-357 4 Lelieveld J, Crutzen P, Brühl C. Climate effects of atmospheric methane [J].Chemosphere, 1993, 26 (1): 739-768 5 陈槐, 周舜, 吴宁, 王艳芬, 罗鹏, 石福孙. 湿地甲烷的产生 氧化及排放通量研究进展 [J]. 应用与环境生物学报, 2006, 12 (5): 726-733 [Chen H, Zhou S, Wu N, Wang YF, Luo P, Shi FS. Advance in studies on production, oxidation and emission flux of methane from wetlands [J]. Chin J Appl Environ Biol, 2006, 12 (5): 726-733] 6 Lowe DC. Global change: a green source of surprise [J]. Nature, 2006, 439 (7073): 148-149 7 Whitman WB, Bowen TL, Boone DR. The methanogenic bacteria [M]. Springer, 2006 8 Garcia JL, Patel BKC, Ollivier B. Taxonomic, phylogenetic, and ecological diversity of methanogenic archaea [J]. Anaerobe, 2000, 6 (4): 205-226 9 Woese CR, Kandler O, Wheelis ML. Towards a natural system of organisms-proposal for the domain archaea, bacteria, and eucarya [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87 (12): 4576-4579 10 Sakai S, Imachi H, Hanada S, Ohashi A, Harada H, Kamagata Y. Methanocella paludicola gen. nov., sp nov., a methane-producing archaeon, the first isolate of the lineage Rice Cluster I, and proposal of the new archaeal order Methanocellales ord. nov [J]. Int J Syst Evol Micr, 2008, 58: 929-936 11 Paul K, Nonoh JO, Mikulski L, Brune A. Methanoplasmatales, thermoplasmatales-related archaea in termite guts and other environments, are the seventh order of methanogens [J]. Appl Environ Microb, 2012, 78 (23): 8245-8253 12 Quast C, Pruesse E, Yilmaz P, Gerken J, Schweer T, Yarza P, Peplies J, Glockner FO. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools [J]. Nucleic Acids Res, 2013, 41: 590-596 13 Conrad R. Control of microbial methane production in wetland rice fields [J]. Nutr Cycl Agroecosys, 2002, 64 (1-2): 59-69 14 傅霖, 辛明秀. 产甲烷菌的生态多样性及工业应用 [J]. 应用与环境生物学报, 2009, 15 (2): 574-578 [Fu L, Xin MX. Ecological diversity and industrial application of methanogens. Chin J Appl Environ Biol, 2009, 15 (2): 574-578] 15 Leadbetter JR, Breznak JA. Physiological ecology of Methanobrevibacter cuticularis sp. nov and Methanobrevibacter curvatus sp. nov., isolated from the hindgut of the termite Reticulitermes flavipes [J]. Appl Environ Microb, 1996, 62 (10): 3620-3631 16 Whitman WB, Ankwanda E, Wolfe RS. Nutrition and carbon metabolism of Methanococcus voltae [J]. J Bacteriol, 1982, 149 (3): 852-863 17 Garcia JL. Taxonomy and ecology of methanogens [J]. FEMS Microbiol Lett, 1990, 87 (3-4): 297-308 18 Ferry JG. Enzymology of one-carbon metabolism in methanogenic pathways [J]. FEMS Microbiol Rev, 1999, 23 (1): 13-38 19 Thauer RK, Kaster AK, Seedorf H, Buckel W, Hedderich R. Methanogenic archaea: ecologically relevant differences in energy conservation [J]. Nat Rev Microbiol, 2008, 6 (8): 579-591 20 Abken H-J, Tietze M, Brodersen J, Bäumer S, Beifuss U, Deppenmeier U. Isolation and characterization of methanophenazine and function of phenazines in membrane-bound electron transport of Chin J Appl Environ Biol 应用与环境生物学报
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