波仕特季刊 2012 Q2 ISO 9001-2008 Certificated Worthington 品牌深入報導 : Collagenase 產品選擇 & 試用方案 好用工具 Tissue Dissociation Guide 1 4 Chromotek 產品介紹 : 螢光蛋白免疫沉澱實驗的絕佳工具 增強螢光強度的超強螢光染劑 6 10 波仕特生物科技有限公司 www.bio-protech.com.tw Protech Technology Enterprise Co., Ltd. tech@bio-protech.com.tw service@bio-protech.com.tw 台北 02-2655-7677 新竹 037-680-138 台中 04-2262-4883 高雄 07-342-5707 花蓮 038-463-953 北部 0800-231-530 中部 0800-555-650 南部 0800-268-266 技術問題 tech@bio-protech.com.tw 其他服務 service@bio-protech.com.tw 1
Worthington 品牌深入報導 梁成芝編撰 Worthington 專業的酵素供應商 Worthington 公司於 1947 年成立於美國紐澤西州, 以供應生化研究用的酵素為主, 目前供應數百種相關酵素, 包括 Collagenase Trypsin Proteinase K DNase RNase 等產品 其中, 細胞分離用的酵素 [ 如 Collagenase Trypsin Elastase Hyaluronidase Papain Chymotrypsin Deoxyribonuclease I (DNase I) Neutral Protease (Dispase) Trypsin Inhibitor (Soybean) 等產品 ], 常因細胞種類不同而需使用不同產品或配方 Worthington 原廠將相關的參考文獻整理成 Tissue Dissociation Guide, 放於網頁上提供客戶查詢, 詳細查詢方式請見第 4 頁專欄圖解說明 除此之外,Worthington 原廠也提供肝臟細胞 心肌細胞和神經細胞的專用細胞分離套組 因為 Worthington 產品種類繁多, 即使相同的酵素往往有多種規格讓人不知從何挑起 因此, 本次季刊特別整理 Worthington 廠牌的 Collagenase 及細胞分離相關產品, 希望能幫助您快速選擇出適用的產品 Collagenase 簡介 Worthington 從 1959 年開始販售從 Clostridium histolyticum 純化出的 collagenase 粗萃取的 Collagenase 中常包含多種不同的酵素, 通常包括 Collagenase Sulfhydryl protease Clostripain 及 Aminopeptidase 等等, 這些酵素的活性十分適合用於分解細胞間質 (Intercellular Matrices), 因此常用於初代培養 (Primary Culture), 從不同的組織中分離出細胞 目前 Worthington 原廠販售的商品包括 4 種不同 type 的 Collagenase (Collagenase type 1~4) 除此之外, 也提供層析純化等級及無動物性來源 (Animal Origin-Free, AOF) 等級的產品, 給您更多的選擇 詳細產品說明及適用範圍請見第 3 頁的產品列表 1 免付費專線台北 0800-231-530 新竹 0800-500-110 台中 0800-555-650 高雄 0800268-266
www.worthington-biochem.com Collagenase Sampling Program 只要您的訂購量在 3 g 以上, 就可在訂購前免費參加 Collagenase Sampling Program 您可經由原廠網頁的 Collagenase Lot Selection Tool (http://www.worthington-biochem.com/cls/match.php) 選擇您想測試的批號 ( 如下圖 ), 或由原廠隨機提供 3 個不同批號各 100 mg 的 Collagenase 給您試用, 並保留每個批號至少 3 g 的庫存 試用完畢後, 您可在下訂單時指定您所需要的批號 輸入您想測試的 Collagenase Type 及預 計購買量 根據您的需求選擇 Collagenase 中其他 酵素含量, 圖中數字為原廠預設值 點選 Search for Matches 送出需求, 結果如下圖 得到 3 個不同批號及各種酵素的原廠測定含量 請將批號及產品種類告訴我們, 即可申請試用品 技術問題 tech@bio-protech.com.tw 其他服務 service@bio-protech.com.tw 2
Collagenase 產品選擇表 產品名稱產品說明產品編號包裝 Collagenase, Animal Origin-Free ( 無動物性來源成份 ) Collagenase, Chromatographically Purified ( 層析純化 ) 150 U/mg, 用不含動物來源培養基培養的細胞生產 出的膠原蛋白酶, 建議用於需要避免動物來源病原菌 的製程 LS004152 LS004154 LS004156 LS004158 100 mg 1 g 5 g Bulk 500 U/mg, 酪蛋白酶 (caseinase) 活性 50 U/mg LS005275 4 ku LS005273 LS005277 Collagenase Vial, NCIS, Filtered 500 U/mg, 每瓶以 5 ml HBSS 回溶後濃度 > 300 U/mL LK003240 1 vial LK003245 Collagenase, Type 1 LS004194 100 mg 125 U/mg, 內含膠原蛋白酶 酪蛋白酶 梭菌蛋白 酶 胰蛋白酶活性 (collagenase, caseinase, clostripain, LS004196 and tryptic activity), 建議用於上皮 肝臟 肺臟 腎上腺細胞分離 LS004197 LS004200 5 g Bulk Collagenase, Type 1, Filtered LS004214 50 mg Collagenase, Type 2 125 U/mg, 含較高的梭菌蛋白酶活性 (clostripain activity), 建議用於骨頭 心臟 肝臟 胸腺 唾腺細 胞分離 LS004216 LS004174 LS004176 LS004177 LS004179 Collagenase, Type 2, Filtered LS004202 50 mg Collagenase, Type 3 100 U/mg, 含較少的雜蛋白酶活性 (secondary proteolytic activity), 建議用於哺乳動物細胞分離 LS004204 LS004180 LS004182 LS004183 LS004185 Collagenase, Type 3, Filtered LS004206 50 mg Collagenase, Type 4 160 U/mg, 含較低的胰蛋白酶活性 (tryptic activity), 可減少破壞膜蛋白質及受體, 建議可用於胰島細胞分 離 LS004208 LS004186 LS004188 LS004189 LS004191 Collagenase, Type 4, Filtered LS004210 50 mg Collagenase/Elastase Vial, HIS Kit, Filtered LS004212 10 ku Bulk 5 vial 1 g 5 x 50 mg 100 mg 1 g 5 g Bulk 5 x 50 mg 100 mg 1 g 5 g Bulk 5 x 50 mg 100 mg 1 g 5 g Bulk 5 x 50 mg 20000 U, Hepatocyte Isolation System kit 配件, 由 LS002066 1 vial * Filtered 表示產品經過 0.22 µm 濾膜過濾滅菌後, 再冷凍乾燥的粉末狀包裝 LS002067 5 vial 3 免付費專線台北 0800-231-530 新竹 0800-500-110 台中 0800-555-650 高雄 0800268-266
www.worthington-biochem.com Tissue Dissociation Guide 使用方法介紹專欄 若想要依據您的細胞種類選擇適用的酵素, 請參考 Worthington 原廠提供的 Tissue Dissociation Guide (http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation/default.html) 連上網頁後, 拉到最下方, 在下方表格中直接點選您的細胞種類, 即可顯示 paper 列表 表格內容包括組織來源物種 細胞種類 使用酵素種類及配方 培養基種類及原始 paper 連結等資訊 點選 Muscle 組織為例, 點完 即出現下圖的表格 原廠整理出 reference paper 中的有用資訊包括 : 組織來源物種 細胞種類 使用酵素 種類及配方 培養基種類及原始 paper 連結等等, 提供給您參考 技術問題 tech@bio-protech.com.tw 其他服務 service@bio-protech.com.tw 4
www.worthington-biochem.com Tissue Dissociation 其他相關產品列表 產品名稱產品說明產品編號包裝 Cell Isolation Optimizing System 此 Kit 包含各種常用的細胞分離酵素, 可協助您快速 LK003200 5 rxn 找到最適合的細胞分離條件 內容物包括 : Collagenase Type 1 ~ 4, 500 mg each; Trypsin, 500 mg; Neutral Protease (Dispase), 10 mg; Hyaluronidase, 50 ku; Elasetase, 100 mg; Papain, 100 mg; DNase I, 25 mg; Trypsin Inhibitor, 100 mg 若需單買上列酵素請參考右方產品 列表 ( 僅列出最小包裝, 大包裝編號 請洽波仕特 ) Collagenase, Type 1 LS004194 100 mg Collagenase, Type 2 LS004174 100 mg Collagenase, Type 3 LS004180 100 mg Collagenase, Type 4 LS004186 100 mg Trypsin LS003665 100 mg Neutral Protease (Dispase) LS02100 10 mg Hyaluronidase LS002594 50 ku Elasetase LS002290 25 mg Papain LS003118 25 mg DNase I LS002138 25 mg Trypsin Inhibitor LS003587 1 g Hepatocyte Isolation System 內容物包括 : 10X CMF-Hank s Balanced Salt Solution, 500 ml; Collagenase/Elastase Vial, 5 vials; DNase I, 5 x 1000 U; 0.15M MOPS, ph 7.5, 75mL 7.5% NaHCO 3, 100 ml Leibovitz L-15 Media Powder, 1 x 1 L LK002060 5 rxn Neonatal Cardiomyocyte Isolation System 內容物包括 : 1X CMF-Hank s Balanced Salt Solution, 500 ml; Trypsin, 5 x 1000 µg; Trypsin Inhibitor, 5 x 2000 µg; Collagenase, 5 x 1500 µg; Leibovitz L-15 Media Powder, 1 x 1 L Cell Strainer, 5 pieces LK003300 5 rxn Papain Dissociation System 內容物包括 : * 每組 kit 可用來處理 5 隻成年大鼠肝臟 1X Earle s Balanced Salt Solution, 100 ml; Papain, 5 x 100 U DNase I, 5 x 1000 U; Ovomucoid protease inhibitor, 5 x 300 mg LK003150 5 rxn 5 免付費專線台北 0800-231-530 新竹 0800-500-110 台中 0800-555-650 高雄 0800268-266
By Tiffany Lin Chromotek 這間公司在 2007 年創立於德國, 公司成立時最主要目的是要開發出取代傳統抗體法來做螢光蛋白免疫沉澱實驗的工具, 依據此原則而開發出的技術稱為 Chromobody Chromobody 一推出, 馬上將螢光蛋白免疫沉澱實驗帶向另一種全新的境界, 除了縮短實驗的流程與時間外, 更大幅改善雜訊干擾影響實驗判讀的問題 Chromotek 更將 Chromobody 技術做為一種平台, 進而開發出一系列的相關產品 Chromotek 產品線 GFP-Trap RFP-Trap Booster Monoclonal-Ab Binding control 何謂 Chromobody 一般抗體的組成, 大多為由兩個 heavy chain 和兩個 light chain 所組成的一個大型的複合型分子, 分子量約為 150kDa, 基於抗原辨識位置的不同而有其專一性的結合力 由於傳統的抗體免疫沉澱法需要使用到大量的抗體來將目標蛋白抓下, 在抓下後要做確認實驗時, 往往都會在 SDS-PAGE 後的染膠結果發現嚴重的 heavy chain 和 light chian 的干擾, 導致實驗結果判讀不易 駱駝 (Camelidae) 在產生抗體的過程很特殊, 只會產生 heavy chain 的抗體, 不會有 light chain 的部分, 所以由駱駝生產的抗體稱為 hcabs,hcabs 的抗原決定位則稱為 single variable domain (VHH) Chromotek 的研究團隊發現此抗體的特殊性, 利用此特殊性來生產抗體 (GFP 和 RFP 抗體 ), 將 VHH 上的抗原辨識位置用特殊方法分離出來, 分離成分子量只有約 13kDa 的小片段 這些小片段則稱為 Chromobody Chromobody 可以和多種物質結合而產生不同功用, 例如和 agarose 或 magnetic beads 結合, 可以將目標 protein 抓下 ; 若是和螢光染劑結合, 則可以增強螢光的強度, 如此可以應用在多種實驗上, 例如 Pulldown assay Immunoprecipitation (IP) Co-IP Western Blot Mass spec 和 Chromatin-IP (Ch-IP) 等實驗 Chromobody 的特點 ( 和傳統抗體法相比 ) - 無 lot 間的差異性, 穩定性與實驗再現性極高 - 使用方便 - 可以大幅縮短實驗時間 - 至今已有多篇知名期刊發表使用 Chromotek 產品來研究螢光蛋白 Chromotek http://www.chromotek.com/home/index.html 6
Chromotek 研發團隊基於 Chromobody 的特性, 開發出多種產品 : GFP-Trap RFP-Trap Booster 等產品線, 這 些產品皆可以用於螢光融合蛋白免疫實驗上, 讓您可以花最短的實驗操作時間得到最佳的 data!! Agarose Magnetic beads GFP-Trap RFP-Trap 的特色 - 適用於 GFP-fusion / RFP-fusion protein 的觀察分析實驗 - Incubation 時間短, 只需 5-30 分鐘即可 - 適用於各種生物來源, 並可以量化產物 - 專一性強, 無 heavy & light chain 干擾 - 除了 IP 實驗之外, 亦可用於 Ch-IP 實驗 外觀 透明白色 深褐色 Protein dinding 量 (10uL Trap ) +++ 2-3ug GFP ++ 0.25-0.5ug GFP 專一性 ++ +++ Protein size limit A little No Background Some a little No 所需設備離心機磁座 [ 圖一 ] M 牌 左圖 : I: input (total protein) FT: flowthrough (un-binding protein) B: binding protein hc: heavy chain lc: light chain 右圖 : 為 M 牌的使用結果 使用 GFP-Trap 和傳統抗體法與 M 牌相比, 不論在 coomassie blue 結果與 western blot 結果, 除了 binding 到的 GFP-fusion protein 量較多之外, 背景值乾淨, 完全無 heavy & light chain 干擾 [ 圖二 ] gta: GFP-Trap Agarose gtm: GFP-Trap Magnetic beads 不論是 agarose 或是 magnetic beads 的 matrix, 皆可以抓到 GFP-fusion protein, 且可 以由 GFP 和 GFP-fusion protein 的相對位置, 來預估出未知蛋白的分子量 歡迎來信索取 GFP-Trap 的 Application Notes - For ChIP - For enzyme assays - Any experiment process problem 7 Chromotek http://www.chromotek.com/products/gfp-trap.html
GFP-multiTrap 為 Chromotek 研發團隊最新研發出的可以應於用大量篩檢 GFP-fusion protein 的利器, 一次可以篩選 96 個樣品, 可應用的實驗有 peptide, protein, DNA 或 RNA binding 原理 : ELISA 實驗原理偵測方法 : chemiluminescence and fluorescence detection, 波長為 450nm 特色 : - 不須離心 / 專一性高 / 每個 well 可結合 1ug GFP protein - plate 已經 pre-block, 可以直接使用 - 可以用於 protein-protein interactions / protein-dna interactions / protein-histone tail peptide interactions - 可以快速精準地從 cellular extracts 中抓出 GFP-fusion protein 並量化 protein 含量 產品資訊 Name Code Units Size Store GFP-Trap GFP-Trap _A gta-20 20 rxns 500uL 4 C Agarose particle size: ~80um gta-100 100 rxns 2.5mL 4 C gta-200 200 rxns 5mL 4 C gta-400 400 rxns 10mL 4 C GFP-Trap _A Kit gtak-20 20 rxns 含 buffer set 4 C Binding control Block agarose bab-20 20 rxns 500uL 4 C GFP-Trap _M gtm-20 20 rxns 500uL 4 C Magnetic beads particle size: 0.5-1um gtm-100 100 rxns 2.5mL 4 C gtm-200 200 rxns 5mL 4 C gtm-400 400 rxns 10mL 4 C GFP-Trap _M Kit gtmk-20 20 rxns 含 buffer set 4 C GFP-Trap gt-250 125ug / 250uL GFP purified protein 4 C GFP-multiTrap gtp-96 1 plate 1or 5 plate 4 C Binding control Block magnetic beads bmp-20 20 rxns 500uL 4 C Name Code Units Conc. Working dilution Application Rat mono-gfp Antibody 3h9 100ug 1mg/mL 1:1000 WB, ELISA Rat mono-pcna Antibody 16d10 100ug 1mg/mL 1:2000 WB, IP, Co-IP, IF Chromotek http://www.chromotek.com/products/ma.html 8
[ 圖三 ] RFP-Trap 的後續應用 - Pull-down assay - Immunoprecipitation (IP) - Co-IP - Mass spectroscopy - Enzyme activity measurements I: input (total protein) FT: flowthrough (unbinding protein) B: binding protein RFP-Trap 完全不會抓到 GFP protein, 所以若是一次要分離兩種螢光, 使用, 可以分別使用 GFP-Trap 和 RFP-Trap 使用 RFP-Trap 除了可以抓到 RFP-fusion protein 之外, 還可以抓到 DsRed 的各種螢光蛋白, 例如 mrfp1, mcherry, morange, mplum, mruby 等等的紅螢光蛋白 產品資訊 Name Code Units Size Store RFP-Trap RFP-Trap _A rta-20 20 rxns 500uL 4 C Agarose particle size: ~80um rta-100 100 rxns 2.5mL 4 C rta-200 200 rxns 5mL 4 C rta-400 400 rxns 10mL 4 C RFP-Trap _A Kit rtak-20 20 rxns 含 buffer set 4 C RFP-Trap _M rtm-20 20 rxns 500uL 4 C Magnetic beads Particle size: 0.5-1um rtm-100 100 rxns 2.5mL 4 C rtm-200 200 rxns 5mL 4 C rtm-400 400 rxns 10mL 4 C RFP-Trap _M Kit rtmk-20 20 rxns 含 buffer set 4 C RFP-Trap rt-250 125ug / 250uL RFP purified protein 4 C Name Code Units Conc. Working dilution Application Mouse mono-rfp Antibody 3h5 100ug 1mg/mL 1:1000 WB Rat mono-rfp Antibody 5f8 100ug 1mg/mL 1:1000 WB, IP, Co-IP, IF 9 Chromotek http://www.chromotek.com/products/rfp-trap.html
解決觀察細胞內 螢光不夠亮的方法 在觀察細胞內蛋白質位置或 transfection efficiency 時, 螢光蛋白是最多人使用的工具 但細胞內 GFP fusion protein 若是經由固定後, 其亮度並不足夠在 Super-Resolution Microscopy 下觀察 (ex: 3D- SIM 或 STED), 或是很多細胞實驗的處理, 例如 BrdU-Detection 會用 HCl 處理細胞 ; EdU-Click-iT TM 處理, 還有 FISH 實驗會用熱來 denaturation, 這些也都會影響螢光的訊號 所以 Chromotek 就生產了新產品可以增強螢光的訊號 GFP-Booster_Atto488 及 RFP-Booster_Atto594,Atto488 和 Atto594 為一種螢光染劑 ( 來自 ATTO-TEC 這間公司 ), 可以和 GFP 或 RFP 做專一性的結合而增強 GFP 的強度和穩定度, 加強觀察辨識度 Booster 的特色 - 可以增加 GFP 或 RFP 螢光的強度, 以利在顯微鏡下觀察 - GFP-Booster 的專一性極高, 可以認到 GFP 及其衍生物的螢光, 例如 egfp 和 eyfp, 但無法辨認到 ecfp - RFP-Booster 的專一性極高, 可以認到從 DsRed 衍生而來的 monomeric 紅螢光蛋白, 例如 mrfp1, mcherry, mplum, mruby, 但無法辨認到 GFP 與其衍生螢光蛋白 GFP-Booster_Atto488 ATTO 488 的 excition 為 480-510 nm,excitation 為 488 nm laser ( abs =501 nm) Fluorescence 的最有效率的觀察範圍為 520-560 nm ( fl =523 nm) [ 圖四 ] 在處理 EdU-ClickiT TM 後, 使用 GFP-Booster_Atto488 後的結果 RFP-Booster_Atto594 ATTO 594 的 excition 為 560-615 nm,excitation 為 561 nm laser ( abs =601 nm) Fluorescence 的最有效率的觀察範圍為 615-680 nm ( fl =627 nm) [ 圖六 ] 在 Hela cells 內染 mrfp-pcna, 經由 fixed 和 permeabilized 後使用 RFP-Booster_Atto594 後的結果 使用完 GFP-Booster_A488 後, 螢光亮度大大提升 [ 圖五 ] 使用完 GFP-Booster_A488 後, 螢光亮度大大提升 Wide field and structured illumination microscopy of mid stage intercellular bridge. The signal of CHMP4b-GFP (expressed under the endogenous promoter) is enhanced by the GFP-Booster. Microtubuli are stained with an anti-tubulin antibody (pictures kindly provided by L. Schermelleh). RFP-Booster_A594 除了 可以提升螢光強度之外, 還可以穩定螢光訊號 產品資訊 Name Code Units Conc. Store GFP-Boost_A488 gba-488 100ug 100ug (1mg/mL) 4 C ( 避光 ) RFP-Boost_Atto594 rba-594 100ug 100ug (0.2mg/mL) 4 C ( 避光 ) Chromotek http://www.chromotek.com/products/booster.html 10