1500 硅酸盐学报 2009 年 第 37 卷第 9 期 2009 年 9 月 硅酸盐学报 JOURNAL OF THE CHINESE CERAMIC SOCIETY Vol. 37, No. 9 September,2009 快释型磷酸钙骨水泥性能和释药机理 李茂红 1,2, 屈树新 2, 姚宁 2,3, 冯波 2, 郭悦华 2, 王岳峰 (1. 西南交通大学峨眉校区基础课部, 四川峨眉 614202;2. 西南交通大学材料科学与工程学院, 材料先进技术教育部重点实验室, 成都 610031;3. 西南交通大学生命科学与工程学院, 成都 610031) 1 摘要 : 磷酸钙骨水泥 (calcium phosphate cement,cpc) 是一种具有临床应用前景的抗生素载体材料, 但抗生素长期残留易导致发生耐药性, 本研究的目的是制备和表征快释型磷酸钙骨水泥 (fast-releasing calcium phosphate cement,frcpc), 并研究其快速释放机理 采用在 CPC 中加入易溶于水的物质制备 FRCPC, 测试其凝结时间 抗压强度 药物体外释放及释放过程中易溶于水的物质的溶出, 观察骨水泥断面微观形貌 结果表明 :FRCPC 初凝时间为 (8±0.33) min, 终凝时间为 (16±0.50) min, 抗压强度为 (2.6±0.23) MPa 药物体外释放结果表明:FRCPC 中的药物释放明显快于 CPC 中的, 能在 7 d 内完全释放 在药物释放不同时间点的 X 射线衍射谱和采用沉淀滴定法测试易溶于水的物质溶出量的结果均表明 :FRCPC 中, 易溶于水的物质迅速溶出, 与扫描电镜观察结果 (FRCPC 相对于 CPC 孔隙率增加和孔径增大 ) 相吻合, 利于 FRCPC 中药物快速释放 ; 且释放符合以扩散控释为主的 Higuchi 模型 FRCPC 可实现防止耐药性发生的目的, 通过进一步性能改进有望应用于临床 关键词 : 磷酸钙骨水泥 ; 快释 ; 性质 ; 释药机理 ; 孔隙率中图分类号 :O614.23;R944 文献标志码 :A 文章编号 :0454 5648(2009)09 1500 06 PROPERTIES AND DRUG RELEASE MECHANISM OF FAST-RELEASING CALCIUM PHOSPHATE CEMENT LI Maohong 1,2,QU Shuxin 2,YAO Ning 2,3,FENG Bo 2,GUO Yuehua 2,WANG Yuefeng 1 (1. Department of Basic Courses, Southwest Jiaotong University, Emei Campus, Emei 614202, Sichuan; 2. Key Lab of Advanced Technologies of Materials, Ministry of Education, School of Materials Science and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031; 3. School of Life Science and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031, China) Abstract: Calcium phosphate cement (CPC) is a promising antibiotic carrier in clinical use, but the long-term retention of antibiotic in the cement may cause the development of drug resistance. Therefore, the objective of this study is to prepare a fast-releasing CPC (FRCPC) and characterize its material properties and in vitro drug release mechanism. The FRCPC was prepared by incorporation of a soluble component into CPC. The setting time, compressive strength, in vitro drug release, dissolution of the soluble component, and the morphology of the fracture surface were studied. The FRCPC shows initial and final setting times of (8±0.33) min and (16±0.50) min, and a compressive strength of (2.6±0.23) MPa. The in vitro release from the FRCPC is completed within 7 d, which is significantly faster than the control CPC. X-ray diffraction and the dissolution quantity of the soluble component which was determined by the precipitation titration found a rapid dissolution of the soluble component during the in vitro release, and scanning electron microscope results reveal a higher porosity and larger pore size compared with the control CPC. These observations all indicate an accelerated drug release. The release kinetics follow Higuchi s diffusion control model. The FRCPC may prevent the development of drug resistance and may be used in clinical applications. Key words: calcium phosphate cement; fast-releasing; property; drug release mechanism; porosity 随着人口老龄化及骨科疾病的增加, 以及现代社会工业 交通和体育等事业发展带来的骨科创伤的增多, 常需进行外科手术植入骨填充材料, 并给 予抗生素防止术后感染 临床常通过口服或注射等给药方式经血液循环将药物传送至全身各部位, 但因受损部位血管受到严重损坏, 使药物不易通过血 收稿日期 :2009 03 14 修改稿收到日期 :2009 06 02 基金项目 : 西南交通大学峨眉校区基金 (10801X10096010); 教育部新世纪人才基金 (NCET 05 0797) 及国家自然科学基金 (30470484) 资助项目 第一作者 : 李茂红 (1977 ), 女, 博士研究生 通信作者 : 屈树新 (1967 ), 女, 博士研究生导师, 教授 Received date: 2009 03 14. Approved date: 2009 06 02. First author: LI Maohong (1977 ), female, postgraduate student for doctor degree. E-mail: sclimaohong@sohu.com Correspondent author: QU Shuxin (1967 ), female, professor. E-mail: qushuxin@home.swjtu.edu.cn
第 37 卷第 9 期 李茂红等 : 快释型磷酸钙骨水泥性能和释药机理 1501 液循环到达受损部位, 难以达到预防感染需要的有效浓度, 加大给药剂量又易给其他部位造成药物毒性 局部给药不仅可以实现在受损部达到较高的药物浓度而实现预防感染的目的, 而且可以减小药物用量, 从而减轻药物对机体的副作用 [1] 磷酸钙骨水泥可自行凝结 任意塑型, 产物是与骨无机成分类似的羟基磷灰石, 且其制备过程不需经受高温, 故可引入多种药物, 使其成为适宜的骨科药物载体材料 [2] 载抗生素的磷酸钙骨水泥因其既可实现骨缺损填充, 又可实现药物局部释放, 有利于感染的预防和治疗而被广泛研究 为防止耐药性发生, 骨水泥中抗生素需 7 d 内完全释放 [3 4] [5] Joosten 等研究发现 :60 d 后, 仍然有庆大霉素从 [6] 骨水泥中释放出来 Hamanishi 等研究发现 : 万古霉素从骨水泥中释放一直持续了 9 周 一些常用于预防葡萄球菌感染的抗生素, 如 : 吉他霉素 麦白霉素 环丙沙星等又均难溶于水, [7 8] 常常难以在 7 d 内释放完全, 易导致发生耐药性 ; 因此, 临床治疗中需要研发能够快速释放药物的磷酸钙骨水泥, 以防止抗生素残留导致发生耐药性 为调节骨水泥中药物释放速率, 一些研究者通过改变其某一参数或添加药物辅料调节骨水泥中药 [9 10] 物的释放 Bohner 等采用改变骨水泥微观结构来调节药物释放速率, 还采用添加药物辅料方法实 [11 12] 现药物进一步缓慢释放 Otsuka 等已通过改变固 / 液比和水泥厚度来调节药物释放 迄今为止, 还未见在骨水泥中添加辅料增大药物释放速率和缩短药物释放时间的报道 实验拟通过在骨水泥中加入不与骨水泥发生反应的易溶于水的物质, 制备快释型磷酸钙骨水泥 鉴于钠离子和氯离子分别是细胞外液的主要阳离子和主要阴离子, 具有参与机体酸碱平衡的调节, 维持细胞外液的渗透压和容量, 维持神经肌肉的正常兴奋性等功能, 而且过量的氯化钠可通过肾脏有效排出 ; [13] 因此, 在总量不太高的情况下, 具有较好的生物相容性 实验选择氯化钠作为易溶物模型, 难溶于水的氯霉素作为难溶抗生素的模型制备快释型磷酸钙骨水泥 ; 研究该骨水泥凝结时间 抗压强度和药物释放行为, 并通过研究释放过程材料成分变化和材料断面微观形貌揭示其释放机理 1 实验 1.1 快释型磷酸钙骨水泥的制备 采用 D 型磷酸钙骨水泥配方, 固相为按质量 ( 下 同 ) 比将 α- 磷酸三钙 58% 磷酸氢钙 25% 碳酸钙 8.5% 羟基磷灰石 8.5% 混合的粉末, [14] 同时, 在固相中加入由晶粒状氯化钠溶解后再冷冻干燥获得的粉末状氯化钠 实验采用在骨水泥固相中加入 20% 的氯化钠 ( 所有粉末原料粒径均小于 75 μm), 再加入氯霉素, 氯霉素在固相中含量为 5%; 骨水泥液相为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠浓度均为 0.1 mol/l 的混合水溶液 ; 液固比为 0.2 ml/g 固化前, 固相先用漩涡混合器振荡 12 h, 使固相成分充分混合均匀, 固 液相混合调和成浆体后充入圆柱形塑料模具中, 加一定压力排除气泡, 将样品置于 37 相对湿度为 100% 的恒温培养箱中养护 24 h, 制得快释型磷酸钙骨水泥 (fast-releasing calcium phosphate cement,frcpc) 以相同方法 材料和比例制备的未添加氯化钠的载氯霉素磷酸钙骨水泥作空白对照, 称为普通型磷酸钙骨水泥 (calcium phosphate cement,cpc) 1.2 性能表征 [14] 参照 Khairoun 等采用的 Gilmore 针双针法测试凝结时间 采用质量为 112 g, 直径为 5 mm 的 Gilmore 针测试初凝时间, 小心地把压头垂直降落到固相和液相混合调和物表面, 直至表面不能观察到明显圆形压痕所需时间即为初凝时间, 每组测 3 个样品并取平均值 用质量为 300 g, 直径为 1 mm 的 Gilmore 针测试终凝时间, 直至表面不能观察到明显圆形压痕所需时间即为终凝时间 用万能材料试验机测定样品的抗压强度, 测试前将样品两端磨平, 尺寸为 φ 8 mm 16 mm 加载速率为 1 mm/min, 每组测 3 个样品并取平均值 1.3 体外释放及释放机理将 FRCPC 和 CPC 样品放入离心试管中, 加入 25 ml 磷酸盐缓冲溶液 (phosphate buffer solution, PBS 溶液,pH = 7.4), 置于温度为 37 振荡速率为 100 r/min 的恒温水浴振荡器中 在预定时间点, 用相同体积的 PBS 溶液替换试管内的溶液, 用 UV 1901 型紫外 可见分光光度计 (ultraviolet visible spectrophotometer,uv Vis) 测定氯霉素吸光度值 (λ max = 277.5 nm), 以 PBS 溶液作空白对照, 根据氯霉素标准曲线计算其累积释放量 用沉淀滴定法测定释放溶液中氯离子浓度 由于酸性条件可消除 PBS 溶液中磷酸根离子的影响, 实验采用酸性条件下的 Volhard 法测定 [15] 用 X Pert 型 X 射线衍射 (X-ray diffraction,xrd) 仪测定 FRCPC 释放 0 4 h 和 7 d 的物相成分, 研究
1502 硅酸盐学报 2009 年 FRCPC 中氯化钠的残留情况 XRD 测试条件 : 铜靶, 波长为 0.154 nm, 电压为 40 kv, 电流为 40 ma, 扫描范围为 2θ=20 ~50 分别将 FRCPC 药物释放 0 4 h 和 7 d 后的样品在 120 烘干, 切开得到自然断面, 用导电胶将样品粘在铜托盘上, 再进行喷金处理, 用 Quanta 200 型扫描电子显微镜 (scanning electron microscope, SEM) 观察 FRCPC 和 CPC 样品断面微观形貌 2 结果与讨论 2.1 骨水泥凝结时间和抗压强度 表 1 为 FRCPC 和 CPC 的凝结时间和抗压强度 符合临床应用的磷酸钙骨水泥需要初凝时间 (t i ) 范围 :4 min t i 8 min, 终凝时间 (t f ) 范围 :10 min t f 15 min [16] 从表 1 可知 :FRCPC 因加入氯化钠使初凝和终凝时间延长, 略超过临床应用所需范围, 主要原因可能是加入的氯化钠也算作固相的一部分, 当固 液相混合时, 氯化钠易溶于水, 导致骨水泥固 / 液比减小, 使凝结时间延长 为了符合临床应用需要, 可通过改变液相成分 适当增大固 / 液比等方法缩短凝结时间 [17 19] FRCPC 中加入氯化钠后, 其抗压强度明显降低, 略低于松质骨的, [20] 氯化钠溶出后, 导致抗压强度进一步降低, 限制了 FRCPC 的应用, 使其仅能用于非承力部位的骨填充 通过改变液相成分, 如采用聚羧酸溶液 [17] 柠檬酸溶液, [19] [21] 加入纤维等方法, 可以改善 FRCPC 抗压强度下降的问题 ; 同时, 氯化钠溶出增大了骨水泥孔隙率和孔径 ( 见 2.4 节 ), 将有利于骨水泥植入机体后, 促进新生骨组织长入, [22] 可部分抵消 FRCPC 抗压强度降低的不足 表 1 FRCPC 和 CPC 凝结时间和抗压强度 Table 1 Setting time and compressive strength of FRCPC and CPC Sample Initial setting time/min Final setting time/min Compressive strength/mpa CPC 3.0±0.16 8.0±0.33 8.9±0.25 FRCPC 8.0±0.33 16.0±0.50 2.6±0.23 CPC Calcium phosphate cement; FRCPC Fast-releasing calcium phosphate cement. 2.2 骨水泥中药物的体外释放图 1 为载氯霉素的 FRCPC 和 CPC 中, 氯霉素累积释放量随时间变化的关系曲线, 可以看出, 药物释放大致可分为 3 个阶段 : 图 1 FRCPC 和 CPC 中氯霉素体外累积释放随时间变化曲线 Fig.1 Variation curves of in vitro cumulative release of chloromycetin from FRCPC and CPC with time 1) 释放的第 1 阶段, 即 4 h 以内,FRCPC 和 CPC 中药物释放没有大的差异, 这可能主要与骨水泥表面的药物迅速释放有关 2) 释放的第 2 阶段, 从 FRCPC 中释放出的药物量明显多于从 CPC 中释放的, 而且此阶段 CPC 持续了 48 h, 累积释放达 43.1%, 而 FRCPC 则延长至 120 h, 累积释放达 94.2%, 明显高于对照组的 此阶段的药物释放可能主要来源于距离表面较近药物的释放, 比较而言,FRCPC 中药物释放较快且延续时间较长, 可能归因于氯化钠溶出留下的更大孔隙率和孔径 ( 见图 5), 增大了药物与溶液的接触面积 3) 释放的第 3 阶段, 可称为慢速释放阶段, 此阶段释放出的药物可能是距离表面较远的药物 尽管第 3 阶段的释放比较缓慢, 但 FRCPC 中药物在 7 d 后释放达 100%, 表明 FRCPC 中药物能在 7 d 内完全释放, 满足临床预防感染而又不致导致产生耐药性的需要 对骨水泥这类基质型药物扩散体系的药物释放动力学,Higuchi 等建立了如下模型 : [23] Di M t = A C ε s (2 Cd εcs) t τ 其中 :M t 指在 t 时刻从骨水泥中释放出的药物量 ; A 代表药物的表面积 ;D i 代表药物扩散率 ;C s 代表药物溶解度 ;C d 代表药物浓度 ;τ 代表了基质弯曲率 ;ε 代表基质的孔隙率 在假稳态下, 药物在基体中的 M t 与 t 1/2 成正比 图 2 为 FRCPC 中, 氯霉素体外累积释放对 Higuchi 模型的拟合曲线, 可以看出 : 直至累积释放率达 70% 左右, 氯霉素累积释放量与时间平方根 (t 1/2 ) 对应具有良好的线性关系, 其线性相关系数
第 37 卷第 9 期 李茂红等 : 快释型磷酸钙骨水泥性能和释药机理 1503 图 2 FRCPC 中氯霉素体外累积释放对 Higuchi 模型的拟合曲线 Fig.2 Fitting curve of in vitro cumulative release of chloromycetin from FRCPC fitted to the Higuchi model 图 4 FRCPC 在药物释放 0 4 h 和 7 d 时 XRD 谱 Fig.4 X-ray diffraction (XRD) spectra of FRCPC after 0,4 h, and 7 d of in vitro release Special diffraction peaks of NaCl. R = 0.993, 即与 Higuchi 模型吻合程度较好 由此推断 : 释放的决速步骤仍是药物在骨水泥微孔中的扩散 2.3 氯化钠的溶出图 3 为氯化钠累积溶出量随时间的变化曲线, 可以看出 : 氯化钠的溶出主要是在最初的 4 h( 约 70%) 内, 未释放的部分可能残留在骨水泥内部较深处, 随时间的推移而逐渐全部溶出 这也可从图 4 的 FRCPC 在浸泡不同时间点的 XRD 谱看出 : 根据氯化钠 (JCPDS 卡 050628) 的衍射主极大和次极大分布在 (200) 和 (220) 晶面, 磷酸钙骨水泥的水化产物羟基磷灰石的衍射主极大在氯化钠 (200) 晶面附近, 因此, 可以以 (220) 晶面衍射强度作为判断氯化钠含量的依据 从图 4 可见 :4 h 时, 在 (220) 晶面处的衍射峰强度已较弱, 说明此时氯化钠含量已较少 ; 而 7 d 后, 此处衍射峰已完全消失, 说明 NaCl 在 7 d 图 3 FRCPC 中氯化钠累积溶出随时间变化 Fig.3 Variation of cumulative dissolution of NaCl with time 内完全溶出 从上述结果和分析可以看出 :FRCPC 中氯化钠主要是在 4 h 内溶出, 而药物在 4 h 内仅释放出 19.1%, 说明药物的释放和氯化钠的溶出释放并非同步 ; 因此, 药物的释放不是由基质降解而导致药物快速释放的基质降解型释放, 结合其释放仍然满足 Higuchi 模型, 推测其快速释放可能是由于氯化钠溶出而导致 FRCPC 微观结构变化, 其释放仍以扩散控释为主 2.4 骨水泥的微观结构图 5 为 CPC 和 FRCPC 浸泡不同时间点的断面微观结构形貌, 可以看出 : 浸泡 4 h 和 7 d 后, 虽然在 CPC 中有一些较大的凹陷, 如图 5 中 ( ) 所示, 同时也可见断面上有一些凸出的颗粒, 如图 5 中 ( ) 所示, 初步推测这些凹陷或凸出的颗粒系制备自然断面时一些颗粒被剥离所致 比较图 5 各图片可以看出 : 在释放进行 4 h 和 7 d 时,FRCPC 的孔隙率和孔径明显多于 CPC 的, 导致 FRCPC 比表面积明显增加, 使 FRCPC 与释放液接触面积增加, 并缩短药物扩散溶出所经历的路径, 实现药物的快速释放, 使其具有更好的骨传导性, 也将有利于植入机体后新生骨组织的形成 [22] 综合上述实验结果表明 : 快释型磷酸钙骨水泥中药物释放符合 Higuchi 模型, 能在 7 d 内完全释放, 而且氯化钠溶出留下的孔将有助于新生骨组织长入 ; 但是, 氯化钠加入导致凝结时间延长 抗压强度降低, 而这些性能的变化又可通过改变液相成分 增大固 / 液比等得到改善, 有望符合临床应用需要 考虑到氯化钠总量较多, 则可能导致生物相容性较差, 在临床使用中可以考虑采用几种易溶物, 如硝
1504 硅酸盐学报 2009 年 图 5 CPC 和 FRCPC 药物释放 0 4 h 和 7 d 断面 SEM 照片 Fig.5 Scanning electron microscope (SEM) photographs of cross-section of CPC and FRCPC after 0, 4h and 7 d of in vitro release 酸钾 碳酸氢铵 蔗糖 葡萄糖等的混合物, 添加到骨水泥中, 制备快释型磷酸钙骨水泥, 这样可进一步增加安全性, 有望应用于临床 3 结论 1) 快释型磷酸钙骨水泥凝结时间略长于临床应用需要, 但是其抗压强度偏低, 只能用于非承力骨的填充, 其性能还有待进一步改善 2) 快释型磷酸钙骨水泥通过易溶物迅速溶出使孔隙率和孔径增大, 导致比表面积增大, 加快药 物释放, 实现抗生素在 7 d 内完全释放而满足临床预防感染又不至产生耐药性的需要, 且释放基本符合以扩散控释为主 Higuchi 模型 参考文献 : [1] QUEIROZ A C, SANTOS J D, MONTEIRO F J, et al. Adsorption and release studies of sodium ampicillin from hydroxyapatite and glassreinforced hydroxyapatite composites [J]. Biomaterials, 2001, 22: 1393 1400. [2] GINEBRA M P, TRAYKOVA T, PLANELL J A. Calcium phosphate cements as bone drug delivery systems: a review [J]. J Control Release,
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