molecular biology Thermo Scientific Phusion DNA 聚合酶 用于强劲 准确 快速 PCR 扩增的聚合酶
升级至高性能 PCR 的金标准 自 2003 年问世以来,Thermo Scientific Phusion 高保真 DNA 聚合酶已经建立起了高性能 PCR 的金标准 Phusion 产品已经在上千的文献中被引用, 已经成为多种应用中聚合酶的第一选择, 如全基因组的重建 1 2 设计及大规模平行 高通量测序 3 在 Phusion 高保真 DNA 聚合酶中, 一个 DNA 结合域融合到类热球菌 (Pyrococcus) 具有校对功能的聚合酶上 借助这种独特的融合技术,Phusion DNA 聚合酶以一般单酶无法企及的准确率和速度合成 PCR 产物, 即使是扩增复杂模板 除此之外,Phusion DNA 聚合酶对多种抑制剂具有耐受性, 只需极少的优化步骤便可进行 PCR 的有效扩增 对于热启动 PCR, 具有高度特异性和极强聚合能力的 Thermo Scientific TM Phusion TM Hot Start II High-Fidelity DNA 聚合酶是理想的选择 Phusion DNA 的持续合成能力大约是 Pfu DNA 聚合酶的 10 倍以上, 是 Taq DNA 聚合酶的两倍 极高的持续合成能力使得延伸时间缩短 扩增功能更强劲, 可在较短时间内对长片段模板 ( 长达 20 kb) 进行扩增 相比于传统的校正聚合酶,Phusion DNA 聚合酶用量更少, 产量更高 特点 高保真度 保真度为 Taq 酶的 52 倍,Pfu 的 6 倍 功能强劲 更高的成功率, 更少的优化步骤 快速 增强的持续合成能力缩短了反应时间 ( 延伸速度 15-30 s/kb) 产量高 更少的酶, 更高的产量 (0.5-1 U/50 μl 反应 ) 高特异性 独特的热启动技术, 实现零时间激活, 减少非特异性扩增和引物降解 简化实验流程 使用 Phusion Green DNA 聚合酶,PCR 产物可以直接上样凝胶电泳 应用 高保真 PCR 快速 PCR 热启动 PCR 长片段 PCR ( 长达 20 kb) 高通量 PCR Thermo Scientific TM Phusion TM 绿色规格产品结合了 Phusion DNA 聚合酶和 5 x Green 反应缓冲液 这种缓冲液含有一种高密度试剂和两种示踪染料, 用于 PCR 产物的直接凝胶上样 这种绿色缓冲液不会干扰 Phusion DNA 聚合酶的活性, 且与下游实验兼容, 包括 DNA 测序 连接和限制性酶切 了解更多请访问 thermofisher.com/phusion
高保真度在许多分子生物学实验中, 包括克隆 定点突变和 DNA 翻译, 保证 PCR 扩增中 DNA 序列的精确性尤为重要 一个错误整合的核苷酸可能改变各自的密码子, 在翻译过程中导致错误氨基酸的插入 如此相应的也会影响蛋白质的折叠和功能特性 此外, 单个核苷酸的缺失也能破坏正确的阅读框 Phusion DNA 聚合酶在现有的热稳定酶中具有最高的保真性 Phusion DNA 聚合酶的错配率是通过一种修正的基于 laci 的方法进行测定的 4, 该酶的错配率比 Taq DNA 聚合酶的低 50 倍, 比 Pfu DNA 聚合酶的低 6 倍 ( 图 1) 成功扩增长达 20 kb 的目的片段 Phusion DNA 聚合酶是长片段 PCR 扩增的理想选择 该酶的持续合成能力使其可以扩增不同大小的模板 即使扩增 20 kb 的片段也具有很高的产量 较短的循环时间和高保真度 20 kb ( 病毒 ) 7.5 kb ( 基因组 ) M PG P A B C PG P A B C M 最近已使用 454 测序 5 和 Illumina 测序方法 3, 验证了 Phusion DNA 聚合酶的低错配率 ( 表 1) PG: Phusion 绿色高保真 DNA 聚合酶 P: Phusion 高保真 DNA 聚合酶 A C: 其它供应商的校正 DNA 聚合酶 M: Thermo Scientific ZipRuler Express DNA Ladder 2 图 2. 获得高产量的长片段 PCR 产物 使用 Phusion DNA 聚合酶和其它供应商的校正 DNA 聚合酶分别扩增 20kb 的 λdna 片段和 7.5 kb 的人类基因组 DNA 片段 52x Taq Phusion DNA 聚合酶 32x Taq 基于 Pfu 的融合 DNA 聚合酶 8x Taq 7x Taq 1x Taq Pfu KOD Taq 使用少量的酶也能进行有效的扩增 Phusion DNA 聚合酶的独特结构使其具有极高的效率 与普通聚合酶相比, 进行任意 PCR 扩增所需的酶单位数明显减少 快速和高效使得在最短的时间里可得到很高的产量 除此之外,Phusion 聚合酶功能强劲, 最大程度地减少了优化反应的时间 图 1. 不同 DNA 聚合酶的相对保真度 保真度 = 1 / 错配率 Pfu (5 U) 修饰的 Pfu (2.5 U) Phusion DNA 聚合酶 (1 U) KOD (%) Phusion Pt Taq (%) Expand FastStart SequalPrep Long (%) PfuUltra 1 min 1 min 30 s 3 min 50 s 7 min 40 s 1 min 1 min 30 s 3 min 50 s 7 min 40 s 1 min 1 min 30 s 3 min 50 s 7 min 40 s Overall error rate a 0.21 0.11 0.34 0.25 0.23 0.29 0.23 Insertions 0.10 0.07 0.14 0.11 0.11 0.11 0.12 Deletions 0.06 0.02 0.08 0.07 0.05 0.06 0.05 Substitutions 0.01 0.01 0.07 0.04 0.03 0.07 0.01 Dots or Dot b 0.04 0.01 0.05 0.04 0.04 0.05 0.05 表 1. 不同 DNA 聚合酶的错配率 对人类 TP53 致癌基因的四种不同外显子进行 PCR 扩增后, 通过 454 测序检测七种不同 DNA 聚合酶的错配率 使用 TP53 质粒作为起始模板 a 错配率, 错配数量 ( 错配碱基, 插入或缺失的碱基 ) 除以总碱基数 b 点突变, 在 454 测序中表现出的三个连续的 negative flows 图 3. 所用酶量更少, 效率更高 用三种不同 DNA 聚合酶扩增人类 ß 球蛋白基因中的 3.8 kb 的片段 使用 Phusion DNA 聚合酶, 采用合并的 1 分钟退火延伸步骤即可扩增 3.8 kb 的基因组片段, 从而使其比所测试的其它聚合酶更加快速 一个单位的 Phusion DNA 聚合酶比 2.5 或 5 个单位的 Pfu DNA 聚合酶具有更高的产量
高特异性的热启动 PCR Phusion Hot Start II 高保真 DNA 聚合酶是具有高准确性的热启动 DNA 聚合酶 它将 Phusion DNA 聚合酶和一个可逆结合 特异性的 Affibody TM 配体结合 Affibody 配体在室温下抑制 DNA 聚合酶的活性, 因此能阻止非特异性产物的扩增 另外, 可在室温条件下配制反应体系使其可用于高通量的机械化操作 Affibody 配体也能抑制聚合酶的 3-5 核酸外切酶活性, 避免在反应体系配制过程中引物和模板 DNA 的降解 在聚合温度下, 该配体被释放, 使聚合酶具有完全活性 在 PCR 过程中,Phusion Hot Start II DNA 聚合酶在高温下可瞬时激活, 无需单独的激活步骤 高保真快速 PCR 相比于其它聚合酶,Phusion DNA 聚合酶每次结合会整合更多的核苷酸 其高持续合成能力使得延伸时间极短, 从而减少整个实验流程的时间 使用 Thermo Scientific TM Phusion TM Flash High-Fidelity PCR 预混液, 一种专为快速 PCR 开发的产品, 可在最短的时间完成实验流程 60 50 40 1.7 kb 2.2 kb 2.3 kb (GC-rich) M P A B C D MP A B C D MP A B C D 分钟 30 20 10 0 快速 Taq 聚合酶 快速循环 基于 Pfu 的融合 DNA 聚合酶 快速 Taq 聚合酶 常规循环 基于 Pfu 的融合 DNA 聚合酶 图 6. 使用 Thermo Scientific 预混液,PCR 反应时间更短 P: Phusion Hot Start II 高保真 DNA 聚合酶 A D: 来自其它供应商的校正热启动 DNA 聚合酶 图 4. 高特异性和高产量 使用主要供应商的五种校正热启动 DNA 聚合酶扩增 1.7-2.3 kb 的人类基因组 DNA 片段 Phusion Hot Start II DNA 聚合酶可扩增出高产量的特异性产物, 而其它酶则扩增不出或只有极低的产量, 一些还能扩 增出非特异性的产物 60 s 45 s 30 s 20 s 10 s 基于 Pfu 的融合 DNA 聚合酶 60 s 45 s 30 s 20 s 10 s 快速 Taq 聚合酶 60 s 45 s 30 s 20 s 10 s 对高 GC 含量的模板也能进行强劲的扩增经优化的缓冲体系与该酶较强的持续合成能力协同作用, 使得 Phusion DNA 聚合酶可扩增很宽范围的不同序列 DNA 模板 能有效的扩增难以扩增的片段, 如 85% GC 含量的模板, 展示了该酶高效的高保真扩增能力 M P A P A P A P A M 38% 65% 71% 85% 图 7. 使用 Thermo Scientific 预混液, 速度快, 产量高 使 用三种不同的聚合酶, 以不同的延伸时间 (10-60s), 在 Thermo Scientific Piko 热循环仪中扩增 1.5 kb 的人类 cathepsin K 基因 只有 预混液能在 10 和 20 s 这样短的延伸时间里扩增出 1.5 kb 的基因条带 相比 于所测试的其它酶, 其能扩增得到更高产量的特异性产物 P: Phusion 绿色高保真 DNA 聚合酶 A: 来自其它供应商的的高保真 DNA 聚合酶 M: Thermo Scientific FastRuler Middle Range DNA Ladder 图 5. 扩增不同序列组成的 DNA 片段 扩增四种不同 GC 含量的 DNA 片段 Phusion 绿色高保真 DNA 聚合酶能高产量地扩增出所有四种产物 相比之下, 竞争对手的高保真聚合酶难以有效扩增出 GC 含量丰富的产物
耐尿嘧啶 PCR 聚合酶 校正 DNA 聚合酶由于存在尿嘧啶结合域, 其能识别模板链中尿嘧啶残基, 阻止 DNA 的进一步合成, 从而使得校正 DNA 聚合酶不能扩增含尿嘧啶的模板 Thermo Scientific Phusion U DNA 聚合酶在尿嘧啶结合域处具有一个突变, 从而克服了这种限制 Thermo Scientific Phusion U 热启动 DNA 聚合酶保留了 Phusion 酶家族的所有强大的功能特性 高精确性 快速 可扩增长达 20 kb 的长扩增子和基于 Affibody 配体热启动的高特异性 应用 重亚硫酸盐转化的 DNA 的扩增 受损或陈旧 DNA 的扩增 残余污染控制 基于 Uracil-excision (USER) 的克隆方法 高性能多重 PCR Thermo Scientific Phusion U 多重 PCR 预混液可实现多个长达 2.5 kb 目的片段的同时扩增, 即使模板浓度和 GC 含量差异明显 对于任何模板 DNA, 该预混液都可进行快速 灵敏及耐抑制剂的多重 PCR 应用 基因分型 病原体检测 食品检测 遗传修饰生物的分析研究 微卫星序列扩增 M P A B C D M P A B C D E P: Thermo Scientific Phusion U 绿色多重 PCR 预混液 A D: 其它供应商的多重 PCR 预混液 M: Thermo Scientific GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder P: Phusion U 热启动 DNA 聚合酶 A: Phusion 类校正聚合酶 B D: 来自其它供应商的耐尿嘧啶校正 DNA 聚合酶 E: 热启动 Taq DNA 聚合酶 图 8. 对于含尿嘧啶的模板, 可获得最高的产量和特异性 使用五种不同的校正 DNA 聚合酶和热启动 Taq 聚合酶从重亚硫酸盐处理的人类基因组中扩增 798 bp 的片段 Phusion U 热启动 DNA 聚合酶能扩增得到高产量的特异性产物, 而其它酶则扩增产量低或者难以扩增, 一些酶还扩增出了非特异性产物 图 9. 短时间内进行高度多重 PCR 按照制造商的说明, 使用不同的多重 PCR 预混液从人类基因组 DNA 中同时扩增 19 个 DNA 片段 (73 2,527 bp) Phusion U 多重 PCR 预混液能扩增出所有 19 个片段, 且扩增速度最快 参考文献 : 1. Gibson DG et al. (2008) Complete chemical synthesis, assembly, and cloning of a Mycoplasma genitalium genome. Science 319:1215 1220. 2. Gibson DG et al. (2010) Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science 329:52 56. 3. Kinde I et al. (2011) Detection and quantification of rare mutations with massively parallel sequencing. PNAS 108:9530 9535. 4. Frey B, Suppmann B (1995) Demonstration of the Expand PCR System s greater fidelity and higher yields with a laci-based PCR fidelity assay. Biochemica 2:8 9. 5. Vandenbroucke I et al. (2011) Minor variant detection in amplicons using 454 massive parallel pyrosequencing: experiences and considerations for successful applications. Biotechniques 51:167 177. 当意识到在原来 1/4 的时间内可以实现同样多的循环扩增, 且价格仅仅 是比原来略高一点点, 我们毫不犹豫的选择了 Phusion 博士生生物科学部爱达荷州立大学,USA
酶特点和规格形式 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase High-Fidelity DNA Polymerase Phusion U Hot Start DNA Polymerase Phusion U Multiplex PCR Master Mix 特点 规格形式 平末端或 3 A 末端平末端平末端平末端平末端平末端 目的片段长度, 基因组 / 噬菌体 DNA 16/20 kb 16/20 kb 16/20 kb 20 kb 2.5 kb 热启动 No Yes Yes Yes Yes 推荐延伸时间 15 30 s/kb 15 30 s/kb 15 s/kb 15 30 s/kb 15 30 s/kb 与 Taq 保真度比较 52x 52x 25x 25x NA dutp 耐受性 No No No Yes Yes 酶 1 绿色缓冲液 2 预混液 3 完整试剂盒 4 1. DNA 聚合酶, 缓冲液,DMSO 和 MgCl 2 2. DNA 聚合酶随附绿色缓冲液, 其含有密度试剂盒和两种示踪染液, 用于 PCR 产物直接凝胶上样 3. 2X 预混液 4. 含有所有需要的 PCR 反应成分, 包括对照模板和引物 订购信息 产品规格货号 产品规格货号 Phusion 高保真 DNA 聚合酶和预混液 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Phusion Green High-Fidelity DNA Polymerase Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer Phusion High-Fidelity PCR Kit Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase Phusion Green Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase Phusion Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix High-Fidelity PCR Master Mix 100 U F-530S 500 U F-530L 100 U F-534S 500 U F-534L 100 x 50 µl rxns F-531S 500 x 50 µl rxns F-531L 100 x 50 µl rxns F-532S 500 x 50 µl rxns F-532L 50 x 50 µl rxns F-553S 200 x 50 µl rxns F-553L 100 U F-549S 500 U F-549L 100 U F-537S 500 U F-537L 100 x 50 µl rxns F-565S 500 x 50 µl rxns F-565L 100 x 50 µl rxns F-566S 500 x 50 µl rxns F-566L 100 x 20 µl rxns F-548S 500 x 20 µl rxns F-548L Phusion U DNA 聚合酶和预混液 Phusion U Hot Start DNA Polymerase Phusion U Green Hot Start DNA Polymerase Phusion U Hot Start PCR Master Mix 多重 PCR 预混液 Phusion U Multiplex PCR Master Mix Phusion U Green Multiplex PCR Master Mix 其它基于 Phusion 聚合酶的产品 100 U F-555S 500 U F-555L 100 U F-556S 500 U F-556L 100 x 50 µl rxns F-533S 500 x 50 µl rxns F-533L 100 x 50 µl rxns F-562S 500 x 50 µl rxns F-562L 100 x 50 µl rxns F-564S 500 x 50 µl rxns F-564L Phusion Site-Directed Mutagenesis Kit 20 rxns F-541 了解更多请访问 thermofisher.com/phusion 免费服务电话 :800 820 8982/400 820 8982 销售服务信箱 :sales-cn@thermofisher.com 技术咨询信箱 :LifeScience-CNTS@thermofisher.com 上海办事处电话 :021-61452000 北京办事处电话 :010-84461800 广州办事处电话 :020-38975100 成都办事处电话 :028-65545388 thermofisher.com For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. 2015 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific and its subsidiaries unless otherwise specified. Affibody is a trademark of Affibody AB. PfuUltra is a trademark of Agilent Technologies, Inc. FastStart and Expand are trademarks of Roche Diagnostics, Inc. CO126870 1015