80 基础研究 南方医科大学学报 J South Med Univ 0;() 沙眼衣原体 porf8 质粒蛋白克隆表达与定位 李忠玉 吴移谋 黄秋林 粟盛梅 周 洲 陈超群 钟光明 南华大学 微生物学与免疫学教研室 附属第一医院普腹外科 湖南 衡阳 400 美国德洲大学圣安东尼奥 生命科学研究中心微生物学与免疫学系 德州 789 摘要 目的 克隆表达沙眼衣原体 porf8 质粒蛋白 并在衣原体感染细胞中对其进行定位分析 方法 PCR 法扩增 porf8 基因 并将其定向插入 pgex-6p 载体构建原核表达重组体 pgex-6p/porf8 重组体转化 E.coli XLBlue 后经 IPTG 诱导 表达 porf8 融合蛋白 融合蛋白经 Glutathione Sepharose 亲和层析纯化后免疫 Balb/C 鼠 制备 porf8 多克隆抗体 应用 免疫荧光试验对 porf8 质粒蛋白进行定位 结果 porf8 基因全长为 744 bp 编码 47 个氨基酸残基 pgex-6p/porf8 在大肠杆菌中表达相对分子质量约为 54 000 的 GST-pORF8 融合蛋白 间接免疫荧光实验结果显示 porf8 在感染细胞中 的表达模式与主要外膜蛋白基本一致 而与衣原体蛋白酶样活性因子分布模式不同 结论 porf8 质粒蛋白定位于衣原 体菌体上 为衣原体菌体蛋白 该研究为进一步研究该蛋白的结构功能 阐明Ct的致病机制奠定了基础 关键词 沙眼衣原体 porf8质粒蛋白 基因克隆 定位 中图分类号 R74. 文献标志码 文章编号 67-454 0-80-05 Cloning and cellular localization of porf8 plasmid protein of Chlamydia trachomatis LI Zhong-yu, WU Yi-mou, HUNG Qiu-lin, SU Sheng-mei, ZHOU Zhou, CHEN Chao-qun, ZHONG Guang-ming Department of Microbiology and Immunology, Department of General Surgery, First ffiliated Hospital, University of South China, Hengyang 400, China; Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Health Science Center at San ntonio, San ntonio, Texas 789, US bstract: Objective To clone the plasmid protein porf8 of Chlamydia trachomatis and localize its expression in Chlamydia-infected cells. Methods porf8 gene was amplified and cloned into pgex-6p vector, and the porf8 fusion protein was expressed in E.coli XL Blue. fter purification with glutathione-conjugated agarose beads, the porf8 fusion protein was used to immunize BLB/c mice to generate polyclonal antibodies against porf8 protein. The antibodies obtained were used to localize the plasmid protein porf8 in Chlamydia-infected cells with immunofluorescence assay (IF). Results The porf8 gene 744 bp in length was successfully cloned and the GST fusion protein with a relative molecular mass of 54 000 was obtained. The cellular distribution pattern of the plasmid protein porf8 was similar to that of the major outer membrane protein (MOMP), a known C. trachomatis inclusion body protein, but not to that of chlamydial protease-like activity factor (CPF, a secreted protein). Conclusion The plasmid protein porf8 is localized on the bacterial organism as an inclusion body protein in C. trachomatis-infected cells. The cellular location of porf8 protein can potentially provide important insights into the pathogenesis of C. trachomatis. Key words: Chlamydia trachomati; porf8 plasmid protein; gene cloning; localization 沙眼衣原体 chlamydia trachomatis, Ct 属于衣原 体目 衣原体科 衣原体属 共有9个血清型 其中 B Ba C 血清型是引起沙眼的主要病原体 D~K 血清型 则可通过性传播途径 引起人类泌尿生殖道感染 在男 收稿日期 0-09- 基金项目 国家自然科学基金 097065 800 湖南省自然科学基 金 09JJ059 湖南省高校科技创新团队 湘教通[00]5号 Supported by National Natural Science Foundation of China (097065; 800). 作者简介 李忠玉 博士 副教授 E-mail: lzhy0@hotmail.com DOI: CNKI:44-67/R.007.096.005 网络出版时间 0--7 9:6:08 http://www.cnki.net/kcms/detail/44.67.r.007.096.005.html 性主要表现为非淋菌性尿道炎 前列腺炎 附睾炎 直肠 炎 在女性表现为子宫颈炎 输卵管炎 异位妊娠 不孕 - 症等疾病 L~L血清型主要侵犯腹股沟淋巴结 可引 起化脓性淋巴结炎和慢性淋巴肉芽肿 Ct是世界范围 内流行最常见的性传播疾病病原体之一 由于衣原体感 染患者常表现为无症状或轻微症状 致使该疾病不易被 发现而得不到及时治疗 使得感染反复迁延 造成进行 性 不可逆的病理损伤 因此 阐明 Ct 的致病机制 研 究Ct治疗靶点对保证人类健康具有十分重要的作用 本研究采用基因工程技术克隆并表达pORF8融合 蛋白 融合蛋白免疫小鼠制备 porf8 质粒蛋白特异性 多克隆抗体 用所制备的多克隆抗体用于研究 porf8
第 期 李忠玉, 等. 沙眼衣原体 porf8 质粒蛋白克隆表达与定位 8 质粒蛋白在衣原体感染细胞的定位, 结果证实 porf8 质粒蛋白定位于衣原体菌体上, 为衣原体菌体蛋白 该研究为进一步研究该蛋白的结构功能 阐明 Ct 的致病机制奠定了基础 材料和方法. 材料.. 细胞与菌株 Ct D 标准株 HeLa-9 细胞株为德克萨斯州大学圣安东尼奥医学医学研究中心 (UTHSCS) 钟光明教授实验室提供.. 主要试剂 HRP 标记的羊抗鼠 IgG Cy 或 Cy 标记的羊抗鼠抗体购自美国 Jackson Immuno Research pgex-6p 原核表达载体 Glutathione Sepharose 4B Beads 为美国 GE Healthcare 产品 ; 限制性内切酶 BamH I Not I pfxdn 聚合酶 DN 及蛋白相对分子质量标准等为 Invitrogen 产品 ;QuickClean PCR 纯化试剂盒 质粒提取试剂盒购自美国 Qiagen 公司. 方法.. porf8 基因原核表达载体的构建从 GenBank 中获取 Ct porf8 基因序列并设计引物,P 序列为 5'CGCGGTCCGTGCCTGG C,P 序列为 5'TTTTCCTTTTGCGGCCGCTCGCT CTTTTGCTTGTT, 在引物的 5' 加上 BamHⅠ 酶 NotⅠ 酶切位点及保护碱基 以 Ct 血清型 D 核酸为模版,PCR 扩增 porf8 基因,PCR 扩增产物经 BamH I Not I 酶切后, 插入经同样酶消化的 pgex-6p 原核表达载体中, 转化感受态大肠杆菌 XLBlue, 在含氨苄青霉素的 LB 培养基上挑取单个菌落, 小量提取质粒,PCR 筛选 BamHⅠ NotⅠ 双酶切及测序鉴定.. porf8 融合蛋白表达与纯化将鉴定后的阳性克隆接种于含 00 μg/ml 氨苄的 LB 培养液中,7 摇床培养过夜 次日以 00 的比例将过夜培养物扩大培养,IPTG 诱导大肠杆菌表达 porf8 融合蛋白 低速离心收集细菌, 重悬于含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液中, 超声破菌后高速离心, 上清经 Glutathione Sepharose 4B Beads 纯化得到 porf8 融合蛋白, 纯化的融合蛋白经 % SDS-PGE 电泳分析, 观察其表达情况和纯化效果.. 动物免疫与抗体制备 00 μg porf8 融合蛋白与完全弗氏佐剂超声乳化后, 腹腔免疫 BLB/c 小鼠, 初次免疫后的第 周,50 μg 融合蛋白与不完全弗氏佐剂超声乳化间隔 周以相同的免疫方式进行第 次免疫 第 次免疫后 7~0 d, 小鼠尾静脉采血, 测定抗体滴度, 当抗体滴度较高时, 小鼠眼眶放血, 分离血清,-0 保存备用..4 抗体特异性鉴定 ()Western blot 法鉴定抗 porf8 融合蛋白抗体的特异性 取等量纯化的 GST-pORF8 GST-MOMP( 主要外膜蛋白 ) GST-CPF ( 衣原体蛋白酶样活性因子 ) 蛋白加入 SDS 上样液, 00 加热 5 min 后, 000 r/min 离心后取 0 μl 行 %SDS-PGE 凝胶电泳, 以 00 V 恒电压转至 NC 膜上,5% 脱脂牛奶封闭后, 加入抗 porf8 抗体,4 过夜, 0.05% PBST 洗涤 次, 加入 HRP 标记的抗鼠抗体室温放置 h, 洗涤后加底物 ECL 显色,X 片曝光显影观察结果 ;() 间接免疫荧光鉴定抗 porf8 融合蛋白抗体的特异性 将本室已构建好的 pdsred/porf8 真核表达重组体转染 HeLa 细胞,pORF8 基因在 Hela 细胞中表达 RFP 融合蛋白, 以 porf8 抗体为一抗,Cy 标记的羊抗鼠抗体为二抗进行免疫荧光染色, 分析抗体的特异性..5 porf8 质粒蛋白定位分析间接免疫荧光试验分析 porf8 质粒蛋白在衣原体感染细胞中的定位情况 Ct 血清型 D 标准株感染 Hela 9 细胞并培养至 40 h, 依次经 % 的多聚甲醛 % Saponin 5% BS 处理后进行免疫荧光染色, 分别以兔抗衣原体抗体以及 Cy 标记的羊抗兔抗体染衣原体, 以抗 porf8 融合蛋白抗体和 Cy 标记的羊抗鼠抗体染 porf8 质粒蛋白,Hoechst 染核酸成分, 普通荧光显微镜下观察结果 结果. pgex-6p/porf8 原核表达载体的构建与鉴定以 Ct D 标准株核酸为模板,PCR 扩增 porf8 基因, 将该基因定向克隆至 pgex-6p 原核表达载体中构建 pgex-6p/porf8 重组体 以 pgex-6p/porf8 重组质粒为模板, 用 porf8 特异性引物进行进行 PCR 扩增, 可获得约 800 bp 大小的片段 重组体经 BamHⅠ Not I 双酶切后, 可切出 个大小不同的片段, 大片段约 4900 bp, 为载体片段, 小片段约 800 bp, 为 porf8 质粒基因片段, 与预期值相符合 ( 图 ), 重组质粒测序结果经 Blast 比较分析证实序列正确. porf8 融合蛋白表达与纯化 pgex-6p/porf8 重组质粒转化的 E.coli XLBlue,IPTG 诱导 porf8 融合蛋白的表达, Glutathione Sepharose 4B beads 纯化表达产物, 纯化产物经 % SDS-PGE 电泳分析, 发现重组质粒菌在约 54 000 位置处有一明显蛋白条带, 结果与预期 GSTpORF8 融合蛋白相对分子质量相符 (GST 相对分子质量为 6 000,pORF8 相对分子质量约为 8 000)( 图 ). 抗体特异性鉴定 Western blot 分析结果显示在 porf8 融合蛋白相对分子质量约 54 000 处出现了一条清晰的条带, 而在 CPF MOMP 蛋白处未出现任何条带 ( 图 ) 免疫荧光
8 南方医科大学学报 J South Med Univ 4 5 第 卷 Mr 54 000 bp 000 650 800 650 00 图 pgex-6p/porf8重组质粒鉴定结果 Fig. Identification of the recombinant plasmid pgex-6p/porf8. Lane : kb DN Marker; Lane : mplified fragment from pgex-6p/porf8; Lane : mplified fragment from pgex-6p; Lane 4: pgex-6p/porf8 digested by BamHI and NotI; Lane 5: pgex-6p digested by BamHI and NotI. 4 Mr 96 000 5 000 GST-pORF8 8 000 9 000 GST 图 porf8融合蛋白的表达与纯化 Fig. Expression and identification of porf8 fusion protein. Lane : Protein marker; Lane : Purified product from E.coli transformed with pgex-6p/porf8; Lane : Purified product from E.coli transformed with pgex-6p; Lane 4: Purified product from E.coli. 试验结果显示 porf8抗体均能识别 HeLa 细胞胞浆表 达的 RFP-pORF8 融合蛋白 但不识别 RFP 蛋白 图 4 提示pORF8抗体具有高度的特异性.4 porf8质粒蛋白定位分析 Ct 血清性 D 感染 40 h 后 间接免疫荧光观察 porf8在感染细胞中的定位 图4 porf8蛋白在感染 细胞中的表达模式与 MOMP 基本一致 而与 CPF 分 布模式不同 图5 提示pORF8质粒蛋白定位于衣原体 菌体上 图 Western blotting 鉴定 porf8 融合蛋白抗体特 异性鉴定 Fig. Identification of anti-porf8 fusion protein antibody by Western blotting. Lane : porf8 fusion protein; Lane : CPF fusion protein; : MOMP fusion protein. 讨论 Ct 具有独特的双相性发育周期 存在 种不同状 态 即感染性强但缺乏代谢活性的原体 Elementary body EB 和代谢活跃但无感染性的网状体 Reticulate body RB EB 通过肝硫素吸附于易感细胞表面而进 入细胞内形成包涵体 在包涵体内 EB 生长发育成 RB RB以二分裂形式繁殖 形成众多的子代RB 子代RB重 新转化为EB EB通过裂解细胞和胞粒外排两种形式释 放出细胞外 为逃避机体的免疫清除而维持在宿主细 胞包涵体内的正常生长 衣原体不仅从宿主细胞摄入营 4-5 养和代谢中间产物 而且必须分泌效应分子到宿主细 6-9 胞操纵宿主信号通路 已有研究发现Ct通过产生分 泌蛋白CPF降解宿主细胞转录因子RFX5及上游刺激 因子 0- 裂解角蛋白 8 的蛋白水解活性 抑制宿主 细胞 MHCⅠ MHC-Ⅱ类抗原表达 从而为衣原体提供 有利的生存环境 同时产生包涵体膜蛋白 IncG 与宿主 细 胞 4--β 结 合 而 4--β 可 与 Raf- PKC Cdc5C KSR Ca+/CaM 激酶 Bad 和跨膜蛋白受体等 多种信号蛋白结合发挥信号调节作用 因此 探讨衣原 体蛋白的亚细胞定位有助于了解衣原体致病机制 Ct 除了含有高度保守的基因组外 各血清型中均 存在一种约 7500 大小的隐蔽性质粒 该质粒共有 8 个 开放阅读框架(open reading frame ORF) 编码8种质粒 蛋白 分别命名为pORF~pORF8 研究证实质粒并不 是衣原体生长所必须的元件 但是质粒缺失菌可降低生 4-5 殖病变 说明质粒与毒力密切相关 事实上 质粒普 遍存在于衣原体的各个血清型中 而且在各型之间高度 保守 质粒在进化过程中的高度保守性的特性 提示质 粒具有某种重要的生物学功能 由于缺乏基因转移系
8 李忠玉,等.沙眼衣原体 porf8 质粒蛋白克隆表达与定位 第 期 m@porf8 DNHoechst 58 Tri-color overlay B C D E F G H pdsred Transfected with pdsred/porf8 RFP or RFP-pORF8 图 4 IF 鉴定 porf8 质粒蛋白抗体特异性鉴定 Fig.4 Identification of anti-porf8 fusion protein antibody by IF. Red: RFP-pORF8 fusion proein(a) or RFP(b); Green: nti-porf8 antibody staining; Blue: DN. MOMP porf8 Chlamydial proteins CPF B C D E F Overlay 图 5 porf8 质粒蛋白在感染细胞中的定位分析 Fig.5 Localization of porf8 plasmid protein in Chlamydia-infected cells. Red: Chlamydial proteins; Green: Inclusion body of Chlamydia trachomatis; Blue: DN 统 各质粒蛋白在疾病发生 发展中的作用仍不清楚 本研究通过基因重组方法在大肠杆菌中表达 porf8 融合蛋白 融合蛋白经纯化免疫小鼠后制备了 porf8 多克隆抗体 为分析融合蛋白抗体的特异性 用抗融合蛋白抗体进行Western Blot 分析 结果发现尽 管各融合蛋白都存在共同的 GST 序列 但是抗 porf8 融合蛋白抗体只特异性识别pORF8蛋白而不识别其他 衣原体蛋白 提示我们所制备的抗体能特异性识别 porf8 质粒蛋白 间接免疫荧光证实能抗 porf8 融合 蛋白抗体仅识别 RFP- porf8 而不是识别 RFP 蛋白 进一步说明了抗体具有高度特异性 使用特异性抗 porf8 融合蛋白抗体分析 porf8 质粒蛋白亚细胞定 位 我们发现 porf8 质粒蛋白在感染细胞中的表达模 式与定位于Ct菌体上的MOMP 基本一致 而与分泌蛋 白CPF分布模式完全不同 证实pORF8质粒蛋白分布 于衣原体菌体上 为衣原体菌体蛋白 porf8 质粒蛋 白定位之后是否与衣原体其他质粒蛋白发生相互作用 是否参与Ct致病过程 其机制如何 还将有待于我们
84 南方医科大学学报 (J South Med Univ) 第 卷 更进一步的研究 参考文献 : [] Mabey DC, Solomon W, Foster. Trachoma[J]. Lancet, 00, 69(979): -9. [] Brunham RC, Rey-Ladino J. Immunology of chlamydia infection: implications for a chlamydia trachomatis vaccine[j]. Nat Rev Immunol, 005, 5(): 49-6. [] Belland R, Ojcius DM, Byrne GI. Chamydia[J]. Nat Rev Microbiol, 004, (7): 50-. [4] Carabeo R, Mead DJ, Hackstadt T. Golgi-dependent transport of cholesterol to the Chlamydia trachomatis inclusion[j]. Proc Natl cad Sci U S, 00, 00(): 677-6. [5] Su H, Mcclarty G, Dong F, et al. ctivation of Raf/MEK/ERK/ cpl signaling pathway is essential for chlamydial acquisition of host glycerophospholipids[j]. J Biol Chem, 004, 79(0): 9409-6. [6] Zhong G. Chlamydia trachomatis secretion of proteases for manipulating host signaling pathways[j]. Frontiers Microbiol, 0, (): 4. [7] Li Z, Chen D, Zhong Y, et al. The chlamydial plasmid-encoded protein pgp is secreted into the cytosol of Chlamydia-infected cells [J]. Infect Immun, 008, 76(8): 45-8. [8] Qi M, Gong S, Lei L, et al. chlamydia trachomatis OmcB c-terminal fragment is released into the host cell cytoplasm and is immunogenic in humans[j]. Infect Immun, 0, 79(6): 9-0. [9] Zhong G, Fan P, Ji H, et al. Identification of a chlamydia-secreted protease factor[j]. J Exp Med, 00, 9(8): 95-4. [0]Fan P, Dong F, Huang Y, et al. Chlamydia pneumoniae secretion of a protease-like activity factor for degrading host cell transcription factors required for [correction of factors is required for] major histocompatibility complex antigen expression[j]. Infect Immun, 00, 70(): 45-9. []Zhong G, Fan T, Liu L. Chlamydia inhibits interferon gammainducible major histocompatibility complex class II expression by degradation of upstream stimulatory factor [J]. J Exp Med, 999, 89(): 9-8. []Dong F, Su H, Huang Y, et al. Cleavage of host keratin 8 by a Chlamydia-secreted protease[j]. Infect Immun, 004, 7(7): 86-8. []Scidmore M, Hackstadt T. Mammalian 4--beta associates with the Chlamydia trachomatis inclusion membrane via its interaction with IncG[J]. Mol Microbiol, 00, 9(6): 68-50. [4]Carlson JH, Whitmire WM, Crane DD, et al. The chlamydia trachomatis plasmid is a transcriptional regulator of chromosomal genes and a virulence factor[j]. Infect Immun, 008, 76(6): 7-8. [5]O'connell CM, Ingalls RR, ndrews CW Jr, et al. Plasmid-deficient Chlamydia muridarum fail to induce immune pathology and protect against oviduct disease[j]. J Immunol, 007, 79(6): 407-4. ( 编辑 : 吴锦雅 )