吉林农业大学学报 ２０１６ ３８ １ ８７ ９１ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｊｉｌｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｈｔｔｐ ｘｕｅｂａｏ ｊｌａｕ ｅｄｕ ｃｎ Ｅ ｍａｉｌ ｊｌｎｄｘｂ ｖｉｐ ｓｉｎａ ｃｏｍ 神 经 生 长 因 子 ｍｒｎａ 在 鹅 等 级 前 卵 泡 中 的 表达 刘璐璐 隋玉健 朱海洋 武惠岩 杨 辉 孙永峰 吉林农业大学动物科学技术学院 长春 １３０１１８ 摘 要 采用相对荧光定量 ＰＣＲ ＲＴ ＰＣＲ 相对标准曲线方法 对籽鹅和卡洛斯鹅不同产蛋时期初级卵泡 小白卵泡 中白卵泡和大白卵泡中神经生长因子 ＮＧＦ ｍｒｎａ 的表达量进行研究 同时检测血液中促卵泡素 ＦＳＨ 的含量 并与 ＮＧＦｍＲＮＡ 表达量进行相关性分析 结果表明 产蛋高峰期 籽鹅初级卵泡中 ＮＧＦ ｍｒｎａ 表达量极显著高于其他卵泡 Ｐ ０ ０１ 卡洛斯鹅初级卵泡中 ＮＧＦ ｍｒｎａ 表达量显著高于中白卵泡 Ｐ ０ ０５ 其余卵泡间差异不显著 产蛋末期 籽鹅初级卵泡中 ＮＧＦ ｍｒｎａ 表达量极显著高于中白卵泡和小白 卵泡 Ｐ ０ ０１ 大白卵泡 ＮＧＦ ｍｒｎａ 表达量极显著高于中白卵泡 Ｐ ０ ０１ 卡洛斯鹅初级卵泡 ＮＧＦ ｍｒｎａ 表达量极显著高于中白卵泡和小白卵泡 Ｐ ０ ０１ 大白卵泡极显著高于其他卵泡 Ｐ ０ ０１ ２ 种鹅产蛋高 峰期血液中 ＦＳＨ 表达水平高于产蛋末期 Ｐ ０ ０５ 籽鹅和卡洛斯鹅的小白卵泡 ＮＧＦ ｍｒｎａ 表达量与血液中 ＦＳＨ 的表达水平呈显著正相关 Ｐ ０ ０５ 在大白卵泡中两者呈负相关 其他卵泡呈正相关 关键词 神经生长因子 等级前卵泡 荧光定量 ＰＣＲ 中图分类号 Ｓ８３５ ２ Ｑ７８６ 文献标识码 Ａ 文章编号 １０００ ５６８４ ２０１６ ０１ ００８７ ０５ ＤＯＩ １０ １３３２７ ｊ ｊｊｌａｕ ２０１５ ２７１５ 引文格式 刘璐璐 隋玉健 朱海洋 等 神经生长因子 ｍｒｎａ 在鹅等级前卵泡中的表达 Ｊ 吉林农业大学学 报 ２０１６ ３８ １ ８７ ９１ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ｍｒｎａ ｉｎ Ｐｒｅ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ｆｏｌｌｉ ｃｌｅｓ ｏｆ Ｇｅｅｓｅ ＬＩＵ Ｌｕｌｕ ＳＵＩ Ｙｕｊｉａｎ ＺＨＵ Ｈａｉｙａｎｇ ＷＵ Ｈｕｉｙａｎ ＹＡＮＧ Ｈｕｉ ＳＵＮ Ｙｏｎｇｆｅｎｇ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｉｌｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３０１１８ Ｃｈｉｎａ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｐｒｅ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ ｏｆ Ｚｉ ｇｅｅｓｅ ａｎｄ Ｃａｒｌｏｓ ｇｅｅｓｅ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｍａｔｅｒｉ ａｌｓ Ｂｙ ＲＴ ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＮＧＦ ｉｎ ｐｒｅ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｅｒｉｏｄｓ ｗａｓ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙ ｓｔｕｄｉｅｄ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ ＦＳＨ ｉｎ ｔｗｏ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｇｅｅｓｅ ｂｌｏｏｄ ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ＦＳＨ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＮＧＦ ｗａｓ ｅｘｐｌｏｒｅｄ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ＮＧＦ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ ｏｆ Ｚｉ ｇｅｅｓｅ ｉｓ ｖｅｒｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｍｏｄｅｌｓ ｅｘｃｅｐｔ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｒｇｅｓｔ ｗｈｉｔｅ ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｉｎ ｐｅｅｋ ｐｅｒｉｏｄ Ｐ ０ ０１ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ＮＧＦ ｉｎ ｐｒｅ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ ｏｆ Ｃａｒｌｏｓ ｇｅｅｓｅ ｉｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｍｉｄｄｌｅ ｗｈｉｔｅ ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ Ｐ ０ ０５ Ｆｏｒ Ｚｉ ｇｅｅｓｅ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｌａｓｔ ｓｔａｇｅ ｏｆ ｌａｙｉｎｇ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａ ｍｏｕｎｔ ｏｆ ＮＧＦ ｉｎ ｐｒｅ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ ｉｓ ｖｅｒｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｍｉｄｄｌｅ ｗｈｉｔｅ ｆｏｌｌｉ 基金项目 吉林省留学回国人员择优资助项目 ２０１５ 吉林省重点科技攻关项目 ２０１５０２０４０２５ＮＹ 科技部星火重点计划项目 ２０１５ＧＡ６６０００１ 吉林省科技厅 三区 人才支持计划项目 ２０１５ 吉林省现代农业产业技术体系建设专项资金资助 项目 ２０１５３８ 作者简介 刘璐璐 女 在读硕士研究生 研究方向 分子遗传学与动物育种 收稿日期 ２０１５ ０６ １０ 通讯作者
88 吉 林 农 业 大 学 学 报 2016 年 2 月 cles (P<0 01). For Carlos geese, expression amount of NGF in large white follicles is very signifi cantly higher than that of other models (P<0 01). Expression amount of NGF in primary follicles of Zi geese peek period, the last stage of laying and Carlos geese peek period is very significantly high er than that of the last stage of Carlos geese (P<0 01). Expression amount of NGF in small white follicles in Zi geese and Carlos geese show significantly positive correlation with expression amount of FSH in serum (P<0 05). It shows a negative correlation with expression amount of FSH. And it shows a positive correlation with expression amount of FSH. Key words: NGF; pre hierarchical follicle; RT-PCR 鹅 的 季 节 性 繁 殖 和 就 巢 习 性 导 致 鹅 的 产 蛋 数 远 没 有 鸡 和 鸭 多, 这 一 原 因 与 卵 泡 发 育 机 制 和 相 关 激 素 的 调 控 有 关 神 经 生 长 因 子 (Nerve growth factor, NGF) 是 神 经 营 养 因 子 ( Neurotrophic fac tors, NTs) 家 族 中 的 一 员 [1 3] 早 先 的 研 究 发 现 NTs 的 主 要 作 用 是 促 进 中 枢 和 外 周 神 经 系 统 中 神 经 元 的 分 化 和 生 长, 随 着 对 非 神 经 系 统 领 域 的 进 一 步 研 究, 发 现 NTs 还 能 参 与 调 控 卵 泡 发 育 卵 泡 发 育 良 好, 也 有 利 于 提 高 鹅 的 产 蛋 数 人 们 在 鸟 类 早 期 胚 胎 中 检 测 到 NGF 及 其 受 体 TrkA 和 p75 NTR 的 表 达 [4] 小 鼠 不 同 发 育 阶 段 的 卵 母 细 胞 颗 粒 细 胞 都 存 在 NGF 及 其 2 个 受 体,NGF 还 可 促 进 原 始 卵 泡 的 形 成 [5], 由 此 推 测 NGF 可 能 参 与 调 控 卵 泡 的 发 育 但 是,NGF 在 鹅 等 级 前 卵 泡 中 的 表 达 情 况 尚 未 有 报 道 鹅 卵 泡 的 发 育 除 了 受 相 关 基 因 调 控, 还 与 体 内 激 素 调 节 有 关, 促 卵 泡 素 (FSH) 的 主 要 作 用 就 是 促 进 卵 泡 发 育 本 试 验 选 取 籽 鹅 和 卡 洛 斯 鹅 为 试 验 对 象, 拟 探 究 NGF mr NA 在 鹅 等 级 前 卵 泡 中 的 表 达 量 采 用 实 时 荧 光 定 量 方 法 测 定 各 级 卵 泡 中 NGF mrna 的 表 达 量, 发 现 NGF 在 不 同 等 级 卵 泡 内 均 有 表 达, 且 在 籽 鹅 中 的 表 达 量 要 高 于 卡 洛 斯 鹅 同 时 检 测 血 清 中 促 卵 泡 素 (FSH) 的 含 量, 并 将 两 者 进 行 相 关 性 分 析, 发 现 两 者 存 在 一 定 的 联 系, 但 具 体 机 制 尚 不 明 确 1 材 料 与 方 法 1 1 材 料 1 1 1 试 验 动 物 选 取 处 于 产 蛋 高 峰 期 和 产 蛋 末 期 的 籽 鹅 卡 洛 斯 母 鹅, 试 验 动 物 取 自 吉 林 农 业 大 学 种 鹅 场 1 1 2 主 要 试 剂 Prime Script TM RT Master Mix (RR036A) 反 转 录 试 剂 盒 peasy T1 Cloning Kit 购 自 大 连 宝 生 物 技 术 有 限 公 司,2 倍 Taq Master Mix (CW0682) PCR 反 应 酶 购 自 康 为 世 纪 生 物 有 限 公 司, AxyPrep 质 粒 DNA 小 量 提 取 试 剂 盒, AxyPrep DNA 凝 胶 回 收 试 剂 盒 购 自 爱 思 进 生 物 技 术 ( 杭 州 ) 有 限 公 司,Trans5αChemically Competent Cell(CD201) 感 受 态 细 胞 购 自 北 京 全 式 金 生 物 技 术 有 限 公 司,SYBR Premix Ex Taq TM ( RR420A) 荧 光 定 量 试 剂 盒 1 2 方 法 1 2 1 试 验 材 料 的 采 集 依 据 近 5 年 产 蛋 记 录, 分 别 在 母 鹅 繁 殖 高 峰 期 (4 月 25 日 ) 和 繁 殖 后 期 (5 月 30 日 )2 个 时 间 点 采 样,2 个 品 种 每 个 时 期 各 6 只, 宰 杀 后 先 采 血 后 采 集 卵 泡 鹅 卵 泡 按 直 径 大 小, 分 为 等 级 前 卵 泡 和 等 级 卵 泡, 等 级 前 卵 泡 为 研 究 的 样 本 等 级 前 卵 泡 按 照 直 径 大 小 分 为 初 级 卵 泡 ( 0 08 ~ 1 00 mm), 小 白 卵 泡 ( 1 00 ~ 4 00 mm), 中 白 卵 泡 (4 00 ~ 5 00 mm), 大 白 卵 泡 (5 00 ~ 8 00 mm) [6 8] 日 粮 按 美 国 NRC 2003 年 颁 布 的 鹅 营 养 标 准 饲 喂 1 2 2 血 液 激 素 测 定 方 法 采 用 放 射 免 疫 法 检 测 鹅 血 清 中 FSH 激 素 的 表 达 情 况, 所 用 试 剂 盒 (E12F0001) 由 上 海 蓝 基 生 物 科 技 有 限 公 司 提 供 1 2 3 模 板 的 制 备 采 用 常 规 的 RNAiso Plus 方 法 提 取 卵 泡 中 的 RNA, 并 检 测 OD 260/ 280 值 及 其 浓 度, 再 通 过 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 查 其 完 整 性 保 存 在 -20 备 用 采 用 宝 生 物 公 司 RR036A 反 转 录 试 剂 盒 进 行 反 转 录, 总 体 积 为 50 μl, 反 应 条 件 :37 15 min, 85 5 s,4 保 存 1 2 4 合 成 引 物 在 NCBI 检 索 NGF β actin 的 mrna 序 列, 用 Primer premier 设 计 引 物 并 验 证 引 物 特 异 性, 引 物 由 苏 州 金 唯 智 生 物 科 技 有 限 公 司 合 成, 序 列 见 表 1 Journal of Jilin Agricultural University 2016, February
刘 璐 璐 等 : 神 经 生 长 因 子 mrna 在 鹅 等 级 前 卵 泡 中 的 表 达 89 表 1 目 的 基 因 引 物 Table 1. Target gene primers 基 因 基 因 ID 引 物 序 列 位 置 扩 增 长 度 / bp NGF XM_418016 4 β actin M26111 1 FP:5 TCAGCAGTGCAGTCTCTCTCAAC RP:5 TGGCGGTGGTTTTGTCC FP:5 GACCACCTTCAACTCCATC RP:5 GGCTGTGATCTCCTTCTG 589~ 714 126 903~ 1 032 130 1 2 5 扩 增 目 的 片 段 (1) 确 定 模 板 的 完 整 性 和 引 物 的 最 适 解 链 温 度 (Tm) 采 用 常 规 温 度 梯 度 PCR 方 法, 根 据 引 物 的 参 考 Tm 值, 设 置 8 个 退 火 温 度, 57 1, 58 2, 59 4, 60 0, 61 2, 62 3, 63 4,64 1, 每 个 温 度 设 3 个 样 品 cdna 和 1 个 空 白 对 照 常 规 PCR 反 应 体 系 25 μl:2 倍 Taq Master Mix 12 5 μl, 上 下 游 引 物 和 cdna 模 板 各 1 μl,rnase Free Water 加 到 25 μl 循 环 条 件 : 94 预 变 性 4 min;94 变 性 30 s, 退 火 温 度 30 s, 72 30 s,40 个 循 环 ; 延 伸 72 30 s 通 过 1 1% 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 观 察, 选 择 合 适 的 温 度 (2) 验 证 引 物 用 荧 光 定 量 PCR 仪 验 证 引 物 的 特 异 性 以 及 适 合 荧 光 定 量 PCR 的 Tm 值 每 对 引 物 3 个 模 板 和 1 个 空 白 对 照 反 应 总 体 系 为 20 μl: SYBR Premix Ex Taq 10 μl,pcr 上 下 游 引 物 各 0 4 μl, ROX Reference Dye ( 50 倍 ) 0 4 μl,dna 模 板 2 0 μl,dh 2 O 6 8 μl 根 据 普 通 温 度 PCR 的 结 果 设 置 3 个 退 火 温 度 60,61, 62 反 应 为 2 个 阶 段 :95 预 变 性 30 s;95 5 s,3 个 退 火 温 度 30 s,40 个 循 环 1 2 6 回 收 产 物 对 引 物 进 行 切 胶 回 收 按 照 AxyPrep DNA 凝 胶 回 收 试 剂 盒 说 明 书 的 步 骤 回 收 目 的 基 因 片 段 1 2 7 阳 性 重 组 子 的 制 备 与 测 序 用 peasy T1 Cloning Kit 和 Trans5αChemically Competent Cell(CD201) 感 受 态 细 胞, 按 指 定 的 说 明 将 回 收 的 PCR 产 物 与 T 载 体 连 接 通 过 限 制 性 酶 切 验 证 后 送 到 金 唯 智 公 司 测 序 1 2 8 荧 光 定 量 PCR 通 过 预 试 验 选 择 合 适 的 浓 度 梯 度 β actin 和 NGF 的 质 粒 浓 度 分 别 为 133 ng / μl 和 250 ng / μl 将 质 粒 从 原 始 浓 度 开 始 稀 释, 每 个 浓 度 梯 度 相 差 10 倍,1 次 稀 释 9 个 梯 度, 每 个 梯 度 3 次 重 复 选 择 4 个 样 品, 每 个 样 品 3 个 重 复, 每 个 基 因 3 个 阴 性 对 照 (NTC) 选 定 浓 度 后 采 用 相 对 荧 光 定 量 PCR 方 法, 反 应 条 件 :95 预 变 性 30 s;95 5 s, 61 30 s, 40 个 循 环 绘 制 溶 解 曲 线 1 3 统 计 分 析 用 SPSS17 0 统 计 软 件 分 析 NGF mrna 在 2 种 鹅 等 级 前 卵 泡 中 的 表 达 量, 以 及 FSH 在 血 清 中 的 表 达 水 平, 单 因 素 one way ANOVA 方 差 分 析,DUNCAN 法 多 重 比 较 NGF 和 FSH 的 相 关 性 用 Pearson 双 变 量 双 侧 检 验 法 进 行 比 较 2 结 果 2 1 血 液 FSH 检 测 结 果 籽 鹅 和 卡 洛 斯 鹅 产 蛋 高 峰 FSH 的 表 达 水 平 分 别 为 (6 15±0 91),(4 87±0 58) mu / ml, 产 蛋 末 期 FSH 的 表 达 水 平 分 别 为 ( 5 51 ± 0 81 ), (2 83±0 60) mu / ml 产 蛋 高 峰 期 FSH 的 表 达 水 平 均 高 于 产 蛋 末 期, 且 籽 鹅 在 产 蛋 高 峰 期 FSH 表 达 水 平 最 高, 差 异 极 显 著 (P<0 01) 2 2 RNA 质 量 由 图 1 可 见, 所 提 RNA 的 3 条 带 清 晰, 说 明 RNA 质 量 良 好, 可 用 于 后 续 试 验 L. 大 白 卵 泡 ; M. 中 白 卵 泡 ; S. 小 白 卵 泡 ; P. 初 级 卵 泡 图 1 不 同 等 级 前 卵 泡 总 RNA 电 泳 图 Fig.1. Electrophoresis results of total RNA in pre hi erarchical follicles 吉 林 农 业 大 学 学 报 Journal of Jilin Agricultural University
90 吉 林 农 业 大 学 学 报 2016 年 2 月 2 3 PCR 结 果 确 定 引 物 Tm 值 通 过 常 规 温 度 梯 度 PCR 电 泳 结 果, 初 步 确 定 β actin NGF 引 物 的 Tm 值 均 为 61 经 过 温 度 梯 度 荧 光 定 量 PCR 进 一 步 验 证, 两 者 引 物 的 Tm 值 为 61 熔 解 曲 线 只 有 1 个 起 峰, 表 明 引 物 在 61 时 具 有 特 异 性 2 4 阳 性 质 粒 的 PCR 扩 增 结 果 把 β actin NGF 这 2 个 基 因 的 重 组 质 粒 DNA 作 为 模 板 进 行 PCR, 电 泳 结 果 可 见 130 bp 126 bp 条 带, 与 预 计 片 段 大 小 相 符 ( 图 2) 2 5 等 级 前 卵 泡 基 因 检 测 结 果 由 表 2 可 知, 产 蛋 高 峰 期, 籽 鹅 初 级 卵 泡 中 NGF mrna 表 达 量 极 显 著 高 于 其 他 卵 泡 ( P < 0 01), 卡 洛 斯 鹅 初 级 卵 泡 中 NGF mrna 表 达 量 显 著 高 于 中 白 卵 泡 (P<0 05), 其 余 卵 泡 间 差 异 不 显 著 产 蛋 末 期, 籽 鹅 初 级 卵 泡 中 NGF mrna 表 达 量 极 显 著 高 于 中 白 卵 泡 和 小 白 卵 泡 (P<0 01), 表 2 鹅 卵 泡 中 NGF mrna 相 对 表 达 量 大 白 卵 泡 NGF mrna 表 达 量 极 显 著 高 于 中 白 卵 泡 (P<0 01), 卡 洛 斯 鹅 初 级 卵 泡 NGF mrna 表 达 量 极 显 著 高 于 中 白 卵 泡 和 小 白 卵 泡 (P<0 01), 大 白 卵 泡 极 显 著 高 于 其 他 卵 泡 (P<0 01) M.Marker; 1.β actin 质 粒 ; 2 ~ 3.NGF 质 粒 图 2 质 粒 PCR 扩 增 结 果 Fig.2. Identification of recombinant plasmid by PCR Table 2. Relative expression amount of NGF in follicles of geese 产 蛋 时 期 品 种 等 级 前 卵 泡 相 对 表 达 量 产 蛋 时 期 品 种 等 级 前 卵 泡 相 对 表 达 量 高 峰 期 (4 月 25 日 ) 大 白 卵 泡 1 80±0 09 b 大 白 卵 泡 1 96±0 08 BC 中 白 卵 泡 1 36±0 16 a 中 白 卵 泡 1 31±0 20 A 籽 鹅 小 白 卵 泡 1 76±0 07 b 籽 鹅 小 白 卵 泡 1 36±0 14 AB 初 级 卵 泡 2 33±0 11 A 末 期 初 级 卵 泡 (5 月 30 日 ) 2 05±0 32 C 大 白 卵 泡 1 63±0 24 abc 大 白 卵 泡 1 88±0 08 C 中 白 卵 泡 1 34±0 18 a 中 白 卵 泡 0 93±0 02 A 卡 洛 斯 鹅 小 白 卵 泡 1 45±0 21 abc 卡 洛 斯 鹅 小 白 卵 泡 1 00±0 01 A 初 级 卵 泡 1 93±0 19 c 初 级 卵 泡 1 31±0 07 B 注 : 同 列 不 同 小 写 字 母 表 示 差 异 显 著 (P<0 05), 不 同 大 写 字 母 表 示 差 异 极 显 著 (P<0 01) 2 6 NGF mrna 表 达 量 与 FSH 表 达 水 平 相 关 性 分 析 籽 鹅 和 卡 洛 斯 鹅 的 小 白 卵 泡 NGF mrna 表 达 系 数 与 FSH 呈 显 著 正 相 关 ( P < 0 05), 而 大 白 卵 泡 中 两 者 呈 负 相 关, 其 他 卵 泡 呈 正 相 关 ( 表 3) 表 3 NGF mrna 表 达 量 与 血 清 FSH 表 达 水 平 相 关 系 数 Table 3. Correlation analysis between NGF mrna and FSH 等 级 前 卵 泡 籽 鹅 卡 洛 斯 鹅 大 白 卵 泡 -0 470-0 517 中 白 卵 泡 0 335 0 774 小 白 卵 泡 0 814 0 815 初 级 卵 泡 0 290 0 120 注 : 表 示 差 异 显 著 P<0 05 3 讨 论 [8] - ΔΔ Ct 瞿 长 伟 采 用 相 对 荧 光 定 量 2 法 检 测 NGF 在 蛋 鸡 等 级 卵 泡 中 的 表 达 量, 结 果 表 明,130 日 龄 产 蛋 前 期, 大 白 卵 泡 中 NGF 的 表 达 量 显 著 高 于 小 白 卵 泡,230 日 龄 产 蛋 高 峰 期 两 者 差 异 不 显 著, 说 明 NGF 在 鸡 的 各 级 卵 泡 均 有 表 达 本 研 究 结 果 表 明 NGF 存 在 于 鹅 的 各 级 卵 泡 中, 但 NGF 在 各 级 卵 泡 中 表 达 量 的 结 果 与 其 不 一 致, 这 可 能 是 物 种 本 身 的 差 异 和 卵 泡 分 级 不 同 造 成 的 从 原 始 卵 泡 的 生 成 到 成 熟 卵 泡 的 排 出, 颗 粒 细 胞 在 整 个 卵 泡 的 发 育 过 程 中 起 着 重 要 作 用, 是 卵 巢 的 主 要 功 能 细 胞 [9] NGF 通 过 与 其 受 体 trka 和 p75 [10] 结 合 而 发 挥 作 用,Dissen 等 用 免 疫 荧 光 技 术 检 测 小 鼠 卵 泡 中 NGF 的 表 达 情 况, 在 小 鼠 初 级 卵 泡 Journal of Jilin Agricultural University 2016, February
刘璐璐等 神经生长因子 ｍｒｎａ 在鹅等级前卵泡中的表达 ９１ 和颗粒细胞中都发现了 ｔｒｋａ 并认为 ＮＧＦ 是促进 ＦＳＨ 表达水平相关性分析结果表明 ２ 种鹅小白 ＮＧＦ 存 在 于 小 鼠 颗 粒 细 胞 中 Ｊａｎａ 关 提示 ＮＧＦ 可与 ＦＳＨ 相互协调促进卵泡发育 初级卵泡发育的必须因子 侯晓峰 １１ １２ 研究证明 发 现 ＮＧＦ 及其受体存在于猪的各级卵泡及颗粒细胞上 本 研究发现产蛋高峰期 籽鹅初级卵泡中 ＮＧＦ ｍｒ ＮＡ 表达量极显著高于其他卵泡 卡洛斯鹅初级 卵泡 ＮＧＦ ｍｒｎａ 表达量显著高于中白卵泡 产蛋 末期 籽鹅初级卵泡中 ＮＧＦ ｍｒｎａ 表达量极显著 高于 中 白 卵 泡 和 小 白 卵 泡 卡 洛 斯 鹅 初 级 卵 泡 卵泡中 ＮＧＦ 表达量与 ＦＳＨ 表达水平呈显著正相 参考文献 １ Ｌｅｖｉ Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ Ｒ Ｔｈｅ ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｔｈｉｒｔｙ ｆｉｖｅ ｙｅａｒｓ ｌａｔｅｒ Ｊ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔｓ １９８７ ７ ９ ６８１ ６９９ ２ 孙永峰 李纯锦 马永和 等 脑源性神经营养因子在母牛性 腺及性腺外生 殖组织 中 的 表 达 Ｊ 吉 林 农 业 大 学 学 报 ２０１０ ３２ ４ ４４３ ４４６ ＮＧＦ ｍｒｎａ 表达量显著高于中白卵泡和小白卵 ３ 孙永峰 史旭升 隋玉健 等 胰岛素样生长因子Ⅰ基因在鹅 态已由单层转变为多层 而颗粒细胞这一转变需 ４ Ａｎｎａｌｉｓａ Ｍａｎｃａ Ｓｉｍｏｎａ Ｃａｐｓｏｎｉ Ａｎｎａ Ｄｉ Ｌｕｚｉｏ ｅｔ ａｌ Ｎｅｒｖｅ 表达量多的原因 由以上结果可猜测 ＮＧＦ 存在 ５ 朱晓玲 李成娇 侯晓峰 等 神经生长因子 ＮＧＦ 及其受体 不同发育时期皮肤及毛囊组织中的表达 Ｊ 吉林农业大学 泡 可能是因为此时的初级卵泡中颗粒细胞的形 要 ＮＧＦ 刺激 １３ 这可能是初级卵泡 ＮＧＦ ｍｒｎａ 于卵泡发育伊始 并参与整个卵泡的生长发育过 程 ＦＳＨ 是由脑垂体前叶分泌的主要成分为糖蛋 白的一种激素 可促进颗粒细胞增殖分化 抑制其 凋亡 杨海明等研究证明母鹅血液中 ＦＳＨ 浓度 学报 ２０１１ ３３ １ ６０ ６３ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ａｘｉａｌ ｒｏｔａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ ｃｈｉｃｋ ｅｍｂｒｙｏ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｊ ＰＮＡＳ ２０１２ １０９ ６ ２００９ ２０１４ ＴｒｋＡ 在雌性水牛生殖器官的表达定位 Ｊ 吉林农业大学 学报 ２０１１ ３３ ３ ３１５ ３１８ ６ 林金杏 局部性促生长因子对鸡卵泡发育的调控及其机理 的研究 Ｄ 杭州 浙江大学 ２０１１ ３ ２０ ７ Ｊｏｈｎｓｏｎ Ａ Ｌ Ｗｏｏｄｓ Ｄ Ｃ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ａｖｉａｎ ｏｖａｒｉａｎ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｄｅ ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｇｒａｎｕｌｏｓｅ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｊ Ｇｅｎ Ｃｏｍｐ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ２００９ １６３ １ ２ １２ １７ 本研究在检测 ８ 瞿长伟 神经生长因子及其受体在蛋鸡等级卵泡和输卵管 产蛋末期 因处于产蛋高峰期的卵泡发育速度 ９ 金艳梅 颗粒细胞对卵泡发育的影响 Ｊ 中国畜牧兽医 在产蛋高峰期显著高于休产期 １４ 两种鹅血清中 ＦＳＨ 浓度也发现产蛋高峰期高于 快 卵泡数量多 需要 ＦＳＨ 刺激 所以产蛋高峰期 鹅血清中 ＦＳＨ 浓度高 在禽类卵巢中 每天都有 上的表达研究 Ｄ 南京 南京农业大学 ２０１２ ５ ３０ ２０１０ ３７ ８ ６９ ７１ １０ Ｄｉｓｓｅｎ Ｇｒｅｇｏｒｙ Ａ Ｒｏｍｅｒｏ Ｃａｒｍｅｎ Ｈｉｒｓｈｆｉｅｌｄ Ａｎｎｅ Ｎｅｗ ｍａｎ ｅｔ ａｌ Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｏｖａｒｙ Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ 一个等级前卵泡被选择进入等级卵泡 进而发育 成熟直至排卵 ＦＳＨ 能促进下一波排卵前卵泡的 发育 １５ 金艳梅研究证实 ＦＳＨ 可促进颗粒细胞 的增殖 因颗粒细胞可促进卵泡的发育 ９ １６ 所以 ＦＳＨ 也起到促进卵泡发育的作用 另外 ＦＳＨ 能 增加 ＮＧＦ 及其受体 ＴｒｋＡ ｍｒｎａ 的表达量 １７ 而 ＮＧＦ 受体就存在于颗粒细胞膜上 这说明两者之 间存 在 联 系 １８ 本 研 究 经 过 相 关 性 分 析 发 现 ＦＳＨ 的表达水平与 ＮＧＦ ｍｒｎａ 的表达量在两种 ２００１ １４２ ５ ２０７８ ２０８６ １１ 侯晓峰 神经生长因子对小鼠卵巢颗粒细胞增殖及孕酮分 泌的影响 Ｄ 长春 吉林大学 ２０１４ ７ ３１ １２ Ｊａｎａ Ｂ Ｋｏｓｚｙｋｏｗｓｋａ Ｍ Ｃｚａｒｚａｓｔａ Ｊ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ＴｒｋＡ ａｎｄ ｐ７５ ｉｎ ｐｏｒｃｉｎｅ ｏ ｖａｒｉｅｓ Ｊ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０１１ ４ ４６８ ４７４ １３ 金艳梅 鸡等级前卵泡颗粒细胞发育的激素和营养调控及 机理研究 Ｄ 杭州 浙江大学 ２００７ ３ ２１ １４ 杨海明 王志跃 韩厚明 等 种鹅产蛋高峰期与休产期繁 殖生理指标的比较 Ｊ 中国家禽 ２０１２ ３４ ２１ ２０ ２３ 鹅的小白卵泡中呈显著正相关 其他卵泡呈正相 １５ Ｅｐｐｉｇ Ｊｏｈｎ Ｊ ＦＳＨ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ｏｏ 粒细胞的增殖 进而促进卵泡的生长发育 １６ Ｓｕｇｉｕｒａ Ｋ Ｐｅｎｄｏｌａ Ｆ Ｌ Ｅｐｐｉｇ Ｊ Ｊ Ｏｏｃｙｔｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ 关 依此推断 ＮＧＦ 和 ＦＳＨ 可相互协调 促进颗 本试验通过实时荧光定量 ＰＣＲ 的方法 证明 ＮＧＦ 在鹅的等级前卵泡中均有表达 且在 ２ 种鹅 初级卵泡中的表达量最多 说明 ＮＧＦ 存在于鹅卵 泡发育伊始 参与卵泡的发育 本研究检测了 ２ 种鹅血清中 ＦＳＨ 的含量 发现产蛋高峰期高于产 ｃｙｔｅ ｃｕｍｕｌｕｓ ｃｅｌｌ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｐｒｅｏｖｕｌａｔｏｒｙ ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ Ｊ Ｎａｔｕｒｅ １９７９ ２８１ ５７３１ ４８３ ４８４ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｏｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｇｒａｎｕｌｏｓｅ ｃｅｌｌｓ ｅｎｅｒｇｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｊ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２００５ ２７９ １ ２０ ３０ １７ 刘立文 马永和 李万宏 促性腺激素对输卵管黏膜上皮细 胞 ＮＧＦ 及 ＴｒｋＡ 表达的影响 Ｊ 中国兽医学报 ２０１３ ３３ ４ ６４１ ６４４ １８ 刘立文 马永和 李万宏 等 ＮＧＦ 对输卵管黏膜上皮细胞 蛋末期 最高值出现在籽鹅产蛋高峰期 最低值出 现在卡洛斯鹅产蛋末期 ＮＧＦ 表达量与血清中 吉林农业大学学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｊｉｌｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 促性腺激素受体表达的影响 Ｊ 中国兽医学报 ２０１３ ３３ ５ ７９５ ７９８ 责任编辑 林海涛