国 际 眼 科 杂 志 摇 2014 年 9 月 摇 第 14 卷 摇 第 9 期 摇 www. ies. net. cn 电 话 :029 鄄 82245172 摇 摇 82210956 摇 摇 电 子 信 箱 :IJO. 2000@ 163. com 实 验 论 著 高 糖 对 人 视 网 膜 色 素 上 皮 细 胞 神 经 钙 黏 连 蛋 白 和 纤 维 连 接 蛋 白 表 达 的 影 响 毕 文 娇, 李 睿 姝, 侯 定 善, 范 摇 妍, 张 晓 梅 作 者 单 位 :(150001) 中 国 黑 龙 江 省 哈 尔 滨 市, 哈 尔 滨 医 科 大 学 附 属 第 一 医 院 眼 科 作 者 简 介 : 毕 文 娇, 在 读 硕 士 研 究 生, 研 究 方 向 : 眼 底 病 的 发 病 及 防 治 通 讯 作 者 : 张 晓 梅, 医 学 博 士, 博 士 研 究 生 导 师, 教 授, 主 任 医 师, 研 究 方 向 : 眼 底 病 的 发 病 及 防 治. zhangxm667@ 163. com 收 稿 日 期 : 2014-04-22 摇 摇 修 回 日 期 : 2014-07-29 High glucose on the expression of N - cadherin and fibronectin in retinal pigment epithelium cells Wen- Jiao Bi, Rui - Shu Li, Ding - Shan Hou, Yan Fan, Xiao-Mei Zhang Department of Ophthalmology,the First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, Heilongjiang Province, China Correspondence to:xiao-mei Zhang. Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, Heilongjiang Province, China. zhangxm667@ 163. com Received:2014-04-22 摇 摇 Accepted:2014-07-29 Abstract 誗 AIM: To observe the expression of N - cadherin and fibronectin in retinal pigment epithelium ( RPE) cells in vitro under high glucose conditions, furthermore, to explore the effects of high glucose on epithelial - mesenchymal transition ( EMT) in RPE cells. 誗 METHODS: Human RPE ( hrpe) cells were cultured in vitro. Containing a final concentration of 60mmol / L glucose was used for high glucose treatment. The cells were divided into normal glucose group (5. 5mmol / L, NG) and high glucose group ( 24, 48 and 72h) respectively. The expression of N - cadherin and fibronectin in hrpe cells were evaluated by immunofluorescence and real - time PCR. 誗 RESULTS: RPE cells became disorganized and swollen over time under high glucose conditions, especially in 72h subgroup. Immunohistochemical analysis revealed that the expression of N - cadherin in RPE cells under high glucose conditions was decreased compared with that in the control group, while the expression of fibronectin was increased. Real - time PCR results showed that the expression of N - cadherin mrna in high glucose group was decreased at 24h compared with that in the control group, and declined markedly at 72h ( F = 12. 252, P = 0 郾 000). There were no significant differences between the control group and the high glucose group at 24h, while the differences between the control group and the high glucose group (48 and 72h) were significant respectively ( P < 0. 05 ). Meanwhile, the expression of fibronectin mrna in RPE cells was increased in high glucose group at 24h, and reached the peak at 72h ( F = 50. 543, P = 0. 000). There were no significant differences between the control group and the high glucose group at 24h. Compared with the control group, the expression of fibronectin mrna in hrpe cells was increased significantly in high glucose group (48 and 72h) respectively (P = 0. 000, P = 0. 000). 誗 CONCLUSION: The expression of epithelium marker N- cadherin is down - regulated under high glucose conditions in hrpe cells in vitro. Meanwhile, the expression of mesenchymal maker fibronectin is induced and appeared to EMT changes. Results of this study will enrich our growing understanding in proliferative diabetic retinopathy and hopefully lead to novel insights for the pathogenesis and therapeutic treatments. 誗 KEYWORDS:human retinal pigment epithelial cell; high glucose; epithelial - mesenchyal transition; N - cadherin; fibronectin Citation: Bi WJ, Li RS, Hou DS, et al. High glucose on the expression of N-cadherin and fibronectin in retinal pigment epithelium cells. Guoji Yanke Zazhi( Int Eye Sci) 2014;14(9):1578-1583 摘 要 目 的 : 体 外 建 立 高 糖 培 养 人 视 网 膜 色 素 上 皮 ( hrpe) 细 胞 模 型, 观 察 高 糖 条 件 下 RPE 细 胞 神 经 钙 黏 连 蛋 白 (N-cadherin) 和 纤 维 连 接 蛋 白 ( fibronectin) 的 表 达 变 化, 探 讨 高 糖 对 RPE 细 胞 发 生 上 皮 间 质 转 化 (EMT) 的 影 响 方 法 : 体 外 培 养 hrpe 细 胞, 以 60mmol / L 的 葡 萄 糖 建 立 高 糖 模 型, 实 验 分 对 照 组 (5. 5mmol / L 的 葡 萄 糖 ) 和 高 糖 24, 48,72h 组, 用 免 疫 组 织 化 学 法 及 Real-time PCR 技 术 检 测 各 组 RPE 细 胞 N-cadherin 和 fibronectin 的 表 达 结 果 : 高 糖 组 RPE 细 胞 出 现 排 列 紊 乱, 胞 体 变 长 变 大, 高 糖 72h 组 最 明 显 免 疫 组 织 化 学 法 检 测 结 果 显 示 : 与 对 照 组 相 比, 高 糖 组 RPE 细 胞 N-cadherin 表 达 呈 下 降 趋 势 ; 而 fibronectin 表 达 出 现 并 呈 升 高 趋 势 Real-time PCR 检 测 结 果 显 示 : 与 对 照 组 相 比, 高 糖 组 RPE 细 胞 N - cadherin mrna 表 达 水 平 在 24h 时 出 现 下 降,72h 时 降 低 最 明 显 (F = 12. 252,P = 0. 000),24h 组 与 对 照 组 相 比 差 异 无 统 计 学 意 义,48h 及 72h 组 分 别 与 对 照 组 相 比 差 异 有 统 计 学 意 义 (P< 0. 05); 与 对 照 组 相 比, 高 糖 组 RPE 细 胞 fibronectin mrna 表 达 水 平 在 24h 时 出 现 升 高,72h 时 升 高 最 明 显 ( F = 50 郾 543,P = 0. 000),24h 组 与 对 照 组 相 比 差 异 无 统 计 学 意 义,48h 及 72h 组 fibronectin mrna 表 达 水 平 明 显 升 高, 分 1578
Int Eye Sci, Vol. 14, No. 9, Sep. 2014 摇 摇 www. ies. net. cn Tel:029 鄄 82245172 摇 82210956 摇 摇 Email:IJO. 2000@163. com 别 与 对 照 组 相 比 差 异 有 统 计 学 意 义 (P =0. 000,P =0. 000) 结 论 : 高 糖 条 件 下 RPE 细 胞 上 皮 标 记 物 N-cadherin 表 达 下 调, 间 质 标 记 物 fibronectin 表 达 出 现, 发 生 EMT 改 变, 这 一 现 象 为 探 讨 增 生 性 糖 尿 病 视 网 膜 病 变 的 发 病 机 制 及 其 防 治 提 供 新 的 思 路 关 键 词 : 人 视 网 膜 色 素 上 皮 细 胞 ; 高 糖 ; 上 皮 间 质 转 化 ; 神 经 钙 黏 连 蛋 白 ; 纤 维 连 接 蛋 白 DOI:10. 3980 / j. issn. 1672-5123. 2014. 09. 05 引 用 : 毕 文 娇, 李 睿 姝, 侯 定 善, 等. 高 糖 对 人 视 网 膜 色 素 上 皮 细 胞 神 经 钙 黏 连 蛋 白 和 纤 维 连 接 蛋 白 表 达 的 影 响. 国 际 眼 科 杂 志 2014;14(9):1578-1583 0 引 言 摇 摇 糖 尿 病 视 网 膜 病 变 ( diabetic retinopathy, DR) 是 糖 尿 病 最 常 见 的 微 血 管 并 发 症 之 一, 是 成 人 失 明 的 重 要 原 因 增 生 性 糖 尿 病 视 网 膜 病 变 (proliferative diabetic retinopathy, PDR), 被 认 为 是 DR 致 盲 的 主 要 原 因, 以 晚 期 视 网 膜 新 生 血 管 及 纤 维 性 增 生 前 膜 形 成 为 标 志 性 的 病 理 改 变 然 而, PDR 增 生 前 膜 的 形 成 机 制 尚 未 阐 明 目 前 研 究 表 明 视 网 膜 色 素 上 皮 (retinal pigment epithelium, RPE) 细 胞 是 PDR 增 生 膜 中 的 细 胞 成 分 之 一 [1] 研 究 表 明,RPE 细 胞 经 上 皮 间 质 转 化 ( epithelial-mesenchymal transition, EMT) 的 机 制, 发 生 迁 移 增 生, 并 转 化 为 成 纤 维 样 细 胞, 参 与 视 网 膜 增 生 膜 的 形 成 [2] 长 期 慢 性 高 血 糖 可 以 造 成 RPE 细 胞 损 伤, 影 响 视 网 膜 外 屏 障 功 能, 是 DR 发 生 发 展 的 重 要 病 理 基 础 [3] 既 往 研 究 表 明, 高 糖 可 以 导 致 RPE 细 胞 出 现 异 常 增 生 [4], 但 对 高 糖 影 响 RPE 细 胞 发 生 EMT 的 研 究 甚 少 本 实 验 通 过 体 外 建 立 RPE 细 胞 的 高 糖 模 型 并 检 测 其 间 质 化 指 标 的 表 达 变 化, 来 探 讨 高 糖 对 RPE 细 胞 发 生 EMT 的 影 响 及 其 在 PDR 发 病 机 制 中 可 能 存 在 的 作 用 1 材 料 和 方 法 1. 1 材 料 摇 人 视 网 膜 色 素 上 皮 (hrpe) 细 胞 株 D407( 购 自 湘 雅 医 学 院 中 心 实 验 室 );DMEM / F12 培 养 基 胎 牛 血 清 青 霉 素 及 链 霉 素 溶 液 ( 美 国 Hyclone 公 司 ); 胰 蛋 白 酶 ( 美 国 Gibco 公 司 ) ; 一 抗 ( 鼠 抗 人 anti - N - cadherin 兔 抗 人 anti - fibronectin ) 及 二 抗 ( 美 国 sigma 公 司 ); 辣 根 酶 (HRP) 标 记 山 羊 抗 小 鼠 Gig (H+L) DAB 显 色 剂 ( 北 京 中 杉 金 桥 生 物 技 术 有 限 公 司 ) 总 RNA 提 取 试 剂 盒 cdna 第 一 链 反 转 录 试 剂 盒 SYBR green Real-time PCR 定 量 试 剂 盒 96 孔 荧 光 定 量 PCR 板 荧 光 定 量 PCR 封 板 膜 Rnase Free H2O TE Buffer( HaiGene 公 司 );D - 葡 萄 糖 粉 ( 美 国 Sigma 公 司 ) 1. 2 方 法 1. 2. 1 RPE 细 胞 的 培 养 及 实 验 分 组 摇 RPE 细 胞 用 含 质 量 分 数 100g / L 胎 牛 血 清 及 10g / L 双 抗 的 DMEM / F12 培 养 基 在 37 益 50g / L CO 2 孵 育 箱 中 培 养,2 ~ 3d 换 液 一 次, 用 质 量 分 数 1. 25g / L 胰 蛋 白 酶 和 质 量 分 数 0. 1g / L EDTA 的 消 化 液 1. 5mL, 以 1 颐 2 消 化 传 代, 取 生 长 状 态 良 好 的 同 一 代 次 对 数 期 RPE 细 胞 用 于 实 验 实 验 分 别 设 立 : 对 照 组 高 糖 24,48,72h 组, 对 照 组 为 5. 5mmol / L 葡 萄 糖 培 养 液 ; 高 糖 组 为 60mmol / L 葡 萄 糖 培 养 液, 由 葡 萄 糖 粉 与 高 糖 型 DMEM 培 养 基 配 制 1. 2. 2 细 胞 形 态 学 观 察 摇 将 RPE 细 胞 以 1 伊 10 5 / 孔 的 密 度 接 种 在 24 孔 细 胞 培 养 板 中, 待 细 胞 生 长 至 80% 的 融 合 状 态, 换 为 5g / L 胎 牛 血 清 的 培 养 液, 继 续 孵 育 24h, 使 细 胞 周 期 同 步 化 按 不 同 分 组 添 加 相 应 干 预 措 施 后 继 续 培 养 72h, 倒 置 相 差 显 微 镜 下 观 察 细 胞 形 态 的 变 化 1. 2. 3 免 疫 组 织 化 学 方 法 检 测 N-cadherin 和 fibronectin 的 表 达 摇 将 悬 浮 细 胞 种 植 在 附 有 玻 片 的 六 孔 板 中, 待 细 胞 贴 壁 后 用 如 前 所 述 分 组 处 理, 取 出 盖 玻 片,PBS 洗 净 晾 干, 用 4% 多 聚 甲 醛 固 定 60min;PBS 冲 洗 后 加 入 30mL / L H 2 O 2 浸 泡 10min; PBS 冲 洗 后 山 羊 血 清 封 闭, 室 温 下 放 置 20min;37 益 下 一 抗 孵 育 2h;PBS 冲 洗 后 37 益 下 二 抗 孵 育 20min;DAB 显 色 ; 苏 木 素 复 染 ; 酒 精 脱 水 ; 中 性 树 脂 封 片 具 体 步 骤 按 照 试 剂 盒 说 明 进 行, 阴 性 对 照 用 PBS 代 替 一 抗 N-cadherin 和 fibronectin 蛋 白 主 要 表 达 于 RPE 细 胞 膜 和 细 胞 质 中 免 疫 组 化 结 果 以 背 景 清 晰 细 胞 质 及 细 胞 膜 淡 黄 色 染 色 记 为 弱 阳 性, 黄 色 为 阳 性, 棕 黄 色 为 强 阳 性, 每 个 标 本 观 察 5 个 视 野 1. 2. 4 Real - time PCR 检 测 N - cadherin mrna 和 fibronectinm RNA 的 表 达 摇 对 照 组 直 接 提 取 总 RNA, 高 糖 组 在 相 应 的 时 间 点 提 取 总 RNA, 按 Trizol 试 剂 说 明 书 流 程 进 行, 使 用 紫 外 分 光 光 度 仪 测 出 每 个 样 品 RNA 的 浓 度, 然 后 用 Rnase Free H 2 O 稀 释 至 浓 度 为 1 滋 g / 滋 L 在 PCR 仪 上 按 30 益 15min,55 益 30min,85 益 10min 条 件 进 行 反 转 录 反 应, 所 得 cdna 进 行 Real-time PCR 实 验 PCR 反 应 总 体 系 30 滋 L, 包 括 双 蒸 水 9 滋 L,cDNA 模 板 4 滋 L,2 x SYBR green PCR Mix 染 料 15 滋 L, 上 下 游 引 物 各 1 滋 L 基 因 序 列 从 Genebank 中 查 阅, 根 据 引 物 设 计 原 则, 利 用 Primers 软 件 设 计 ( 引 物 序 列 见 表 1) 反 应 条 件 :95 益 预 变 性 5min, 随 后 40 个 循 环, 包 括 95 益 变 性 10s,60 益 退 火 并 延 伸 30s 每 组 设 3 复 孔, 实 验 重 复 3 次 实 验 结 果 均 采 用 基 因 Human Actin 表 达 量 做 为 内 参 进 行 半 定 量 矫 正, 数 据 分 析 采 用 吟 吟 ct 法 基 因 表 达 半 定 量 数 值 再 以 对 照 组 进 行 标 准 化 处 理 摇 摇 统 计 学 分 析 : 采 用 SPSS 17. 0 软 件 系 统 进 行 统 计 学 分 析 所 有 数 据 资 料 经 W 检 验 呈 正 态 分 布, 结 果 以 均 数 依 标 准 差 表 示,Levene 检 验 方 差 齐 各 组 RPE 细 胞 中 N-cadherin mrna 及 fibronectin mrna 表 达 相 对 值 的 差 异 比 较 采 用 单 因 素 方 差 分 析, 组 间 多 重 比 较 采 用 Dunnett- t 检 验, 显 著 性 检 验 水 准 为 琢 = 0. 05 2 结 果 2. 1 高 糖 对 RPE 细 胞 形 态 学 的 影 响 摇 正 常 培 养 的 RPE 细 胞 排 列 规 则, 单 层 生 长, 呈 扁 平 多 角 形, 胞 质 透 明, 充 有 少 许 黑 色 或 褐 色 色 素 颗 粒, 细 胞 核 呈 圆 形 或 卵 圆 形, 核 仁 明 显, 边 界 清 晰 ; 高 糖 组 RPE 细 胞 出 现 排 列 紊 乱, 胞 体 变 长 变 大, 形 态 不 规 则, 可 见 部 分 脱 落 细 胞, 其 中 高 糖 72h 组 RPE 细 胞 形 态 改 变 最 明 显 ( 图 1) 2. 2 高 糖 对 RPE 细 胞 N-cadherin 及 fibronectin 表 达 的 影 响 摇 免 疫 组 织 化 学 法 检 测 RPE 细 胞 N - cadherin 及 fibronectin 结 果 显 示 :RPE 细 胞 N-cadherin 在 对 照 组 及 高 糖 24h 组 呈 强 阳 性 表 达,48h 及 72h 组 均 呈 阳 性 表 达 ( 图 2); RPE 细 胞 fibronectin 在 对 照 组 及 高 糖 24h 组 均 为 阴 性 表 达, 高 糖 48h 及 72h 组 均 呈 强 阳 性 表 达 ( 图 3) 2. 3 高 糖 对 RPE 细 胞 N-cadherin 及 fibronectin mrna 表 达 的 影 响 摇 Real -time PCR 检 测 RPE 细 胞 N-cadherin 及 fibronectin mrna 的 表 达, 图 4 示 基 因 扩 增 结 果 良 好, 熔 解 曲 线 呈 单 一 峰 型 与 对 照 组 相 比, 高 糖 组 RPE 细 胞 N- cadherin mrna 表 达 水 平 在 24h 时 出 现 下 降,72h 时 降 低 1579
国际眼科杂志摇 2014 年 9 月摇 第 14 卷摇 第 9 期摇 www. ies. net. cn 电话:029鄄82245172摇 摇 82210956摇 摇 电子信箱:IJO. 2000@ 163. com 摇 摇 摇 摇 表 1摇 各基因引物序列 基因 引物序列(5蒺-3蒺) 人肌动蛋白 神经钙黏连蛋白 纤维连接蛋白 F:TCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG R:GTTGAAGGTAGTTTCGTGGATGC F:GGACTATGATTACCTGAACGACTG R:GATATTCCCTCTGAGCCCAAATTG Gene Bank 登记号 产物( bp) NM_001792 372 AB191261 234 NM_001101. 3 F:AAGGAATATCTCGGTGCCATTTG R:TTACTCTCGGGAATCTTCTCTGTC 218 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 图 1摇 hrpe 细胞的形态( 伊200) 摇 A:对照组;B:高糖 72h 组 图 2摇 免疫组织化学染色检测体外培养 hrpe 细胞中 N-cadherin 的表达( 免疫组织化学法,DAB 染色,苏木素复染,伊40) 摇 A:对照 组; B:高糖 24h 组 ;C:高糖 48h 组; D:高糖 72h 组 图 3摇 免疫组织化学染色检测体外培养 hrpe 细胞中 fibronectin 的表达( 免疫组织化学法,DAB 染色,苏木素复染,伊40) 摇 A:对照 组; B:高糖 24h 组; C:高糖 48h 组; D:高糖 72h 组 图 4摇 Real-time PCR 扩增 熔解曲线图 摇 A:N-cadherin 扩增曲线 ;B:N-cadherin 熔解曲线; C: fibronectin 扩增曲线 ;D:fibronectin 熔解曲线 最明显( F = 12. 252,P = 0. 000),高糖 24h 组与对照组相比 差异无统计学意义,高糖 48h 组及 72h 组分别与对照组相 1580 比差异有统计学意义( P <0. 05,图 5) ;与对照组相比,高 糖组 RPE 细胞 fibronectin mrna 表达水平在 24h 时出现
Int Eye Sci, Vol. 14, No. 9, Sep. 2014 摇 摇 www. ies. net. cn Tel:029 鄄 82245172 摇 82210956 摇 摇 Email:IJO. 2000@163. com 升 高,72h 时 升 高 最 明 显 (F = 50. 543,P = 0. 000), 高 糖 24h 组 与 对 照 组 相 比 差 异 无 统 计 学 意 义, 高 糖 48h 及 72h 组 fibronectin mrna 表 达 水 平 明 显 升 高, 分 别 与 对 照 组 相 比 差 异 有 统 计 学 意 义 (P = 0. 000,P = 0. 000, 图 6) 3 讨 论 摇 摇 DR 的 发 病 机 制 目 前 未 完 全 明 确, 持 续 的 缺 氧 和 高 糖 状 态 可 造 成 RPE 细 胞 不 同 程 度 的 损 伤, 是 导 致 DR 的 发 生 发 展 重 要 因 素 [5] RPE 细 胞 是 一 种 单 层 矮 柱 状 上 皮 细 胞, 细 胞 之 间 依 靠 紧 密 连 接 规 则 排 列 构 成 血 - 视 网 膜 屏 障, 在 脉 络 膜 和 视 网 膜 细 胞 之 间 营 养 水 电 解 质 等 物 质 的 转 运 中 起 关 键 作 用 RPE 细 胞 可 以 转 运 大 量 葡 萄 糖 为 视 网 膜 神 经 感 觉 层 提 供 能 量, 因 而 更 易 受 到 血 糖 波 动 的 影 响 [6] 由 于 体 液 环 境 复 杂, 不 能 明 确 影 响 因 素 为 高 糖, 故 我 们 在 体 外 培 养 条 件 下, 单 纯 应 用 高 浓 度 葡 萄 糖 作 为 刺 激 因 素, 发 现 高 糖 作 用 hrpe 细 胞 72h 后, 细 胞 比 对 照 组 更 密 集, 胞 体 变 长 变 大, 说 明 高 糖 在 一 定 时 间 内 促 进 hrpe 细 胞 的 增 生 体 外 培 养 时 25 ~ 30mmol / L 的 高 糖 浓 度, 可 近 似 地 等 同 于 糖 尿 病 时 体 内 高 糖 状 态 [7] [8] 韩 小 霞 等 体 外 实 验 结 果 显 示,30mmol / L 的 葡 萄 糖 作 用 于 hrpe, 其 生 长 曲 线 与 正 常 葡 萄 糖 浓 度 条 件 下 的 细 胞 生 长 曲 线 没 有 明 显 统 计 学 差 异, 其 考 虑 由 于 RPE 细 胞 转 运 葡 萄 糖 的 作 用, 其 承 受 高 糖 的 能 力 较 强, 单 纯 30mmol / L 的 高 糖 不 足 以 对 其 生 理 功 能 造 成 影 响 我 们 在 预 实 验 中 采 用 30,60, 90mmol / L 的 高 糖 浓 度 体 外 培 养 hrpe 24,48,72h, 发 现 60mmol / L 的 高 糖 浓 度 对 hrpe 的 影 响 最 明 显 故 本 实 验 选 用 60mmol / L 的 葡 萄 糖 浓 度 模 拟 体 内 绝 对 高 糖 环 境 摇 摇 EMT 是 一 种 基 本 的 病 理 生 理 现 象, 参 与 胚 胎 发 育 肿 瘤 转 移 和 器 官 纤 维 化 等 过 程, 以 上 皮 细 胞 表 型 的 缺 失 及 间 质 特 性 的 获 得 为 重 要 特 征, 主 要 表 现 为 具 有 极 性 的 上 皮 细 胞 转 化 成 具 有 活 动 能 力 能 够 在 细 胞 基 质 间 自 由 迁 移 的 间 质 细 胞 越 来 越 多 的 证 据 表 明 EMT 在 多 种 眼 部 疾 病 ( 角 膜 损 伤 后 瘢 痕 修 复 [9] 后 发 性 白 内 障 [10] 视 网 膜 新 生 血 管 [11] 性 病 变 等 ) 中 扮 演 着 重 要 角 色 近 年 来,RPE 细 胞 发 生 EMT 改 变 参 与 视 网 膜 增 生 前 膜 形 成 的 机 制 逐 渐 被 人 们 发 现 [12,13] 摇 摇 研 究 表 明,PDR 患 者 的 视 网 膜 前 膜 组 织 中 可 以 观 察 到 含 色 素 颗 粒 的 RPE 细 胞, 并 且 发 现 部 分 RPE 细 胞 形 态 类 似 纤 维 样 细 胞 [14] [15] Guidry 等 对 PDR 增 生 性 前 膜 的 研 究 表 明, 在 PDR 增 生 膜 组 织 的 发 生 过 程 中, 有 可 能 通 过 表 达 细 胞 转 型 调 控 因 子, 诱 导 增 生 膜 内 RPE 细 胞 经 EMT 机 制 发 生 细 胞 转 型, 增 强 了 细 胞 迁 移 和 增 生 能 力, 在 趋 化 因 子 的 诱 导 下, 通 过 内 界 膜 迁 移 到 视 网 膜 表 面 形 成 增 生 性 前 膜 此 外, 既 往 研 究 表 明 [16], 视 网 膜 损 伤 及 炎 症 反 应 可 以 激 活 RPE 细 胞 发 生 细 胞 表 型 的 改 变, 转 化 成 具 有 收 缩 能 力 的 纤 维 样 细 胞, 增 生 迁 移 到 视 网 膜 表 面, 与 其 它 炎 症 细 胞 及 胶 原 纤 维 等 成 分 共 同 形 成 了 增 生 性 玻 璃 体 视 网 膜 病 变 (PVR) 的 增 生 膜, 从 而 导 致 牵 拉 性 视 网 膜 脱 离 的 发 生 因 此, 了 解 高 糖 条 件 对 RPE 细 胞 发 生 EMT 的 影 响, 可 能 为 探 索 PDR 的 发 病 机 制 提 供 新 的 思 路 摇 摇 上 皮 细 胞 发 生 间 质 细 胞 转 化 时 会 出 现 形 态 学 及 分 子 生 物 学 特 征 的 变 化 形 态 学 上, 上 皮 细 胞 顶 - 底 极 性 消 失, 图 5 摇 Real-time PCR 检 测 高 糖 状 态 下 hrpe 细 胞 N-cadherin mrna 表 达 的 相 对 值 摇 图 6 摇 a P <0. 05, b P <0. 01vs 对 照 组 Real-time PCR 检 测 高 糖 状 态 下 hrpe 细 胞 fibronectin mrna 表 达 的 相 对 值 摇 b P <0. 01vs 对 照 组 细 胞 间 连 接 减 弱, 细 胞 骨 架 成 分 由 角 蛋 白 为 主 变 为 以 波 形 蛋 白 为 主, 从 而 引 起 细 胞 形 态 的 改 变, 即 立 方 上 皮 细 胞 外 形 演 变 为 纺 锤 形 纤 维 细 胞 形 态, 从 而 增 强 了 迁 移 能 力 [17] 分 子 生 物 学 上 表 现 为 上 皮 细 胞 标 记 物 下 调 和 间 质 细 胞 标 记 物 的 表 达 其 中 RPE 细 胞 表 达 的 上 皮 标 记 物 主 要 有 钙 黏 连 蛋 白 (N-cadherin) 紧 密 连 接 蛋 白 ( ZO-1) 等, 间 质 标 记 物 包 括 琢 - 平 滑 肌 肌 动 蛋 白 ( 琢 -SMA) 纤 维 连 接 蛋 白 (fibronectin) 等, 这 些 细 胞 间 连 接 蛋 白, 以 不 同 的 机 制 参 与 RPE 细 胞 间 及 其 与 基 质 间 的 连 接, 通 过 介 导 细 胞 聚 集 或 连 接 参 与 细 胞 形 态 结 构 的 的 转 化 细 胞 间 连 接 的 结 构 功 能 受 到 调 控 或 某 些 因 素 影 响 而 改 变 是 启 动 EMT 的 早 期 事 [18] [19] 件 Li 等 和 Parapuram 等 研 究 表 明,RPE 细 胞 可 以 在 细 胞 因 子 TGF- 茁 EGF 作 用 下 N-cadherin ZO-1 表 达 下 调, 琢 -SMA fibronectin vimentin 出 现 表 达, 发 生 上 皮 间 质 转 化, 参 与 视 网 膜 增 生 前 膜 的 发 生 我 们 前 期 的 研 究 结 果 证 实,RPE 细 胞 在 高 糖 条 件 下 出 现 上 皮 标 记 物 ZO-1 表 达 下 调, 间 质 标 记 物 琢 -SMA 表 达, 发 生 了 EMT 的 改 变 在 本 实 验 中, 我 们 选 用 上 皮 标 记 物 N-cadherin 及 间 质 标 记 物 fibronectin, 采 用 更 为 直 观 的 免 疫 组 织 化 学 法 和 Realtime PCR 方 法 的 来 检 测 以 上 两 种 标 记 物 在 RPE 细 胞 的 表 达 变 化, 从 另 一 角 度 来 证 实 高 糖 对 RPE 细 胞 发 生 EMT 的 诱 导 作 用 摇 摇 钙 黏 连 蛋 白 是 依 赖 Ca 2+ 参 与 的 一 类 黏 附 分 子, 介 导 同 种 细 胞 间 的 识 别 和 黏 附 包 括 N P E 和 VE- 钙 黏 连 蛋 白 四 种 类 型 其 中 研 究 最 多 的 是 上 皮 钙 黏 连 蛋 白 ( E - [18] cadherin) 和 神 经 钙 黏 连 蛋 白 ( N-cadherin) Li 等 研 究 认 为,RPE 细 胞 发 生 上 皮 间 质 转 化 时, 其 上 皮 标 记 物 E - cadherin 表 达 下 调 但 既 往 研 究 表 明, 大 多 数 哺 乳 动 物 的 上 皮 细 胞 主 要 表 达 E-cadherin, 但 人 RPE 细 胞 主 要 表 达 N- 1581
国 际 眼 科 杂 志 摇 2014 年 9 月 摇 第 14 卷 摇 第 9 期 摇 www. ies. net. cn 电 话 :029 鄄 82245172 摇 摇 82210956 摇 摇 电 子 信 箱 :IJO. 2000@ 163. com cadherin [20] [21] Chen 等 研 究 表 明, 体 外 培 养 的 RPE 细 胞 未 检 测 到 E-cadherin 的 表 达, 而 发 现 N-cadherin 在 RPE 细 胞 上 的 表 达 占 优 势,N-cadherin 是 RPE 细 胞 间 连 接 的 重 要 成 分, 当 细 胞 间 连 接 解 离 并 在 细 胞 因 子 作 用 下 发 生 EMT 时,N - cadherin 的 表 达 是 下 调 的 本 实 验 选 用 N - cadherin 作 为 上 皮 标 记 物 检 测 的 指 标, 结 果 表 明 RPE 细 胞 在 高 糖 条 件 下 N-cadherin 表 达 下 调, 出 现 EMT 的 改 变, 与 Chen 等 的 研 究 相 一 致 摇 摇 纤 维 连 接 蛋 白 (fibronectin) 是 一 种 具 有 重 要 生 物 学 活 性 的 非 胶 原 糖 蛋 白, 其 二 聚 体 溶 解 于 血 浆 中, 多 聚 体 存 在 于 多 种 细 胞 表 面 及 结 缔 组 织 有 关 的 基 底 膜 中 Fibronectin 的 主 要 作 用 是 介 导 细 胞 之 间 及 其 与 基 质 间 的 黏 附, 调 控 细 胞 的 迁 移 增 生 及 分 化 研 究 发 现 fibronectin 对 RPE 细 胞 的 迁 移 具 有 明 显 的 趋 化 作 用 [22], 干 扰 fibronectin 与 其 特 异 性 配 体 的 结 合, 能 够 明 显 抑 制 RPE 细 胞 诱 导 的 PVR 的 发 生 [23] [24,25] Hiscott 等 研 究 发 现, 正 常 视 网 膜 组 织 中 不 表 达 fibronectin, 而 在 视 网 膜 前 膜 及 视 网 膜 下 膜 中 的 RPE 细 [26,27] 胞 上 有 fibronectin 的 表 达 Casaroli 等 研 究 表 明, fibronectin 是 PDR 及 PVR 视 网 膜 增 生 膜 中 重 要 的 细 胞 外 基 质 成 分 之 一, 并 在 增 生 膜 形 成 过 程 中 起 重 要 作 用 本 实 验 中, 我 们 用 免 疫 组 织 化 学 Real-time PCR 两 种 方 法 来 检 测 N-cadherin 及 fibronectin 在 RPE 细 胞 的 表 达, 结 果 显 示 : 正 常 培 养 的 RPE 细 胞 N -cadherin 呈 高 水 平 表 达, 而 fibronectin 几 乎 不 表 达 体 外 高 糖 条 件 下,RPE 细 胞 上 皮 标 记 物 N-cadherin 表 达 水 平 随 高 糖 作 用 时 间 的 延 长 而 呈 下 降 趋 势 ; 而 间 质 标 记 物 fibronectin 的 表 达 随 高 糖 作 用 时 间 延 长 出 现 并 呈 升 高 趋 势 实 验 结 果 表 明, 在 高 糖 条 件 下, 体 外 培 养 的 RPE 细 胞 发 生 了 上 皮 间 质 转 化 但 两 个 标 记 物 在 高 糖 作 用 24h 时 的 表 达 水 平 与 对 照 组 相 比 差 异 均 无 统 计 学 意 义, 考 虑 可 能 是 由 于 高 糖 作 用 时 间 较 短, 不 足 以 对 RPE 细 胞 N-cadherin 及 fibronectin 表 达 的 调 控 过 程 造 成 影 响 摇 摇 RPE 细 胞 具 有 分 泌 多 种 细 胞 因 子 ( 如 成 纤 维 细 胞 因 子 FGF-1 FGF-2, 转 化 生 长 因 子 TGF- 茁 等 ) 的 功 能, 其 可 在 自 身 或 其 他 相 关 细 胞 分 泌 的 细 胞 因 子 作 用 下, 活 化 增 生 细 胞 表 型 发 生 转 化 而 出 现 EMT [28] TGF- 茁 是 目 前 已 知 的 最 有 效 促 使 EMT 发 生 的 细 胞 因 子, 可 由 压 力 负 荷 高 血 糖 血 管 紧 张 素 等 多 种 因 素 刺 激 产 生 [29] [14] 刘 廷 等 在 PDR 患 者 视 网 膜 前 膜 中 发 现 TGF- 茁 1 表 达 升 高, 并 认 为 其 可 能 是 增 生 膜 内 细 胞 发 生 表 型 变 化 的 原 因 之 一 研 究 表 明,TGF- 茁 与 其 受 体 1 2 结 合, 激 活 smad2 smad3, 活 化 的 smad2 / 3 复 合 体 与 smad4 结 合 进 入 细 胞 核, 与 转 录 因 子 snail 结 合 调 节 目 标 基 因 的 转 录, 从 而 介 导 EMT 的 发 生 [30,31] ; 故 我 们 推 测 在 高 糖 条 件 下 RPE 细 胞 可 能 是 通 过 TGF- 茁 等 细 胞 因 子 介 导 的 相 关 通 路 发 生 上 皮 间 质 转 化, 并 参 与 PDR 的 视 网 膜 增 生 膜 的 发 生 发 展 具 体 通 路 及 相 关 调 控 靶 点 有 待 于 进 一 步 实 验 研 究 本 研 究 证 实, 体 外 培 养 RPE 细 胞 在 高 糖 条 件 下 出 现 上 皮 标 记 物 N-cadherin 的 表 达 下 调 及 间 质 标 记 物 fibronectin 的 表 达 出 现, 发 生 上 皮 间 质 转 化 的 改 变, 这 一 现 象 为 探 索 PDR 的 发 病 机 制 及 其 防 治 提 供 新 的 思 路 参 考 文 献 1 许 艺 民, 冯 云, 马 志 中. 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