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X 光 繞 射 技 術 運 用 與 實 作 ( 授 課 講 義 ) 生 物 膜 結 構 測 量 與 分 析 運 用 作 者 : 副 教 授 洪 偉 清 使 用 對 象 : 生 物 科 技 學 程 班 中 華 民 國 九 十 八 年 二 月 十 日 1

目 錄 第 一 章 前 言 1 第 二 章 片 層 繞 射 技 術 與 測 量 困 境 9 第 一 節 片 層 繞 射 技 術 10 第 二 節 測 量 脂 膜 結 構 所 遭 遇 的 困 境 與 解 決 方 案 13 第 三 章 改 良 的 X- 光 片 層 繞 射 / 滲 透 壓 技 術 17 第 一 節 可 調 控 溫 / 濕 度 的 繞 射 腔 之 設 計 17 第 二 節 單 一 指 向 性 多 片 層 脂 膜 的 製 備 19 第 三 節 實 驗 步 驟 22 第 四 節 脂 膜 研 究 的 實 驗 程 序 29 第 四 章 結 果 與 討 論 32 第 一 節 飽 和 碳 氫 鏈 脂 膜 的 基 本 特 性 33 第 二 節 流 體 態 的 脂 膜 之 臨 界 膨 脹 42 第 三 節 膠 體 態 的 脂 膜 之 滲 透 壓 門 檻 47 第 四 節 脂 膜 有 序 無 序 的 相 變 55 第 五 章 總 結 63 2

參 考 文 獻 65 附 錄 67 附 錄 一 脂 膜 的 X- 光 吸 收 係 數 計 算 67 附 錄 二 決 定 多 片 層 脂 膜 繞 射 振 幅 之 真 值 的 方 法 69 附 錄 三 膠 體 態 的 DMPC 其 碳 氫 鏈 長 度 D hc 的 合 理 估 計 71 附 錄 四 舊 有 截 面 積 壓 縮 係 數 計 算 式 的 錯 誤 72 附 錄 六 作 者 發 表 與 著 作 74 3

圖 目 圖 1-1 細 胞 癌 變 的 示 意 圖 1 圖 1-2 愛 滋 病 毒 入 侵 細 胞 的 示 意 圖 2 圖 1-3 抗 菌 peptide 貫 穿 細 菌 胞 膜 的 示 意 圖 4 圖 1-4 飽 和 碳 氫 鏈 磷 脂 質 分 子 DMPC 的 結 構 圖 5 圖 1-5 DMPC 脂 膜 縱 切 面 的 結 構 圖 6 圖 1-6 生 物 分 子 或 藥 物 分 子 與 脂 膜 作 用 的 示 意 圖 8 圖 2-1 X- 光 片 層 繞 射 的 基 本 原 理 與 數 據 分 析 步 驟 之 示 意 圖 11 圖 2-2 脂 膜 結 構 測 量 所 遭 遇 困 境 的 示 意 圖 13 圖 2-3 解 決 脂 膜 結 構 測 量 所 遭 遇 困 境 的 示 意 圖 15 圖 3-1 可 調 控 溫 / 濕 度 繞 射 腔 的 實 驗 裝 置 示 意 圖 18 圖 3-2 DLPC 脂 膜 在 偏 極 化 顯 微 鏡 下 測 得 的 影 像 21 圖 3-3 DMPC 脂 膜 在 23.5 o C 時 各 滲 透 壓 下 的 繞 射 圖 23 圖 3-4 DMPC 脂 膜 在 23.5 o C 時 各 滲 透 壓 下 各 階 次 繞 射 峰 的 繞 射 振 幅 圖 24 圖 3-5 DMPC 脂 膜 在 23.5 o C 時 各 滲 透 壓 下 的 電 子 密 度 分 佈 圖 25 圖 3-6 DMPC 分 子 的 結 晶 結 構 與 其 電 子 密 度 分 佈 圖 27 圖 3-7 膠 體 態 DMPC 碳 氫 鏈 傾 斜 角 隨 滲 透 壓 的 變 化 圖 與 其 雙 層 4

結 構 的 分 子 結 構 模 型 28 圖 3-8 DLPC DMPC 和 DPhPC 等 脂 膜 的 T-Π 相 態 圖 31 圖 4-1 DLPC 和 DMPC 分 別 在 35 o C 與 23.5 o C 時 各 滲 透 壓 下 的 電 子 密 度 分 佈 圖 33 圖 4-2 DMPC 脂 膜 在 10 16 及 23.5 o C 下 的 I h 隨 滲 透 壓 的 變 化 圖 34 圖 4-3 DLPC 和 DMPC 脂 膜 的 D 與 PtP 隨 滲 透 壓 的 變 化 圖 35 圖 4-4 DLPC 和 DMPC 脂 膜 的 D co 與 D co /2n 隨 滲 透 壓 的 變 化 圖 37 圖 4-5 圖 4-5 脂 膜 在 力 平 衡 時 的 示 意 圖 39 圖 4-6 DLPC 和 DMPC 脂 膜 的 K a 隨 滲 透 壓 的 變 化 圖 40 圖 4-7 沿 共 存 線 逼 近 臨 界 膨 脹 區 域 的 新 路 徑 示 意 圖 43 圖 4-8 DLPC 脂 膜 的 PtP 隨 滲 透 壓 的 變 化 圖 44 圖 4-9 DLPC 脂 膜 的 PtP 隨 T-T m 的 變 化 圖 45 圖 4-10 DLPC 脂 膜 的 2σ 隨 滲 透 壓 的 變 化 圖 46 圖 4-11 DMPC 在 10 o C 的 各 滲 透 壓 下 測 得 的 繞 射 數 據 及 其 分 析 後 得 到 的 電 子 密 度 分 佈 圖 48 圖 4-12 DMPC 脂 膜 在 10 o C 下 的 D c 與 A 隨 滲 透 壓 的 變 化 圖 49 圖 4-13 DMPC 脂 膜 在 10 o C 下 的 D p 與 I h 隨 滲 透 壓 的 變 化 圖 51 圖 4-14 膠 體 態 脂 膜 的 結 構 隨 滲 透 壓 的 變 化 的 示 意 圖 52 圖 4-15 DPhPC 與 DMPC 脂 膜 的 T-Π 相 態 圖 56 5

圖 4-16 DPhPC 和 DMPC 脂 膜 分 別 在 25 o C 與 34 o C 時 各 滲 透 壓 下 的 電 子 密 度 分 佈 圖 58 圖 4-17 DPhPC 和 DMPC 脂 膜 的 D 與 PtP 隨 滲 透 壓 的 變 化 圖 60 圖 4-18 DPhPC 和 DMPC 脂 質 分 子 在 流 體 態 與 膠 體 態 的 分 子 結 構 62 6

表 目 表 4-1 膠 體 態 DMPC 脂 膜 在 10 o C 時 的 飽 和 含 水 下 其 結 構 參 數 列 表 54 7

第 一 章 前 言 細 胞 是 生 命 體 的 基 本 單 元 一 個 細 胞 由 細 胞 膜 區 隔 成 內 外, 膜 中 各 式 各 樣 的 膜 蛋 白 質 與 胞 膜 合 作, 使 細 胞 具 有 活 性 並 得 以 執 行 生 物 功 能 近 十 年 來, 有 愈 多 的 證 據 顯 示 疾 病 的 發 作 與 細 胞 膜 病 變 有 關 例 如 癌 症, 由 臨 床 研 究 的 觀 察, 發 現 癌 變 細 胞 的 胞 膜 會 由 原 本 正 常 的 平 滑 表 面 變 為 非 常 凹 凸 不 平 且 呈 毛 茸 狀 [1], 如 圖 1-1 所 示 有 些 醫 學 家 認 為 此 種 胞 膜 的 病 變 會 破 壞 癌 細 胞 之 間 的 接 觸, 使 胞 膜 上 抑 制 細 胞 成 長 的 因 子 失 效, 導 致 癌 細 胞 可 以 無 限 制 的 分 裂 與 成 長 因 此, 若 能 減 少 癌 細 胞 的 胞 膜 形 變 以 增 加 胞 膜 間 的 接 觸, 或 許 即 能 使 抑 制 因 子 再 生 效, 而 能 可 有 效 地 減 緩 癌 細 胞 的 擴 散 使 病 情 得 以 控 制 圖 1-1 細 胞 癌 變 的 示 意 圖 8

愛 滋 病 毒 的 RNA 轉 移 peptide 細 胞 膜 細 胞 圖 1-2 愛 滋 病 毒 入 侵 細 胞 的 示 意 圖 又 例 如 愛 滋 病, 目 前 研 究 顯 示 愛 滋 病 毒 的 傳 播 是 利 用 病 毒 中 的 一 種 帶 電 的 轉 移 peptide 帶 領, 才 能 使 愛 滋 病 毒 的 RNA 得 以 穿 過 正 常 細 胞 的 細 胞 膜 而 進 入 細 胞 中 [2], 來 進 行 病 毒 的 複 製 與 繁 衍, 如 圖 1-2 所 示 因 此 若 能 瞭 解 這 種 peptide 與 細 胞 膜 的 作 用, 則 可 有 效 地 阻 斷 病 毒 入 侵 正 常 細 胞, 為 愛 滋 病 患 者 帶 來 一 線 生 機 細 胞 膜 的 研 究 也 有 助 於 醫 療 的 改 善 例 如, 抑 制 心 臟 病 發 作 的 藥 劑 貝 它 阻 斷 劑 ; 治 療 高 血 壓 症 的 藥 錠 洛 維 斯 錠 [3] 貝 它 阻 斷 劑 的 發 明 是 因 為 研 究 者 發 現, 在 心 肌 細 胞 的 胞 膜 上 有 一 種 專 門 辨 識 腎 上 9

腺 激 素 的 受 體 ( 為 一 種 膜 蛋 白 質 ), 當 人 處 在 有 壓 力 的 狀 態 下, 體 內 的 腎 上 腺 激 素 即 會 激 增, 而 加 速 心 跳 ( 此 為 激 素 效 能 之 一 ), 使 心 臟 病 患 者 產 生 危 險 於 是 研 究 者 研 發 出 一 種 化 學 結 構 類 似 腎 上 腺 激 素 的 分 子, 讓 它 先 霸 佔 心 肌 細 胞 膜 上 的 此 種 受 體, 使 真 正 的 腎 上 腺 激 素 無 法 再 與 受 體 結 合 而 失 去 加 速 心 跳 的 功 能 洛 維 斯 錠 的 發 明 也 與 細 胞 膜 上 的 受 體 有 關, 研 究 者 發 現 細 胞 所 需 膽 固 醇 的 來 源 有 兩 種 管 道, 一 種 是 由 細 胞 自 行 透 過 化 學 反 應 而 合 成 ; 另 一 種 則 是 透 過 細 胞 膜 上 吸 收 膽 固 醇 的 受 體 來 攝 取 血 液 中 膽 固 醇 而 洛 維 斯 錠 的 功 用, 即 能 阻 礙 細 胞 自 行 合 成 膽 固 醇, 迫 使 細 胞 在 需 要 膽 固 醇 時, 必 須 在 胞 膜 上 產 生 更 多 的 膽 固 醇 受 體 以 攝 取 血 液 中 更 多 的 膽 固 醇, 如 此 一 來, 即 可 減 少 膽 固 醇 在 動 脈 壁 堆 積 的 機 會, 因 此 可 以 預 防 與 治 療 高 血 壓 此 外, 在 最 近 十 五 年 期 間, 科 學 家 在 動 植 物 的 先 天 性 免 疫 系 統 內 發 現 一 種 小 分 子 量 的 抗 菌 peptide [4-6], 可 以 直 接 與 細 菌 胞 膜 作 用 來 殺 死 細 菌, 如 圖 1-3 所 示 而 不 像 一 般 所 知 的 噬 菌 體 需 要 細 菌 胞 膜 上 有 特 定 膜 蛋 白 作 為 辨 識 的 受 體, 才 能 與 細 菌 胞 膜 作 用 而 殺 死 細 菌 這 類 抗 菌 peptide, 如 在 香 菇 菌 類 的 alamethicin 與 青 蛙 表 皮 的 magainin 等, 都 可 形 成 單 螺 旋 的 結 構 體, 並 且 peptide 中 親 水 與 厭 水 胺 基 酸 群, 可 以 分 別 分 佈 在 螺 旋 結 構 體 的 兩 側, 使 這 類 抗 菌 peptide 成 為 一 種 具 有 雙 極 性 的 螺 旋 體, 可 與 細 菌 胞 膜 結 合 來 殺 菌 因 此 若 能 瞭 解 這 些 抗 菌 10

peptide 的 殺 菌 機 制, 並 能 運 用 到 醫 療 上 使 殺 菌 更 為 有 效, 則 可 有 效 地 防 止 疾 病 的 傳 播 與 擴 散 生 物 細 胞 膜 若 除 去 膜 中 蛋 白 質 醣 類 及 其 他 種 類 的 生 物 分 子, 基 抗 菌 peptides 細 菌 細 菌 胞 膜 圖 1-3 抗 菌 peptide 貫 穿 細 菌 胞 膜 的 示 意 圖 本 上 是 一 種 由 脂 質 分 子 所 形 成 的 薄 膜, 稱 之 為 脂 膜 所 以 研 究 脂 膜 可 瞭 解 細 胞 膜 的 一 些 特 性 以 及 生 物 分 子 或 藥 物 分 子 與 細 胞 膜 的 交 互 作 用, 因 此 脂 膜 研 究 是 生 物 及 醫 藥 科 技 的 重 要 課 題 之 一 11

脂 膜 的 脂 質 分 子 具 有 一 個 親 水 的 頭 部 分 子 群 兩 個 厭 水 的 碳 氫 鏈 尾 部, 頭 尾 以 甘 油 基 分 子 團 連 接, 如 圖 1-4 所 示 脂 質 分 子 的 分 類, 依 據 頭 部 分 子 群 的 種 類 尾 部 碳 氫 鏈 長 度 與 鍵 結 磷 酸 根 甘 油 基 親 水 頭 部 分 子 群 尾 部 碳 氫 鏈 圖 1-4 含 14 個 碳 鏈 長 度 的 飽 和 碳 氫 鏈 磷 脂 質 分 子 DMPC 的 結 構 圖 由 頭 部 分 子 群 的 種 類 來 分, 以 頭 部 含 有 磷 原 子 的 磷 脂 質 分 子 為 例, 在 磷 原 子 上 接 不 同 的 小 分 子 群, 可 區 分 為 phosphatidyl-choline (PC) phosphatidyl-glycerol (PG) phosphatidyl-ethanolamine(pe) 等, 其 中 PC 類 在 生 物 細 胞 膜 含 量 最 多, 為 最 重 要 的 成 分, 俗 稱 的 卵 磷 脂 即 為 此 類 由 尾 部 碳 氫 鏈 長 度 來 分, 如 圖 1-4 所 示 的 脂 質 分 子, 即 為 飽 和 碳 氫 鏈 具 有 14 個 碳 鏈 長 度 的 dimyristoyl-phosphatidyl-choline(dmpc), 其 它 不 同 碳 鏈 長 度 的 飽 和 碳 氫 鏈 的 脂 質 分 子, 還 有 12

如 12 個 碳 鏈 長 度 的 dilauroyl-phosphatidyl-choline(dlpc) 以 及 16 個 碳 鏈 長 度 的 dipalmitoyl-phosphatidyl-choline(dppc) 等 若 依 鍵 結 不 同, 又 可 區 為 飽 和 不 飽 和 以 及 飽 和 有 支 鏈 三 類, 其 中 飽 和 與 飽 和 有 支 鏈 的 區 分, 以 16 個 碳 鏈 長 度 的 脂 質 分 子 為 例, 在 飽 和 碳 氫 鏈 的 第 3 7 11 和 15 的 碳 上 外 接 甲 烷 基 為 支 鏈, 特 別 稱 為 diphytanoyl phosphatidylcholine(dphpc) 以 區 別 於 DPPC, 以 上 所 舉 的 脂 質 分 子 將 在 本 文 中 充 分 研 究 當 這 些 脂 質 分 子 在 水 中 時, 即 可 自 然 地 形 成 一 個 尾 尾 相 接 頭 頭 相 併 的 雙 層 結 構 之 脂 膜, 其 縱 切 面 的 結 構 及 對 應 的 電 子 密 度 沿 垂 直 膜 面 方 向 的 分 佈, 如 圖 1-5 所 示 在 圖 中 兩 邊 的 主 峰 為 Electron density 親 水 區 界 面 厭 水 區 界 面 親 水 區 電 子 密 度 沿 垂 z直 膜 面 方 向 的 分 佈 圖 1-5 脂 膜 縱 切 面 的 結 構 圖 13

磷 酸 根 PO 4 的 位 置, 其 電 子 密 度 最 高, 應 在 親 水 區 內 ; 兩 個 次 峰 應 為 甘 油 基 的 碳 氧 原 子 聚 集 之 處, 其 電 子 密 度 次 高, 應 為 親 水 區 與 厭 水 區 的 界 面 ; 兩 個 次 峰 間 即 為 碳 氫 鏈 所 在, 故 為 厭 水 區, 其 中 電 子 密 度 最 低 處 為 兩 脂 質 分 子 的 碳 氫 鏈 尾 端 之 CH 3 尾 尾 相 接 處, 故 在 脂 膜 中 央 位 置, 兩 側 平 坦 區 域 為 碳 氫 鏈 的 CH 2 所 在 一 般 而 言, 飽 和 碳 氫 鏈 的 磷 脂 膜 之 相 態 主 要 有 三 種 :(1) 流 體 態 (fluid-phase 或 稱 之 L α -phase) 存 在 高 溫 高 濕 下, 脂 膜 碳 氫 鏈 可 隨 意 變 形, 呈 無 序 的 排 列, 而 且 脂 質 分 子 可 在 膜 面 上 自 由 流 動, 形 成 一 個 近 似 二 維 流 體 ;(2) 膠 體 態 (gel-phase 或 稱 之 L β -phase) 存 在 低 溫 高 濕 或 低 濕 下, 脂 膜 碳 氫 鏈 伸 直, 呈 有 序 排 列, 脂 質 分 子 在 膜 面 上 可 呈 二 維 晶 格 排 列, 不 易 流 動 且 不 易 形 變 ;(3) 漣 漪 態 (rippled phase 或 稱 之 P β -phase) 此 為 膠 體 態 與 流 體 態 的 混 合 體, 形 如 波 浪 狀 因 為 生 物 分 子 及 藥 物 分 子 與 脂 膜 作 用, 主 要 是 來 自 這 些 分 子 的 厭 水 部 分 與 脂 膜 厭 水 區 的 結 合, 稱 為 厭 水 匹 配 (hydrophobic matching), 匹 配 的 結 合 能 和 匹 配 產 生 脂 膜 形 變 的 形 變 能, 如 圖 1-6 所 示, 可 以 決 定 這 些 分 子 在 脂 膜 中 的 方 位 與 狀 態 等 高 次 元 結 構 所 以 測 量 這 些 相 態 的 脂 膜 結 構, 尤 其 是 厭 水 區 厚 度 及 其 彈 性 係 數 是 脂 膜 研 究 的 重 點 14

(a) (b) : 生 物 分 子 或 藥 物 分 子 : 脂 質 分 子 : 形 變 ; : 結 合 圖 1-6 生 物 分 子 或 藥 物 分 子 與 脂 膜 作 用 的 示 意 圖 (a) 為 這 些 分 子 吸 附 在 脂 膜 表 面 狀 態 的 示 意 圖 ; (b) 則 為 貫 穿 脂 膜 狀 態 的 示 意 圖 圖 中 虛 線 表 示 脂 膜 原 來 厚 度, 黃 色 表 示 厭 水 性 區 域, 綠 色 與 紅 色 箭 頭 分 別 表 示 脂 膜 與 這 些 分 子 作 用 後, 其 厭 水 匹 配 所 產 生 的 形 變 與 結 合 15

第 二 章 片 層 繞 射 技 術 與 測 量 困 境 如 前 所 言, 一 個 脂 膜 如 同 三 明 治, 中 間 為 碳 氫 鏈 組 成 的 厭 水 區, 此 區 水 分 子 很 難 進 入 ; 兩 側 為 極 性 頭 部 的 親 水 區, 水 分 子 可 以 滲 入 其 中 並 吸 附 在 脂 質 分 子 頭 部 分 子 群 上 一 般 而 言, 脂 膜 的 厚 度 大 約 40~50 埃 (Å), 所 以 光 學 顯 微 鏡 無 法 偵 測 其 結 構 利 用 電 子 顯 微 鏡 或 原 子 力 顯 微 鏡, 雖 可 偵 測 到 幾 個 埃 的 尺 度, 但 只 能 觀 測 脂 膜 表 面, 若 要 觀 測 脂 膜 縱 切 面 的 結 構, 如 圖 1-5 所 示, 則 需 冷 凍 脂 膜 使 其 碎 裂, 再 將 裸 露 的 縱 切 面 加 以 表 面 處 理, 但 如 此 程 序 已 使 脂 膜 失 去 生 物 活 性, 故 實 驗 結 果 的 意 義 大 打 折 扣 因 此 二 十 多 年 來, 測 量 脂 膜 結 構 都 以 核 磁 共 振 散 射 和 繞 射 等 技 術 來 進 行 核 磁 共 振 技 術 能 測 得 脂 膜 分 子 上 作 有 核 磁 共 振 標 定 的 結 構, 所 以 僅 能 得 到 脂 膜 的 局 部 結 構 散 射 技 術 則 需 要 先 建 立 脂 膜 結 構 模 型 來 取 得 理 論 上 之 散 射 數 據, 再 與 實 驗 的 散 射 數 據 擬 合 比 較, 所 以 分 析 的 結 果 與 建 立 的 脂 膜 結 構 模 型 有 關, 故 需 配 合 其 他 獨 立 的 實 驗 才 能 研 判 結 果 的 真 偽 繞 射 技 術 是 將 許 多 單 一 片 層 脂 膜 堆 疊 成 週 期 性 排 列 的 多 片 層, 理 論 上 若 能 產 生 高 階 次 的 繞 射, 即 可 直 接 得 到 脂 膜 的 細 部 結 構, 如 親 水 區 厚 度 厭 水 區 厚 度 及 其 界 面 的 位 置 等, 因 此 繞 射 為 測 量 脂 膜 結 構 的 主 要 方 法, 其 中 又 以 X- 光 片 層 繞 射 技 術 最 為 普 遍, 本 16

論 文 即 利 用 此 技 術 來 研 究 脂 膜, 其 基 本 原 理 與 分 析 步 驟 說 明 如 下 : 第 一 節 片 層 繞 射 技 術 片 層 繞 射 技 術 的 原 理 與 分 析 步 驟, 以 圖 2-1 來 說 明 圖 2-1(a) 為 多 片 層 脂 膜 之 示 意 圖, 兩 個 片 層 間 夾 有 水 層 ( 淺 藍 色 標 示 區 ), 沿 z 方 向 平 行 堆 疊 在 x-y 平 面 上 ;X- 光 入 射 方 向 與 膜 面 的 夾 角 為 θ, 其 入 射 波 向 量 為 k i, 經 多 片 層 脂 膜 反 射, 沿 著 與 k i 夾 2θ 的 方 向 以 k s 反 射 X- 光 由 動 量 守 恆,X- 光 動 量 轉 移 的 大 小 Q = k s - k i = (4π/λ)sinθ, 其 中 λ 為 X- 光 波 長 由 於 多 片 層 堆 疊 的 方 向 垂 直 膜 面, 即 z 方 向, 故 脂 膜 的 電 子 密 度 分 佈 ρ 在 z 方 向 具 有 空 間 週 期 性, 其 空 間 週 期 即 是 脂 膜 的 單 一 片 層 厚 度 D (D 為 厭 水 區 的 厚 度 D c 加 上 親 水 區 的 厚 度 D p, 其 中 D p 包 括 親 水 區 的 脂 膜 頭 部 厚 度 及 脂 膜 片 層 間 的 水 層 厚 度 ) 這 種 多 片 層 脂 膜 在 z 方 向 給 予 X- 光 特 定 大 小 的 動 量 轉 移, Q h = h 2π / D ; h = 1, 2, 3,..., (1) 在 這 條 件 下,X- 光 的 反 射 強 度 會 在 特 定 的 反 射 角 度 上 有 很 強 的 建 設 性 干 涉, 形 成 Bragg 繞 射 峰 一 個 典 型 的 例 子, 如 圖 2-1(b) 所 示, 17

Q h = h (2π / D ); h =0, 1,2, θ k i Qh k s (a) (b) Dc Dp D diffraction instensity z 2θ x y (d) (c) Electron density (ρ) D p /2 D c I h diffraction amplitude(f h ) 0 Q 1 Q 2 Q 4 Q 6 Q 3 Q 5 Q 7 Q 8 Q 9 Q 11 Q 12 Q 10 z (Å) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 Q = 4 π sinθ / λ (Å) 圖 2-1 X- 光 多 片 層 繞 射 的 基 本 原 理 與 數 據 分 析 步 驟 之 示 意 圖 18

為 DMPC 在 10 o C 下 測 得 的 繞 射 圖 繞 射 數 據 的 分 析 步 驟, 首 先 修 正 脂 膜 對 X- 光 的 吸 收, 其 吸 收 因 子 ~ [1 exp(-2μd / sinθ) ], 其 中 d 為 多 片 層 脂 膜 的 總 厚 度,μ 為 脂 膜 對 X- 光 的 吸 收 係 數 ( 吸 收 係 數 的 計 算 如 附 錄 一 所 述 ); 其 次 去 除 X- 光 的 背 景 雜 訊, 再 對 繞 射 峰 作 θ 積 分, 得 Q h 動 量 轉 移 時 的 繞 射 強 度 i h 根 據 X- 光 繞 射 的 基 本 原 理, i h ~ P h L h F h 2, (2) 其 中, P h = 1 + cos 2 2θ h 為 非 極 化 光 修 正 因 子,L h = 1 / sin2θ h 為 Lorentz 修 正 因 子,F h 為 Q h 時 的 繞 射 振 幅 根 據 式 子 (2), 將 i h 作 P h 及 L h 的 修 正, 即 可 得 到 ~ F h 2 由 於 脂 膜 為 兩 邊 對 稱 的 結 構, 故 F h 為 實 數 函 數, 可 正 或 可 負, 本 文 以 swelling 配 合 圖 像 辨 識 方 法 ( 如 附 錄 二 所 述 ) 來 決 定 F h 的 真 值, 所 得 結 果 如 圖 2-1(c) 所 示 最 後, 將 F h 作 傅 立 業 合 成, 即 得 垂 直 膜 面 z 方 向 的 電 子 密 度 分 佈, ρ(z) = Σ h F h cos(q h z) (3) 其 中 Q h 由 (4π/λ)sinθ h = Q h = h 2π / D 決 定 由 (3) 式 求 得 的 ρ(z), 如 圖 2-1(d) 所 示, 即 為 單 一 片 層 脂 膜 的 電 子 密 度 在 z 方 向 的 分 佈 圖 電 子 密 度 分 佈 圖 的 結 構 特 徵 可 決 定 脂 膜 的 細 部 結 構, 如 脂 膜 厭 水 區 的 厚 19

度 D c 親 水 區 的 厚 度 D p 兩 區 的 界 面 位 置 以 及 界 面 到 脂 膜 頭 部 磷 酸 根 PO 4 的 距 離,I h 等 第 二 節 測 量 脂 膜 結 構 所 遭 遇 的 困 境 與 解 決 方 案 利 用 X- 光 片 層 繞 射 技 術, 在 理 論 上 可 以 測 得 脂 膜 細 部 結 構, 但 是 早 期 的 實 驗 使 用 此 技 術 卻 得 不 到, 主 要 是 遭 遇 以 下 兩 個 困 境 : (1) 脂 膜 飽 和 吸 水 ( 亦 即 脂 膜 在 水 中 或 脂 膜 在 相 對 濕 度 100% 的 環 境 下 ) 時, 因 為 水 分 子 極 易 進 出 脂 膜 親 水 的 頭 部 區, 造 成 脂 膜 很 大 的 擾 動, 使 得 多 片 層 脂 膜 之 間 的 空 間 相 干 性 降 低, 如 圖 2-2(a) 所 示, 導 致 高 階 次 繞 射 峰 變 寬 且 變 小 而 埋 入 雜 訊 ;(2) 製 備 多 片 層 脂 膜 採 用 直 接 加 水 於 脂 質 分 子 粉 末, 形 成 球 面 多 片 層 的 微 胞 樣 品, 這 種 樣 品 的 脂 膜 方 向 是 均 向 的 ( 即 非 單 一 指 向 ) 如 圖 2-2(b) 所 示, 所 以 繞 射 強 度 會 隨 繞 射 階 次 的 (a) (b) 水 中 D 圖 2-2 脂 膜 結 構 測 量 所 遭 遇 困 境 的 示 意 圖 20

平 方 而 衰 減, 造 成 高 階 次 的 繞 射 峰 埋 入 雜 訊 中 而 無 法 取 得 這 兩 個 原 因 導 致 早 期 的 脂 膜 測 量, 尤 其 是 流 體 態 的 脂 膜, 最 多 只 能 得 到 4 階 次 的 繞 射 數 據, 以 致 無 法 觀 察 到 脂 膜 親 水 區 - 厭 水 區 的 界 面 而 準 確 地 決 定 出 脂 膜 的 細 部 結 構, 尤 其 是 厭 水 區 的 厚 度 所 以 不 同 的 研 究 群 測 量 同 一 種 脂 膜 的 厭 水 區 厚 度, 常 有 十 幾 個 Å 的 差 異, 幾 乎 與 脂 膜 厚 度 同 屬 一 個 數 量 級, 這 是 無 法 被 科 學 研 究 者 所 接 受 的 直 到 最 近, 第 一 個 困 境 亦 即 脂 膜 擾 動 的 問 題, 才 有 一 個 解 決 的 策 略 : 將 飽 和 吸 水 的 脂 膜, 由 擾 動 較 大 的 流 體 態 降 溫 到 擾 動 較 小 的 膠 體 態 來 量 測 其 結 構, 雖 然 小 的 擾 動 仍 使 界 面 無 法 偵 測 到, 但 卻 能 夠 有 效 地 減 低 估 計 界 面 位 置 的 錯 誤 ; 再 假 定 兩 態 的 脂 膜 頭 部 結 構 相 同, 亦 即 有 相 同 的 界 面 位 置, 則 可 以 有 效 地 決 定 流 體 態 厭 水 區 的 厚 度 此 法 可 以 使 解 析 度 改 進 到 1 Å 然 而, 因 為 有 一 些 生 物 分 子 或 藥 物 分 子, 如 抗 菌 peptide 等 與 脂 膜 的 作 用, 其 厭 水 匹 配 造 成 脂 膜 的 形 變 量, 估 計 都 應 小 於 1 Å, 因 此 雖 其 解 析 度 已 提 升 到 1 Å, 但 仍 然 無 法 適 用 於 研 究 一 些 生 物 藥 物 分 子 與 脂 膜 的 作 用, 所 以 X- 光 片 層 繞 射 技 術 有 必 要 再 改 進 針 對 第 一 個 困 境, 本 文 提 出 一 個 新 的 策 略 : 將 脂 膜 放 入 一 個 低 濕 度 的 水 蒸 汽 環 境 中, 讓 此 環 境 可 對 脂 膜 產 生 高 的 滲 透 壓 力 而 能 吸 出 脂 膜 中 的 水 份 以 降 低 其 含 水 量, 而 消 除 脂 膜 的 擾 動, 如 圖 2-3(a) 所 示 在 此 情 況 下, 使 用 X- 光 片 層 繞 射 即 可 偵 測 到 親 水 區 - 厭 水 區 的 界 面 位 21

置 而 能 精 準 地 測 得 厭 水 區 的 厚 度 ; 再 將 這 種 高 滲 透 壓 下 量 測 的 結 果 外 插 到 滲 透 壓 為 零, 即 可 得 到 飽 和 吸 水 下 的 流 體 態 或 膠 體 態 脂 膜 之 厭 水 區 厚 度 這 個 策 略 的 優 點 是 :(1) 各 相 態 脂 膜 親 水 區 - 厭 水 區 界 面 位 置, 可 在 各 自 的 相 態 下 直 接 決 定, 不 需 要 透 過 不 同 相 態 之 測 量, 也 不 需 作 額 外 的 假 設 ;(2) 可 由 厭 水 區 厚 度 隨 滲 透 壓 的 變 化 率, 得 知 脂 膜 厚 度 壓 縮 係 數 B( 等 義 於 脂 膜 截 面 積 壓 縮 係 數 K a, 因 為 厭 水 區 體 積 V c 是 個 可 形 變 但 不 會 壓 縮 的 恆 定 量 ) 針 對 第 二 個 困 境, 本 文 也 提 出 一 個 改 進 的 方 法 : 將 球 面 狀 的 多 片 (a) (b) 水 蒸 汽 D 玻 璃 基 底 圖 2-3 解 決 脂 膜 結 構 測 量 所 遭 遇 困 境 的 示 意 圖 層 脂 膜 改 成 平 面 狀, 如 圖 2-3(b) 所 示, 讓 脂 膜 成 為 單 一 指 向 性 的 多 片 層 樣 品, 以 提 升 高 階 次 的 X- 光 繞 射 強 度 本 文 利 用 這 種 改 進 的 X- 繞 22

射 技 術 測 量 脂 膜 結 構, 解 析 度 可 達 到 0.1 Å 第 三 章 改 良 的 X- 光 片 層 繞 射 / 滲 透 壓 技 術 23

第 一 節 可 調 控 溫 / 濕 度 的 繞 射 腔 之 設 計 繞 射 腔 的 設 計, 如 圖 3-1 所 示 此 腔 的 設 計 是 為 提 供 一 個 高 滲 透 壓 的 環 境 來 減 少 脂 膜 的 含 水 量, 而 消 除 脂 膜 擾 動 的 困 境, 讓 高 階 次 繞 射 峰 得 以 被 偵 測 到 其 設 計 可 包 含 : (1) 銅 製 繞 射 腔 本 體, 外 部 作 絕 熱 處 理, 以 提 高 溫 度 與 濕 度 控 制 的 穩 定 度, 腔 的 兩 側 各 留 一 個 X- 光 入 射 的 mylar 窗 口 (mylar 為 一 種 可 讓 X- 光 幾 乎 完 全 通 過 的 薄 膜, 厚 度 約 0.1μm) (2) 銅 製 的 樣 品 基 座, 置 於 繞 射 儀 中 心 位 置, 基 座 上 有 一 個 白 金 熱 敏 電 阻, 可 偵 測 樣 品 溫 度, 將 溫 度 讀 值 送 至 電 腦, 以 proportional-differential-integrating(pdi) 自 動 控 制 原 理 計 算 電 流 值, 由 電 腦 命 令 GPIB 卡 控 制 的 電 流 供 應 器 輸 出 電 流 給 thermo-electric cooler, 將 樣 品 溫 度 控 制 於 實 驗 所 需 的 恆 溫 值 ( 溫 度 可 控 範 圍 0 o C ~ 70 o C, 精 準 度 可 達 ±0.025 o C) (3) 獨 立 溫 控 的 水 槽 ( 溫 控 原 理 如 上 所 述 ), 利 用 水 槽 內 的 水 溫 調 控 腔 內 的 相 對 濕 度 (RH%), 以 控 制 脂 膜 的 含 水 量 濕 度 是 利 用 棒 soller slit (s1) 2θ soller slit (s4) 24

slit (s5) x-ray tube slit (s2) slit (s3) detector chamber θ 2θ thermally insulating box mylar windows thermostat sample holder thermostat water reservior hygrometer sample stand goniometer 圖 3-1 可 調 控 溫 / 濕 度 繞 射 腔 的 實 驗 裝 置 示 意 圖 狀 的 溫 濕 度 計 ( 精 準 度 0.1 o C / 0.1% RH, Rotronic, AM3, 25

HYGROMER ) 插 入 腔 內 鄰 近 脂 膜 處 來 測 量 由 相 對 濕 度 可 得 滲 透 壓 Π, 其 關 係 式 為 Π = - (k B T/ v W ) log (RH%), 式 中 的 T 為 樣 品 溫 度, k B 為 波 茲 曼 常 數, v W 為 一 個 水 分 子 的 體 積 本 腔 可 控 的 濕 度 範 圍 由 2% 到 98%, 此 相 對 於 滲 透 壓 範 圍 約 為 5000 到 10 大 氣 壓 ( 註 :1 大 氣 壓 ~ 10 6 dyne/cm 2 ) 第 二 節 單 一 指 向 性 多 片 層 脂 膜 的 製 備 本 文 為 了 解 決 片 層 繞 射 在 測 量 上 所 遭 遇 的 第 二 個 困 境, 即 脂 膜 非 單 一 指 向 性 造 成 高 階 次 繞 射 無 法 被 偵 測 的 困 境, 故 研 發 出 一 種 製 備 單 一 指 向 的 多 片 層 平 面 脂 膜 的 方 法, 稱 之 為 多 次 滴 定 鍍 膜 法, 其 製 備 流 程 如 下 : (1) 將 脂 質 分 子 溶 於 甲 醇 / 氯 仿 = 1/1( 體 積 比 ) 混 合 的 溶 劑 中, 配 製 成 每 20μl 樣 品 溶 液 中 內 含 有 1mg 脂 質 分 子 的 樣 品 溶 液, 此 濃 度 配 方 為 多 次 滴 定 鍍 膜 法 的 最 佳 濃 度 (2) 控 制 鍍 膜 環 境, 使 脂 膜 處 於 流 體 態 ( 溫 度 ~25 o C 濕 度 ~ 90%, 此 為 一 般 的 條 件, 實 際 上 需 依 照 不 同 脂 膜 稍 作 調 整 ), 讓 脂 膜 分 子 能 在 高 流 體 性 的 相 態 下, 很 容 易 地 調 整 排 列, 形 成 具 有 較 大 單 一 指 向 性 面 積 的 脂 膜 26

(3) 首 先 抽 取 20μl 的 樣 品 溶 液, 均 勻 地 釋 放 在 玻 片 上, 待 其 乾, 脂 膜 自 然 地 形 成, 重 複 此 步 驟, 即 可 在 玻 片 上 堆 疊 出 單 一 指 向 性 的 多 片 層 脂 膜, 其 基 本 道 理 與 長 晶 相 同 (4) 將 多 次 滴 定 鍍 好 的 脂 膜 ( 約 含 5mg 的 脂 質 分 子, 面 積 大 小 為 15 15mm 2 ( 寬 高 ), 估 計 片 層 數 約 有 8000 層 ), 放 入 真 空 腔 中 抽 乾, 以 防 溶 劑 的 殘 留 (5) 放 入 一 個 可 控 溫 濕 度 的 腔 內, 在 高 溫 高 濕 下 讓 脂 膜 更 均 勻 地 調 整 排 列, 再 次 提 高 其 單 一 指 向 性, 約 一 天 後 取 出 (6) 放 入 一 個 可 溫 控 的 顯 微 鏡 腔, 利 用 配 有 偏 極 板 的 光 學 顯 微 鏡 來 檢 視 脂 膜 中 具 有 單 一 指 向 性 的 面 積 分 佈 大 小, 如 圖 3-2(a) (b) 所 示, 為 DLPC 脂 膜 在 25 o C, RH~95% 下 屬 合 格 樣 品 的 影 像 ( 典 型 代 表 ), 圖 中 黑 色 暗 區 即 為 單 一 指 向 排 列 的 脂 膜, 而 白 色 亮 紋 則 為 非 單 一 指 向 排 列 的 脂 膜 由 於 樣 品 是 置 於 兩 片 偏 振 方 向 相 互 垂 直 的 偏 極 板 之 間 來 觀 測, 所 以 若 是 脂 膜 的 碳 氫 鏈 指 向 與 入 射 光 前 進 的 方 向 平 行, 則 入 射 光 的 偏 振 方 向 不 會 被 脂 膜 改 變, 因 此 入 射 光 源 就 無 法 27

穿 過 第 二 片 偏 極 板, 故 得 到 黑 色 的 圖 像 但 若 碳 氫 鏈 的 指 向 與 入 射 光 前 進 的 方 向 不 是 平 行 時, 則 入 射 光 偏 振 方 向 就 會 被 脂 膜 改 變, 致 使 部 分 光 源 可 穿 過 第 二 片 偏 極 板 而 形 成 白 色 亮 紋 的 圖 像 這 種 非 單 一 指 向 的 脂 膜 區, 具 有 各 種 排 列 方 式 與 形 狀, 因 此 會 產 生 各 種 不 同 (a) (b) 100μm 圖 3-2 DLPC 脂 膜 在 偏 極 化 顯 微 鏡 下 測 得 的 影 像 28

形 狀 的 亮 紋 圖 像, 如 圖 3-2(a) (b) 所 示, 即 為 其 中 的 兩 個 常 見 的 例 子 經 此 檢 視 篩 選 後, 合 格 者 才 放 入 X- 光 繞 射 腔 進 行 繞 射 實 驗 第 三 節 實 驗 步 驟 首 先 將 篩 選 後 的 脂 膜 樣 品 垂 直 插 入 樣 品 基 座 後 封 閉 繞 射 腔 ( 參 考 圖 3-1), 再 將 樣 品 控 制 到 測 量 時 所 需 要 的 溫 度 與 滲 透 壓 下, 待 樣 品 達 到 平 衡 後 ( 預 計 每 個 溫 度 滲 透 壓 下 達 到 平 衡 時 間, 至 少 需 要 6 小 時 以 上 ), 再 使 用 銅 靶 X- 光 繞 射 儀 (Shimadzu, XD-610, 其 X- 光 波 長 為 1.54Å, 運 轉 模 式 為 θ 2θ, 強 度 為 30 kv, 30mA), 以 每 秒 0.005 度 的 改 變 率, 由 θ = 0.5 度 掃 描 到 13 度 得 其 繞 射 圖 平 均 在 每 一 個 滲 透 壓 下 至 少 連 續 掃 描 5 次, 其 中 必 須 有 連 續 3 次 掃 描 結 果 一 樣, 才 視 為 平 衡 測 量 過 程 中, 均 使 用 等 溫 下 改 變 滲 透 壓 方 式 並 重 複 以 上 的 步 驟, 以 取 得 各 滲 透 壓 下 的 繞 射 數 據, 再 將 這 些 繞 射 數 據 作 處 理 與 分 析 ( 如 第 二 章 的 第 一 節 中 所 述 ), 可 得 到 各 滲 透 壓 下 各 階 次 繞 射 峰 的 繞 射 振 幅, 然 後 透 過 傅 立 業 合 成 來 得 到 每 一 個 滲 透 壓 下 脂 膜 的 電 子 密 度 分 佈 圖, 由 此 圖 的 結 構 特 徵 決 定 出 脂 膜 的 細 部 結 構 以 下 將 用 一 個 典 型 實 例 來 說 明 整 個 實 驗 步 驟 圖 3-3 所 示 為 DMPC 脂 膜 在 23.5 o C 時 各 滲 透 壓 下 所 測 得 的 繞 射 圖 ( 典 型 代 表 ) 由 圖 發 現, 每 一 個 滲 透 壓 下 均 可 測 得 10 階 次 以 上 的 高 階 繞 射 圖, 且 各 階 次 29

繞 射 峰 的 寬 度 均 沒 有 隨 階 次 增 高 而 變 寬, 這 結 果 顯 示 本 文 改 良 X- 片 層 繞 射 技 術, 的 確 已 有 成 效 x22.0 DM PC 23.5 Π (10 8 dyne/cm 2 ) ; RH% Intensity(arb. unit) 8.11 55.3 4.56 71.7 2.54 83.1 1.40 90.3 5 10 15 20 25 2 θ (deg) 圖 3-3 DMPC 脂 膜 在 23.5 o C 時 各 滲 透 壓 下 的 繞 射 圖 30

將 這 些 繞 射 數 據 依 據 第 二 章 的 第 一 節 所 述 之 分 析 步 驟 作 處 理, 即 可 得 到 各 滲 透 壓 下 每 一 個 繞 射 圖 中 各 階 次 繞 射 峰 的 繞 射 振 幅, 然 後 依 據 如 附 錄 二 所 述 的 膨 脹 與 圖 像 辨 識 法, 決 定 出 各 階 次 繞 射 振 幅 的 真 值 後, 放 在 一 起, 即 得 到 圖 3-4 最 後 將 各 階 次 繞 射 振 幅 作 傅 立 業 合 成, 即 得 脂 膜 在 各 個 滲 透 壓 下 沿 著 垂 直 膜 面 方 向 的 電 子 密 度 分 佈 圖, 如 圖 3-5 所 示 ( 典 型 代 表 ) 由 圖 得 知, 每 個 滲 透 壓 下 得 到 的 電 子 密 度 分 佈 圖 均 展 現 出 兩 個 主 峰 與 次 峰 的 結 構 特 徵, 而 且 主 次 峰 間 的 距 離 均 維 持 在 4.85±0.02Å 其 中 主 峰 為 磷 酸 根 PO 4 的 位 置, 因 為 PO 4 為 脂 膜 中 電 子 密 度 最 高 的 分 子 團 而 次 峰 的 形 成, 在 理 論 上 研 判 應 該 是 由 甘 油 基 上 的 碳 氧 原 子 群 所 致, 其 位 置 應 為 親 水 區 - 厭 水 區 之 界 面 ( 如 前 言 0 DMPC 23.5 F(q) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 q (Å -1 ) 圖 3-4 DMPC 脂 膜 在 23.5 o C 時 各 滲 透 壓 下 各 階 次 的 繞 射 振 幅 31

中 所 述 ) 但 實 際 上 是 由 那 些 原 子 所 形 成 是 否 為 界 面 所 在? 則 需 要 如 下 的 進 一 步 分 析 由 文 獻 得 知, 膠 體 態 與 結 晶 態 的 分 子 結 構 非 常 類 似, 其 碳 氫 鏈 均 為 伸 直 有 序 狀, 而 兩 者 的 差 異, 僅 為 膠 體 態 脂 膜 具 有 些 許 擾 動 而 結 晶 態 則 沒 有 故 DMPC 在 23.5 o C 下 測 得 的 膠 體 態 脂 之 電 子 密 度 分 佈 圖 應 可 與 結 晶 態 脂 膜 作 比 較, 來 分 析 次 峰 : 由 已 知 的 結 晶 結 構 [7, 8], DMPC 23.5 o C Π (10 8 dyne/cm 2 ) ; RH% 8.11 55.3 4.56 71.7 2.54 83.1 1.40 90.3 I h D c /2 PtP/2 D/2-10 0 10 20 30 40 50 圖 3-5 DMPC 在 23.5 o C 下 在 各 滲 透 壓 所 測 得 的 電 子 密 度 分 佈 圖 32

得 到 沿 著 垂 直 膜 面 方 向 其 結 晶 分 子 上 每 一 個 原 子 的 位 置 z i 與 其 原 子 數 N i 的 關 係 圖, 如 圖 3-6 (a) 所 示 由 此 圖 可 重 新 架 構 出 結 晶 態 的 DMPC 沿 z 軸 方 向 的 分 子 結 構, 如 圖 3-6(b) 所 示 將 圖 3-6(a) 中 每 個 原 子 位 置 上 的 電 子 數 給 予 一 個 高 斯 分 佈, 以 模 擬 膠 體 態 脂 膜 的 些 許 擾 動 [9], 則 電 子 密 度 分 佈 應 為 ρ = N exp[ ( z ) 2 / σ 2 ], 其 中 σ 為 電 子 在 空 間 i i zi z 方 向 的 分 佈 範 圍, 其 值 由 1Å 到 3Å 的 範 圍 皆 能 相 同 圖 3-6(c) 所 示, 為 σ = 2Å 時 所 得 到 的 電 子 密 度 分 佈 圖 比 較 圖 3-6(c) 與 圖 3-5, 發 現 兩 者 的 電 子 密 度 分 佈 圖 都 有 展 現 出 主 峰 與 次 峰 的 結 構 特 徵, 且 經 由 高 斯 函 數 擬 合 得 到 的 主 次 峰 間 的 距 離 I h, 發 現 結 晶 態 為 4.6Å 與 膠 體 態 實 驗 測 得 的 4.85 Å 非 常 相 近, 因 此 推 論 在 主 次 峰 的 區 間 內 兩 者 應 具 有 相 同 的 分 子 結 構 比 較 圖 3-6 (b) 與 (c), 得 知 次 峰 為 甘 油 基 的 C3-C2-O21 以 及 L 形 的 β-chain 上 的 C21-C22 等 原 子 在 這 個 位 置 上 聚 集 產 生 高 電 子 密 度 所 致 由 以 上 的 分 析, 得 知 電 子 密 度 分 佈 圖 上 的 次 峰 是 那 些 原 子 形 成, 但 其 位 置 是 否 真 為 界 面 所 在, 仍 需 要 其 他 的 實 驗 證 據 支 持 方 能 確 定 由 於 膠 體 態 脂 膜 的 碳 氫 鏈 具 有 伸 直 傾 斜 的 特 性, 同 時 由 I h 的 不 變 性 得 知, 脂 質 分 子 的 頭 部 分 子 群 結 構 不 會 隨 濕 度 而 改 變, 但 由 文 獻 得 知 [10,11],Simth 等 人 利 用 散 射 技 術 測 得 DMPC 在 23.5 o C 時, 11], 發 現 傾 斜 角 會 隨 濕 度 增 高 而 增 大 ( 即 表 示 碳 氫 鏈 的 截 面 積 隨 濕 度 增 高 33

而 變 大 ), 如 圖 3-7(a) 空 心 圓 所 示 這 顯 示 增 濕 時, 水 分 子 可 以 滲 入 到 頭 部 區 而 與 脂 質 分 子 的 頭 部 分 子 群 結 合, 增 大 脂 膜 親 水 頭 部 區 的 截 面 15 (a) 10 N i 5 ρ' (arb. unit) 0 100 80 60 40 20 0 0 10 20 30 14 13 N 15 12 11 O14 P O11 O13 1 3 31 33 2 O31 32 34 O21 O32 γ-chain 35 36 37 38 39 310 311 312 313 314 21 O22 22 23 24 25 26 27 28 29 210 211 212 213 214 4.6 Å z i (Å) β-chain 0 10 20 30 z (Å) (b) (c) 圖 3-6 為 DMPC 結 晶 的 分 子 結 構 與 數 值 模 擬 得 到 的 電 子 密 度 分 佈 圖 其 中 結 晶 的 DMPC 結 構 (a) (b) 取 自 Pearson 與 Pascher 在 1979 年 所 發 表 的 文 獻 ; (c) 即 以 ρ = N exp[ ( z ) 2 / σ 2 ], 其 i i zi 中 σ = 2 Å, 所 作 的 電 子 密 度 分 佈 數 值 模 擬 的 結 果 34

積, 致 使 碳 氫 鏈 傾 斜 角 度 增 大 Chain Tilt Angle θ (deg) 35 30 25 P β' L βι L βl L βf (a) 20 Main Peak Secondary Peak 1 10 Π(10 8 dyne/cm 2 ) I h (b) β-chain γ-chain Dhc PtP D c θ I h 圖 3-7 (a) 為 傾 斜 角 θ 隨 滲 透 壓 的 變 化 圖 其 中 實 心 圓 為 我 們 測 得 的 D c 以 選 擇 D hc = 36.7 Å 時 所 得 到 的, 空 心 圓 為 Simth 等 人 直 接 測 得 的 傾 斜 角 θ (b) 為 膠 體 態 的 脂 質 分 子 組 成 雙 層 結 構 的 脂 膜 時 之 模 型 所 以 Smith 等 人 的 測 量, 可 以 確 定 水 分 子 在 增 濕 時 會 滲 入 頭 部 區 內, 而 到 達 碳 氫 鏈 傾 斜 的 轉 動 軸 點, 因 此 轉 動 軸 點 即 為 親 水 區 - 厭 水 區 的 界 面 本 文 將 作 以 下 的 進 一 步 分 析 確 定 測 量 到 的 電 子 密 度 分 佈 圖 上 35

的 次 峰 位 置 即 為 轉 動 軸 點, 故 為 界 面 所 在 : 假 設 兩 次 峰 間 之 距 離 即 為 厭 水 區 厚 度 D c, 若 碳 氫 鏈 的 長 度 為 D hc, 則 其 傾 斜 角 度 θ tilt, 可 由 cos θ tilt = D c / D hc 求 得 圖 3-7(a) 中 實 心 圓 為 D hc = 36.7 Å 時 ( 此 值 乃 根 據 圖 3-7(b) 所 示 的 分 子 模 型 所 估 得 的 數 值 其 詳 細 內 容 如 附 錄 三 所 述 ), 由 測 量 之 D c 所 求 得 的 傾 斜 角 度 θ tilt 隨 滲 透 壓 的 變 化 圖 比 較 空 心 與 實 心 的 數 據 得 知, 在 整 個 量 測 的 濕 度 範 圍 內 兩 個 實 驗 結 果 完 全 相 同, 顯 示 次 峰 位 置 就 是 碳 氫 鏈 傾 斜 的 轉 軸, 故 為 界 面 的 位 置 依 此, 兩 個 次 峰 間 的 距 離 應 為 脂 膜 厭 水 區 厚 度 D c 第 四 節 脂 膜 研 究 的 實 驗 程 序 由 DMPC 在 23.5 o C 時 各 滲 透 壓 下 的 測 量 結 果, 得 知 改 良 的 X- 光 片 層 繞 射 / 滲 透 壓 技 術 已 經 克 服 脂 膜 擾 動 及 非 單 一 指 向 性 的 困 境, 而 能 偵 測 到 脂 膜 的 細 部 結 構, 如 親 水 區 厚 度 D p 厭 水 區 的 厚 度 D c 等 依 此, 本 文 研 究 脂 膜 的 實 驗 策 略, 採 等 溫 變 濕 的 測 量, 亦 即 測 量 每 一 個 溫 度 下, 脂 膜 在 各 滲 透 壓 時 的 結 構 基 本 上 這 種 實 驗 策 略 可 得 以 下 的 結 果 : (1) 脂 膜 的 T-Π 相 態 圖, 此 圖 可 瞭 解 脂 膜 各 種 相 態 存 在 的 環 境 與 相 變 的 條 件, 並 可 由 滲 透 壓 外 插 方 式 取 得 各 相 態 在 飽 和 吸 水 下 的 脂 膜 36

結 構 (2) 由 脂 膜 結 構 與 溫 度 T 的 關 係 得 其 熱 力 學 性 質, 如 脂 膜 厚 度 或 截 面 積 的 熱 膨 脹 係 數 (3) 由 脂 膜 結 構 與 滲 透 壓 Π 的 關 係 得 其 彈 性 性 質, 如 脂 膜 厚 度 或 截 面 積 的 壓 縮 係 數 本 論 文 利 用 此 實 驗 程 序, 針 對 DLPC DMPC 及 DPhPC 等 三 種 磷 脂 膜 作 測 量, 得 到 的 T-Π 相 態 圖, 如 圖 2-8 (a) (b) 和 (c) 所 示 圖 上 的 圓 心 標 記 為 所 有 測 量 點 的 溫 度 T 與 滲 透 壓 Π, 其 中 空 心 圓 代 表 兩 種 相 態 共 存 時 的 測 量 點, 實 心 圓 為 單 一 相 態 的 測 量 點 比 較 圖 3-8 (a) 與 (b), 發 現 兩 者 的 相 態 圖 十 分 相 似, 顯 示 DLPC 與 DMPC 兩 種 飽 和 碳 氫 鏈 脂 膜 應 具 有 很 多 共 同 性 質, 因 此 在 下 一 章 ( 第 四 章 的 第 一 ~ 三 節 ) 中, 分 別 對 這 種 脂 膜 處 於 流 體 態 或 膠 體 態 時, 作 進 一 步 分 析 另 外, 由 圖 3-8 (b) 與 (c) 的 比 較, 發 現 飽 和 具 有 支 鏈 的 脂 膜 DPhPC, 展 現 與 DMPC 不 同 之 相 態 特 徵, 顯 示 DPhPC 可 能 擁 有 獨 特 的 性 質, 故 在 第 四 章 的 第 四 節 中 對 DMPC 與 DPhPC 兩 種 脂 膜 作 一 個 比 較 性 的 研 究 37

Π (10 8 dyne/cm 2 ) 30 DLPC (a) 20 10 g 1 g 2 L α 0-5 0 5 10 15 20 25 30 35 T ( o C) g 3 Π (10 8 dyne/cm 2 ) 6 (b) DMPC 4 2 L β' 0 P L β' α 10 15 20 25 30 35 T ( o C) Π (10 8 dyne/cm 2 ) 6 (c) DPhPC 4 L α ' 2 L α 0 0 20 40 60 80 T ( o C) 圖 3-8 為 DLPC DMPC 和 DPhPC 等 脂 膜 的 T-Π 相 態 圖 38

第 四 章 結 果 與 討 論 第 一 節 飽 和 碳 氫 鏈 脂 膜 的 基 本 特 性 第 二 節 流 體 態 的 脂 膜 之 臨 界 膨 脹 第 三 節 膠 體 態 的 脂 膜 之 滲 透 壓 門 檻 第 四 節 脂 膜 有 序 - 無 序 的 相 變 39

第 一 節 飽 和 碳 氫 鏈 脂 膜 的 基 本 性 質 本 節 以 X- 光 片 層 繞 射 / 滲 透 壓 技 術 測 量 DLPC( 含 12 個 碳 數 ) 與 DMPC( 含 14 個 碳 數 ) 兩 種 飽 和 碳 氫 鏈 脂 膜 ( 其 繞 射 數 據 的 分 析 如 第 二 章 所 述 ), 得 到 結 果 如 下 : 1. I h 具 有 不 變 性 如 圖 4-1 (a) (b) 所 示, 分 別 為 DLPC 在 35 o C 與 DMPC 在 23.5 o C 時 在 各 滲 透 壓 下, 測 得 的 電 子 密 度 分 佈 圖 ( 典 型 代 表 ) 比 較 (a) 與 (b) 圖, 發 現 兩 種 脂 膜 在 各 滲 透 壓 下 的 膠 體 態 以 及 在 高 滲 透 壓 下 的 流 體 DLPC 35.0 o C Π (10 8 dyne/cm 2 ) ; RH% 38.74 6.5 (a) DMPC 23.5 o C Π (10 8 dyne/cm 2 ) ; RH% 8.11 55.3 (b) gel 22.19 20.9 ρ (arb. unit) L α 22.19 20.9 20.35 23.8 4.40 73.3 4.56 71.7 2.54 83.1 1.40 90.3 0.18 98.7 I h Dc /2 I h D c /2 PtP/2 D/2 PtP/2 D/2-10 0 10 20 30 40 50 z(å) -10 0 10 20 30 40 50 圖 4-1 為 分 別 為 DLPC 在 35 o C 與 DMPC 在 23.5 o C 下 在 各 滲 透 壓 所 測 得 的 電 子 密 度 分 佈 圖 40

態, 其 電 子 密 度 分 佈 圖 中 均 有 主 次 峰, 且 主 次 峰 之 間 的 距 離 均 維 持 在 4.85±0.02Å 此 外, 在 其 他 溫 度 滲 透 壓 下 的 所 量 測 結 果 也 都 顯 示 I h 為 此 固 定 值 如 圖 4-2 所 示, 即 為 DMPC 分 別 在 溫 度 為 10 16 及 23.5 o C 下, 所 測 得 的 I h 隨 滲 透 壓 的 變 化 圖 ( 典 型 代 表 ) 由 圖 得 知 在 所 有 T Π 下, 其 I h 都 維 持 在 4.85±0.02Å 的 範 圍 內 這 結 果 顯 示, I h (Å) 8 6 4 DMPC L β' 10.0 ( o C) 16.0 23.5 2 0.01 0.1 1 10 Π (10 8 dyne/cm 2 ) 圖 4-2 為 DMPC 脂 膜 在 溫 度 為 10 16 及 23.5 o C 下 所 測 得 的 I h 隨 滲 透 壓 變 化 圖 飽 和 碳 氫 鏈 的 脂 膜 在 膠 體 態 與 流 體 態 時 其 頭 部 分 子 群 由 PO 4 到 界 面 的 分 子 結 構 具 有 不 變 性, 不 隨 溫 度 滲 透 壓 改 變, 也 與 碳 氫 鏈 長 度 無 關, 其 距 離 為 一 個 固 定 值, 即 I h =4.85 Å 因 此 脂 膜 在 膠 體 態 與 高 滲 透 壓 下 的 流 體 態, 均 可 直 接 由 其 電 子 密 度 分 佈 圖 上 兩 次 峰 間 的 距 離 測 得 厭 水 41

區 的 厚 度 D c 但 流 體 態 脂 膜 在 增 濕 到 靠 近 飽 和 吸 水 時, 其 電 子 密 度 分 佈 圖 中 的 次 峰 就 會 消 失, 如 圖 4-1(a) 中 在 RH > 73.3% 所 示 這 是 由 於 脂 膜 在 高 含 水 量 時 水 分 子 較 易 進 出 頭 部 區, 而 使 得 界 面 上 的 原 子 佔 據 較 寬 範 圍 而 降 低 其 電 子 密 度, 所 以 使 得 原 來 的 次 峰 無 法 再 展 現 ( 次 峰 值 的 產 生 如 第 二 章 的 第 三 節 中 所 論 述, 是 由 於 界 面 上 的 原 子 群 聚 集 在 狹 窄 的 範 圍 所 致 ), 但 是 其 界 面 的 平 均 位 置 仍 應 不 變, 所 以 從 磷 酸 根 D (Å) 52 48 DLPC 3.6 ( o C) 6.2 29.8 10.4 35.0 15.0 40.0 20.0 45.0 25.0 50.0 (a) 56 52 DMPC 25.0 ( o C) 26.0 28.0 30.0 32.0 34.0 41.0 (c) 44 48 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 34 (b) 38 (d) PtP (Å) 32 36 30 34 0 1 2 3 4 Π (10 8 dyne/cm 2 ) 0 1 2 3 4 Π (10 8 dyne/cm 2 ) 圖 4-3 (a,b) 為 DLPC 的 D 與 PtP 隨 滲 透 壓 Π 的 變 化 圖 (c,d) 則 為 DMPC 的 D 與 PtP 隨 滲 透 壓 Π 的 變 化 圖 圖 中 實 線 是 以 至 少 二 階 次 以 上 的 多 項 式 函 數 擬 合 所 得 的 數 據 42

PO 4 到 界 面 的 平 均 距 離, 仍 然 應 維 持 在 4.85Å 依 此, 高 含 水 量 下 的 流 體 態 脂 膜 雖 然 沒 有 產 生 次 峰, 但 其 厭 水 區 的 厚 度 D c 仍 然 可 求, 即 由 兩 主 峰 間 的 距 離 PtP 減 去 兩 倍 的 I h 值,D c = PtP 2I h = PtP 9.7 Å 因 此 實 驗 上 只 要 能 精 準 地 測 得 PtP 即 可 測 得 厭 水 區 的 厚 度 圖 4-3(b) (d) 所 示, 即 為 這 兩 種 脂 膜 的 PtP 隨 滲 透 壓 的 變 化 圖 圖 4-3(a) (c) 所 示, 為 單 一 片 層 脂 膜 的 厚 度 D 隨 滲 透 壓 的 變 化 圖, 其 中 D 為 厭 水 區 的 厚 度 D c 加 上 親 水 區 的 厚 度 D p D 可 直 接 由 繞 射 峰 之 角 度, 依 據 (4π/λ)sinθ h = h 2π / D 的 Bragg 繞 射 公 式 來 決 定, 其 中 h 為 繞 射 峰 的 階 次 在 本 論 文 中, 均 以 第 4 階 次 繞 射 峰 位 置 來 決 定 D 2. 具 有 相 同 的 厚 度 熱 膨 脹 性 質 由 圖 4-3(b) 及 (d) 得 知, 當 Π > 0 時, 所 有 溫 度 的 PtP 都 趨 近 其 極 限 值, 顯 示 高 滲 透 壓 下 得 到 的 PtP 可 以 合 理 地 外 插 到 Π = 0 因 此, 由 PtP 9.7Å 來 計 算 流 體 態 脂 膜 在 各 滲 透 壓 下 的 厭 水 區 厚 度 D c, 再 外 插 得 到 Π = 0 時 的 厭 水 區 厚 度 D co ( 在 結 構 參 數 的 符 號 之 足 碼 上, 若 有 外 加 o 則 表 示 其 為 Π = 0 時 的 結 構 ), 如 圖 4-4 (a) 所 示, 即 為 DLPC 與 DMPC 利 用 外 插 法 所 得 的 D co 隨 相 對 溫 度 T-T m ( 其 中 T m 為 相 變 溫 度,DLPC 的 T m = 1 o C ; DMPC 的 T m = 24 o C) 的 變 化 圖 將 D co 對 每 一 43

個 碳 鏈 長 度 作 歸 一 處 理 得 到 C-C 原 子 間 的 平 均 距 離, 即 D co /2n ( 其 中 n 為 碳 個 數, 對 於 DLPC n=12 ; DMPC 則 n=14), 發 現 這 兩 種 脂 膜 的 C-C 原 子 間 的 平 均 距 離 僅 與 相 對 溫 度 T-T m 有 關 而 與 碳 氫 鏈 長 度 無 關, 如 圖 4-4(b) 所 示, 這 結 果 顯 示 這 兩 種 不 同 鏈 長 的 脂 膜 具 有 相 同 的 厚 度 28 26 DLPC DMPC (a) D co (Å) 24 22 20 18 0 10 20 30 40 50 D co / 2n (Å) 1.2 1.0 0.8 DLPC DMPC (b) 0.6 0 10 20 30 40 50 T-T m ( o C) 圖 4-4 (a) 分 別 為 DLPC 與 DMPC 的 D co 隨 相 對 溫 度 T-T m 的 變 化 圖, 其 中 DLPC 的 T m =-1 o C,DMPC 的 T m =24 o C (b) 為 平 均 C-C 間 的 距 離 D co /2n 隨 相 對 溫 度 T-T m 的 變 化 圖, 其 中 n 為 碳 氫 鏈 上 碳 原 子 的 個 數,DLPC 的 n=12,dmpc 的 n=14 44

熱 膨 脹 3. 具 有 相 同 的 截 面 積 壓 縮 一 個 處 在 滲 透 壓 為 Π 的 平 衡 狀 態 下 之 平 面 脂 膜, 厭 水 區 - 親 水 區 的 界 面 張 力 ( 使 截 面 積 縮 小, 減 少 厭 水 區 暴 露 ) 與 親 水 頭 部 區 ( 由 頭 部 頂 端 的 膽 鹼 基 (choline) 分 子 群 連 結 甘 油 基 頸 部 到 界 面 的 區 域 ) 及 厭 水 區 產 生 的 橫 向 排 斥 力 ( 使 截 面 積 增 大 ), 相 互 平 衡 [12-14] 如 圖 4-5 所 示, 親 水 頭 部 區 ( 紅 色 虛 線 標 示 之 直 圓 柱 ) 的 壓 力 P, 主 要 是 由 滲 入 此 區 的 水 分 子 所 產 生 若 親 水 頭 部 區 的 厚 度 為 αi h, 截 面 積 的 半 徑 為 r, 則 此 壓 力 對 相 鄰 的 脂 質 分 子 之 頭 部 分 子 群 (head-group) 產 生 向 外 排 斥 力,f p αi h P 親 水 區 : 排 斥 力 : 界 面 張 力 厭 水 區 : 水 分 子 : 脂 質 分 子 頭 部 分 子 群 : 親 水 頭 部 區 圖 4-5 脂 膜 力 平 衡 時 的 示 意 圖 P 為 水 分 子 在 親 水 頭 部 區 產 生 的 壓 力 ;αi h 為 頭 部 區 之 厚 度 45

= P 2πr αi h 因 為 實 驗 證 實 脂 質 分 子 頭 部 群 的 結 構 具 有 不 變 性, 所 以 P 對 界 面 產 生 的 向 外 延 展 張 力, 即 為 σ = f p / 2πr = αi h P, 此 σ 應 與 界 面 張 力 相 互 平 衡 另 外, 在 平 衡 時, 由 滲 透 壓 的 定 義 得 知, 在 頭 部 區 的 水 分 子 之 化 學 能 應 為 μ w = μ o v w Π, 其 中 μ o 為 液 態 水 之 化 學 能 所 以 增 加 滲 透 壓 會 降 低 μ w ; 而 降 低 P, 即 dπ = (1 / v w ) dμ w = (1/v w ) ( μ w / P) dp = dp 因 此, 由 σ = αi h P 得 知,dΠ 造 成 表 面 延 展 張 力 之 改 變 dσ, 應 為 dσ = α I h dp = αi h dπ 依 據 截 面 積 壓 縮 係 數 一 般 定 義, 即 K a = A ( σ / Α) Τ, 即 得 計 算 K a 的 新 公 式 ( 舊 公 式 中 的 錯 誤, 如 附 錄 四 所 述 ), K a = αi h A ( Π / Α) Τ (1) 其 中 脂 膜 的 截 面 積 A = 2 V c / D c,v c 為 不 可 壓 縮 的 厭 水 區 的 體 積, 可 視 為 一 固 定 值, 所 以 A/ dα = D c / d D c ; 代 入 (1) 式, 即 得 : K a = αi h D c ( Π / D c ) Τ (2) 46

由 (2) 式 得 知, 測 量 厭 水 區 厚 度 D c 隨 Π 的 變 化 即 可 得 到 脂 膜 的 截 面 積 壓 縮 係 數 K a 本 文 依 據 (2) 式, 分 別 計 算 當 α = 2 時,DLPC 與 DMPC 脂 K ao (dyne/cm) 400 300 200 100 DLPC DMPC 0 10 20 30 40 50 T-T m ( o C) 圖 4-6 分 別 為 DLPC 與 DMPC 脂 膜, 在 飽 和 吸 水 時, 脂 膜 的 截 面 積 壓 縮 係 數 K a 隨 相 對 溫 度 T-T m 的 變 化 圖 膜 在 各 溫 度 滲 透 壓 下 的 K a, 再 由 滲 透 壓 外 插, 得 到 各 溫 度 下 Π =0 時 的 截 面 積 壓 縮 係 數 K ao, 所 得 結 果 如 圖 4-6 所 示, 其 中 溫 度 表 示 成 相 對 溫 度 T-T m 由 圖 得 知 這 兩 種 脂 膜 在 相 同 T-T m 溫 度 下 具 有 相 同 截 面 積 壓 縮 係 數, 而 當 溫 度 愈 接 近 相 變 溫 度 T m 時 其 係 數 愈 小, 顯 示 出 低 溫 脂 膜 的 截 面 積 愈 容 易 壓 縮 形 變 相 反 地, 溫 度 愈 高 則 係 數 愈 大, 顯 示 脂 膜 在 高 溫 時 其 截 面 積 較 不 容 易 壓 縮 形 變 這 個 脂 膜 的 壓 縮 性 質 明 顯 地 和 一 般 物 質 隨 溫 度 增 高 較 易 形 變 的 特 性 相 反 因 此 本 章 的 下 一 47

節, 將 對 鄰 近 T m 區 域 的 流 體 態 脂 膜 作 進 一 步 分 析 與 討 論 48

第 二 節 流 體 態 的 脂 膜 之 臨 界 膨 脹 由 上 一 節 的 研 究 得 知, 飽 和 碳 氫 鏈 脂 膜 的 頭 部 分 子 結 構 具 有 不 變 性, 同 時 這 類 脂 膜 具 有 相 同 的 厚 度 熱 膨 脹 與 截 面 積 壓 縮 但 是 這 類 脂 膜 在 鄰 近 相 變 溫 度 T m 時 的 一 些 特 性, 卻 有 進 一 步 探 討 的 必 要 因 為 如 圖 4-3(a) (c) 所 示, 在 Π = 0 ( 即 飽 和 吸 水 時 ), 脂 膜 的 單 一 片 層 厚 度 D( 為 厭 水 區 厚 度 D c 加 上 親 水 區 厚 度 D p ) 在 T 接 近 T m 時, 顯 得 異 常 增 厚 ; 又 如 圖 4-6 所 示, 當 溫 度 愈 接 近 T m 時, 截 面 積 愈 容 易 壓 縮 形 變 (K a 變 小 ) 這 些 異 常 的 現 象 都 反 應 出 這 類 脂 膜 在 鄰 近 T m 時 應 具 有 一 種 獨 特 的 性 質, 值 得 深 入 研 究 在 最 近 幾 年, 有 不 少 研 究 群 也 發 現 這 類 流 體 態 脂 膜 在 飽 和 吸 水 時, 當 溫 度 下 降 到 靠 近 相 變 溫 度 T m 時,D 具 有 異 常 增 厚 的 現 象 [15, 16], 稱 之 為 脂 膜 臨 界 膨 脹 這 些 研 究 群 對 於 D 異 常 增 厚 的 來 源, 有 兩 種 不 同 的 看 法 : 一 派 認 為 是 來 自 厭 水 區 D c 增 厚, 即 脂 膜 增 厚 ; 另 一 派 則 是 認 為 來 自 親 水 區 D p 增 厚, 即 脂 膜 間 的 水 層 增 厚, 認 為 脂 膜 會 變 得 較 軟 較 易 產 生 的 擾 動 本 文 以 DLPC 為 例, 由 圖 4-3(a) 得 知, 在 滲 透 壓 Π = 0.3 10 8 dyne/cm 2, 溫 度 由 50 o C 降 到 1 o C 時, 脂 膜 的 單 一 片 層 厚 度 D 明 顯 地 異 常 增 厚 ~7.7Å, 顯 示 臨 界 膨 脹 ; 然 而, 由 圖 4-3(b) 得 知,PtP 僅 少 許 增 厚 ~1.3Å 這 結 果 提 供 一 個 直 接 的 證 據, 證 明 臨 界 膨 脹 並 非 由 脂 膜 增 49

厚 所 致, 而 是 來 自 脂 膜 間 的 水 層 增 厚 ; 但 是 脂 膜 本 身 伴 隨 臨 界 膨 脹 也 有 少 許 增 厚 這 個 結 果 說 明 臨 界 膨 脹 的 來 源, 但 是 沒 有 說 明 脂 膜 結 構 如 何 變 化 會 產 生 這 種 奇 特 的 臨 界 膨 脹 現 象 對 此 問 題, 本 文 提 出 一 個 新 的 策 略, 即 以 一 個 新 的 熱 力 學 路 徑 來 逼 近 臨 界 膨 脹 區 域, 如 圖 4-7 所 示 沿 著 共 存 線 的 邊 界, 由 高 溫 高 滲 透 壓 下 逼 近 到 低 溫 低 滲 透 壓 時 的 臨 界 膨 脹 區 域, 觀 察 流 體 態 脂 膜 的 結 構 在 這 個 路 徑 上 的 改 變, 以 瞭 解 臨 界 膨 脹 是 由 何 種 脂 膜 結 構 所 致 共 存 線 滲 透 壓 Π 膠 體 態 流 體 態 T m 溫 度 T 圖 4-7 本 文 使 用 逼 近 T m 區 域 的 路 徑 之 示 意 圖 其 中 箭 頭 所 指 即 為 本 文 逼 近 T m 區 域 的 路 徑, 紅 色 點 線 標 示 區 即 為 臨 界 膨 脹 發 生 的 區 域 本 文 再 以 DLPC 脂 膜 為 例 來 探 討 此 問 題 圖 4-8 為 DLPC 在 各 溫 度 時 各 滲 透 壓 下 測 得 的 PtP 隨 滲 透 壓 的 變 化 圖 由 圖 4-8, 並 參 考 圖 3-8(a)( 即 DLPC 相 態 圖 ) 得 知, 流 體 態 脂 膜 的 PtP 會 隨 滲 透 壓 增 高 而 50

增 厚, 但 增 厚 到 一 個 臨 界 的 厚 度 時, 即 會 相 變 到 膠 體 態, 這 顯 示 相 變 前 的 流 體 態 脂 膜 碳 氫 鏈 應 有 部 分 變 得 有 序 伸 直 的 狀 態, 才 可 以 使 得 脂 膜 達 到 臨 界 厚 度 ; 同 時 也 發 現 臨 界 厚 度 在 低 中 高 三 個 不 同 的 溫 度 範 圍, 具 有 三 個 不 同 的 厚 度, 而 各 自 對 應 到 不 同 的 膠 體 態, 圖 中 所 示 的 g1 g2 和 g3, 即 代 表 三 種 不 同 的 膠 體 態 為 了 更 清 楚 的 瞭 解 沿 著 共 存 線 的 流 體 態 脂 膜 由 高 溫 高 滲 透 壓 到 接 近 飽 和 吸 水 的 相 變 溫 度 T m 時 的 脂 膜 結 構 變 化, 本 文 由 圖 4-8 中 取 得 不 同 之 等 滲 透 壓 下 各 溫 度 的 PtP, 如 圖 4-9 所 示, 其 中 溫 度 為 相 對 溫 度 T-T m, 而 T m 為 各 滲 透 壓 下 的 相 變 溫 度, 可 以 由 圖 3-8(a) 的 T-Π 相 態 44 1.0 ( o C) PtP (Å) 40 36 32 3.6 6.2 10.4 15.0 20.0 25.0 29.8 35.0 g 1 g 2 g 3 28 L α 0.1 1 10 Π (10 8 dyne/cm 2 ) 圖 4-8 DLPC 脂 膜 在 各 溫 度 下 的 PtP 隨 滲 透 壓 的 變 化 圖 圖 得 到 由 圖 4-9 中, 沿 著 T-T m = 0 ( 即 沿 共 存 線 ) 時, 發 現 當 滲 透 壓 51

低 於 0.68 10 8 dyne/cm 2 時,PtP 開 始 無 法 增 厚 到 其 應 有 的 臨 界 厚 度, 顯 示 增 濕 破 壞 臨 界 厚 度 同 時 由 各 溫 度 時 在 各 滲 透 壓 下 所 測 得 的 繞 射 38 Π (10 8 dyne/cm 2 ) T m ( o C) 0.00 0.00 PtP(Å) 36 34 g 3 g 2 g 1 L α 0.10-0.89 0.30-0.10 0.68 1.00 1.32 3.60 1.83 6.20 3.37 10.40 5.09 15.00 7.51 20.00 32 11.07 25.00 16.93 29.80 22.55 35.00 30 0 10 20 30 40 T-T m ( o C) 圖 4-9 DLPC 脂 膜 在 各 滲 透 壓 時 各 溫 度 下 的 PtP 隨 相 對 溫 度 T-T m 變 化 圖 其 中 T m 為 各 滲 透 壓 下 的 相 變 溫 度, 可 由 相 態 圖 得 到 峰 的 寬 度, 得 知 在 各 個 溫 度 滲 透 壓 下 脂 膜 擾 動 的 相 對 大 小, 寬 度 愈 寬 表 示 擾 動 愈 大 圖 4-10 所 示, 即 為 第 二 階 次 的 繞 射 峰 寬 度 隨 滲 透 壓 的 變 化 圖, 顯 示 在 滲 透 壓 低 於 0.68 10 8 dyne/cm 2 時, 脂 膜 擾 動 明 顯 增 大, 且 愈 靠 近 飽 和 吸 水 時 擾 動 愈 大 圖 4-9 及 4-10 顯 示 水 分 子 在 高 濕 下 滲 入 具 有 臨 界 厚 度 的 脂 膜 中, 造 成 脂 膜 局 部 區 域 的 面 積 變 大 而 變 薄, 使 得 整 個 脂 膜 厚 度 呈 現 不 均 勻, 無 法 保 有 低 溫 時 的 臨 界 厚 度 ; 同 時 這 些 變 薄 的 區 域 可 以 任 意 流 動, 使 得 脂 膜 產 生 起 伏 漲 落 的 擾 動, 這 52

種 擾 動 增 大 脂 膜 間 的 排 斥 力, 因 而 增 大 脂 膜 間 的 距 離 ( 即 水 層 厚 度 ), 產 生 流 體 態 脂 膜 的 臨 界 膨 脹 現 象 2σ (Å -1 ) 0.008 0.004 2 nd peak 1.0 3.6 6.2 10.4 15.0 20.0 25.0 29.8 35.0 0.1 1 10 Π(10 8 dyne/cm 2 ) 圖 4-10 DLPC 脂 膜 在 各 溫 度 時 各 滲 透 壓 下 的 繞 射 峰 的 寬 度 2σ 隨 滲 透 壓 的 變 化 圖 第 三 節 膠 脂 膜 之 滲 透 壓 門 檻 53

如 前 所 言 ( 本 章 第 一 節 中 所 述 ), 一 個 平 面 結 構 的 脂 膜, 其 截 面 積 是 由 厭 水 - 親 水 的 界 面 張 力 ( 使 截 面 積 縮 小, 減 少 厭 水 區 暴 露 ) 與 產 生 在 頭 部 區 與 厭 水 區 的 排 斥 力 ( 使 面 積 增 大 ) 相 互 平 衡 所 決 定 當 脂 膜 由 乾 增 濕 時, 滲 入 頭 部 區 的 水 分 子 即 會 增 多 而 增 加 排 斥 力, 使 得 截 面 積 增 大, 相 對 地 界 面 張 力 亦 增 大, 以 達 平 衡 截 面 積 增 大 當 然 有 其 極 限 ( 否 則 脂 膜 將 會 崩 潰 ); 問 題 是 增 濕 到 何 種 程 度, 脂 膜 截 面 積 可 達 極 限? 流 體 態 的 脂 膜, 其 碳 氫 鏈 呈 現 無 序 狀 且 形 變 容 易, 故 其 界 面 張 力 不 大, 其 脂 膜 截 面 積 可 以 不 停 的 擴 張, 直 到 脂 膜 增 濕 到 飽 和 吸 水 時 才 會 達 到 一 個 極 限 值 然 而 膠 體 態 的 脂 膜, 其 碳 氫 鏈 不 但 有 序 且 排 列 緊 密 不 易 形 變, 故 具 有 很 強 的 界 面 張 力, 因 此 很 有 可 能 脂 膜 增 濕 不 到 飽 和 吸 水 時, 截 面 積 的 擴 張 已 達 極 限 換 言 之, 如 果 用 降 低 滲 透 壓 來 增 濕 脂 膜, 則 會 存 在 一 個 滲 透 壓 門 檻, 當 滲 透 壓 低 於 此 門 檻, 脂 膜 截 面 積 已 達 極 限 而 不 再 擴 張 本 文 將 精 細 地 調 控 滲 透 壓 來 觀 測 DMPC 脂 膜 在 10 o C 膠 體 態 時, 是 否 具 有 一 個 滲 透 壓 門 檻? 實 驗 結 果 如 下 : 圖 4-11 (a) 和 (b) 分 別 為 DMPC 在 10 o C, 不 同 滲 透 壓 下 的 繞 射 數 據 與 分 析 後 得 到 的 電 子 密 度 分 佈 圖 ( 典 型 代 表 ) 由 電 子 密 度 分 佈 圖 上 的 兩 次 峰 間 之 距 離 得 到 厭 水 區 厚 度 D c, 結 果 如 圖 4-12(a) 所 示 其 54

22 DMPC 10.0 o C Π (10 8 dyne/cm 2 ) ; RH% (a) DMPC 10.0 o C Π (10 8 dyne/cm 2 ) ; RH% (b) Intensity (arb. unit) 6.29 61.8 3.52 76.4 1.46 89.4 0.74 94.5 0.03 99.7 ρ (arb.unit) I h D p /2 6.29 61.8 3.52 76.4 1.46 89.4 0.74 94.5 0.03 99.7 D c /2 D/2 5 10 15 20 2θ (deg) -10 0 10 20 30 40 50 z(å) 圖 4-11 (a) 為 DMPC 在 10 o C 的 各 滲 透 壓 下 測 得 的 繞 射 數 據 (b) 則 為 其 分 析 後 得 到 的 電 子 密 度 分 佈 圖 對 應 到 的 脂 膜 截 面 積 A, 可 由 A = V c / (D c /2) 計 算, 其 中 V c 為 每 一 個 脂 質 分 子 中 厭 水 區 的 體 積, 可 由 脂 質 分 子 的 總 體 積 V L 減 去 頭 部 分 子 群 的 體 積 V H 得 到, 即 V c = V L - V H 由 文 獻 可 得 DMPC 在 10 o C 時, V L =1041 Å 3 [17], 但 因 V H 在 文 獻 上 有 各 種 不 同 的 估 計 值 : 324Å 3 [18] 340Å 3 [19] 344Å 3 [20] 348Å 3 [21] 和 319Å 3 [22] 等, 本 文 採 用 平 均 值,V H =333 Å 3 計 算 所 得 的 各 滲 透 壓 下 的 截 面 積, 如 圖 4-12(b) 所 示 ( 左 邊 座 標 軸 為 A) A 可 以 對 應 到 碳 氫 鏈 的 傾 斜 角 θ,cos θ = A n 55

D c (Å) 33 32 31 DMPC 10 o C Π* (a) 30 0.01 0.1 1 10 48 (b) 35 A (Å 2 ) 46 44 30 25 θ (deg) 42 20 0.01 0.1 1 10 Π (10 8 dyne/cm 2 ) 圖 4-12 (a) 為 DMPC 在 10 o C 下 測 得 的 厭 水 區 厚 度 D c 隨 滲 透 壓 的 變 化 圖 (b) 為 脂 膜 截 面 積 與 傾 斜 角 隨 滲 透 壓 的 變 化 圖 /A, 其 中 A n 為 θ =0 時 的 截 面 積 A n 在 文 獻 上 也 有 多 個 不 同 的 估 計 值 : 40.8 Å 2 [22] 38.9 Å 2 [23] 41.0 Å 2 [24] 及 39.8 Å 2 [25] 等, 本 文 仍 採 用 平 均 值,A n = 39.8 Å 2 計 算 所 得 的 各 滲 透 壓 下 的 碳 氫 鏈 傾 斜 角, 如 圖 4-12(b) 所 示 ( 右 邊 座 標 軸 為 θ) 由 圖 4-12 得 知 脂 膜 在 膠 體 態 時, 的 確 有 一 個 滲 透 壓 門 檻 ( 如 圖 垂 直 虛 線 所 示 ) : 在 Π < Π* 時, 其 截 面 積 A 56

( 或 傾 斜 角 θ 與 厭 水 區 厚 度 D c ) 都 維 持 在 一 個 幾 乎 不 變 的 極 限 值, 但 在 Π > Π* 時, 其 截 面 積 則 可 隨 滲 透 壓 而 改 變 同 時 由 親 水 區 厚 度 D p =D-D c 26 (c) (a) 24 D p (Å) 22 20 0.01 0.1 1 10 8 (d) (b) 6 I h (Å) 4 2 0.01 0.1 1 10 Π (10 8 dyne/cm 2 ) 圖 4-13 (a) 為 DMPC 在 10 o C 下 測 得 的 親 水 區 厚 度 D p 隨 滲 透 壓 的 變 化 圖 (b) 為 親 水 頭 部 區 的 厚 度 I h 隨 滲 透 壓 的 變 化 圖, 為 電 子 密 度 分 佈 圖 中 的 主 峰 與 次 峰 間 的 距 離 隨 滲 透 壓 的 變 化 圖 ( 圖 4-13(a)), 得 知 在 滲 透 壓 達 到 門 檻 時, 其 親 水 區 厚 度 D p 隨 滲 透 壓 的 改 變 率 也 產 生 一 個 轉 折 的 變 化 這 些 結 果 顯 示, 在 57

高 滲 透 壓 下, 降 低 滲 透 壓 時 被 脂 膜 吸 收 的 水 分 子, 有 一 些 直 接 吸 附 在 頭 部 分 子 群 表 面 上 (D p 增 加 ), 同 時 也 有 一 些 滲 入 頭 部 區 而 吸 附 在 分 子 群 側 邊, 增 大 脂 膜 截 面 積 (A 增 加 ), 使 界 面 張 力 跟 著 變 大 但 是 當 高 滲 透 壓 降 低 到 達 滲 透 壓 門 檻 時, 界 面 張 力 已 經 變 得 很 大, 足 以 使 水 分 子 無 法 再 滲 入 親 水 頭 部 區, 因 此 截 面 積 達 到 一 個 極 限 值 而 不 再 改 變 若 再 使 滲 透 壓 降 到 低 於 滲 透 壓 門 檻 時, 則 水 分 子 僅 能 滲 入 脂 膜 間, 形 成 的 水 層 區, 而 不 再 直 接 吸 附 於 頭 部 分 子 群 上, 因 此 親 水 區 厚 度 D p 的 增 厚 率 才 會 產 生 一 個 轉 折 變 化 由 此 觀 點, 在 Π = Π* 時, 親 水 區 的 厚 度 D p * 應 為 脂 膜 頭 部 區 的 厚 度 D Ho, 即 是 脂 質 分 子 的 頭 部 分 子 群 加 上 吸 附 其 上 的 水 分 子 之 總 厚 度 由 圖 4-13(a) 得 此 厚 度 D Ho = D p * ~23.2 Å ; 同 時 由 4-12(b) 得 知 此 時 截 面 積 應 為 A o ~46.2 Å 2 ( 因 為 此 截 面 積 以 達 到 極 限 值, 故 以 A o 表 示 之 ) 因 此, 吸 附 在 頭 部 分 子 群 上 的 水 分 子 之 總 體 積, 可 由 V wo = A o D p */2-V H, 計 算 得 到 V wo ~203 Å 3, 約 有 7 個 水 分 子 ( 每 個 水 分 子 的 體 積 ~30 Å 3 更 進 一 步, 由 圖 4-13(b) 得 知, 脂 膜 的 磷 酸 根 PO 4 到 界 面 的 距 離 為 I h =4.85 Å, 故 可 估 算 在 此 區 域 中 吸 附 的 水 分 子 體 積,V wo = A o I h - V g, 其 中 V g 為 頭 部 分 子 群 在 此 區 中 的 體 積, 包 括 1/2 的 磷 酸 根 PO 4 的 體 積 V PO4 甘 油 基 的 體 積 V GLY 以 及 羧 基 的 體 積 V COO, 即 V g = V PO4 /2 + V GLY + V COO 由 文 獻 可 查 得 V PO4 =59 Å 3 [26] 或 70 Å 3 [27] ; V GLY =72 Å 3 [26, 27] ; V COO =41 Å 3 [26] 或 36 Å 3 [27], 58

若 用 平 均 值 估 算 每 一 個 部 分 體 積, 則 V wo = 81.3 Å 3, 約 有 三 顆 水 分 子 換 言 之, 頭 部 分 子 群 在 PO 4 的 之 上 的 區 域, 應 有 四 顆 水 分 子 吸 附 在 上 面 ( 因 為 在 Π = Π* 時, 總 共 有 7 顆 水 分 子 吸 附 在 頭 部 分 子 群 上 ) 我 們 進 一 步 估 計 脂 膜 在 PO 4 之 上 的 親 水 頭 部 區 厚 度 為 D Ho /2-4.85=6.75 Å, 而 由 DMPC 的 結 晶 結 構 估 得 PO 4 到 膽 鹼 基 (choline) 的 厚 度 約 為 3Å [7], 因 此 推 斷 這 四 顆 水 分 子 應 分 佈 在 約 6.75 3 = 3.75Å 的 厚 度 範 圍 Π < Π* Π = Π* Π > Π* D p-d p* D p* D p A o A o A 圖 4-14 為 膠 體 態 脂 膜 結 構 隨 滲 透 壓 變 化 的 示 意 圖 圖 中 暗 黑 區 表 示 吸 附 在 頭 部 區 的 水, 亮 灰 區 表 示 在 水 層 區 的 水, 其 中 在 Π = Π* 時 顯 示 吸 附 於 頭 部 分 子 群 的 水 分 子 形 成 一 個 水 殼 包 附 著 頭 部 分 子 群, 使 脂 膜 頭 部 區 具 有 D p * 的 厚 度,D p -D p * 表 示 Π < Π* 時, 水 層 形 成 的 厚 度, 此 時 截 面 積 A 仍 然 維 持 在 A o 59

中, 此 與 一 顆 水 分 子 的 直 徑 3.86 Å( 由 水 分 子 的 體 積 v w =30 Å 3 可 估 得 ) 約 相 等 這 結 果 顯 示 這 四 顆 水 分 子 應 是 形 成 單 層 水 分 子 水 殼 直 接 吸 附 在 PO 4 到 膽 鹼 基 的 分 子 群 上, 如 圖 4-14 所 示 根 據 以 上 的 討 論, 在 Π = Π* 時, 取 走 一 顆 吸 附 在 頭 部 區 的 水 分 子 所 作 的 功, 應 為 水 分 子 的 吸 附 能 ε b =Π* v w 由 滲 透 壓 門 檻 Π*=1.26 10 8 dyne/cm 2 ( 由 圖 4-12, 垂 直 虛 線 的 Π 值 估 計 ) 及 一 顆 水 分 子 的 體 積 v w =30 Å 3, 估 得 ε b =3.78 10-15 ergs 此 值 比 10 o C 下 的 熱 能 k B T=3.91 10-14 ergs 小 了 約 10 倍, 表 示 這 些 水 分 子 雖 然 吸 附 脂 質 分 子 的 頭 部 分 子 群 上, 但 仍 可 被 熱 能 激 發 而 產 生 擾 動 這 個 結 果 證 明, 以 能 量 的 觀 點 而 言, 膠 體 態 脂 膜 在 飽 和 吸 水 時 仍 然 可 以 出 現 擾 動 [22] 由 以 上 的 分 析, 本 文 不 但 證 明 脂 膜 在 膠 體 態 時 確 實 存 有 一 個 滲 透 壓 門 檻, 同 時 也 由 這 個 門 檻 的 效 應, 得 知 滲 入 脂 膜 頭 部 區 的 水 分 子 特 性, 包 括 吸 附 於 脂 質 分 子 頭 部 分 子 群 的 水 分 子 個 數 分 佈 情 形 以 及 吸 附 能 量 等 表 4-1 所 列 即 為 膠 體 態 DMPC 脂 膜 在 10 o C 下, 飽 和 吸 水 時 的 結 構 與 滲 入 在 頭 部 區 的 水 分 子 之 各 種 性 質 60

表 4-1 為 膠 體 態 的 DMPC 在 10 o C 飽 和 吸 水 時, 外 插 得 到 的 脂 膜 結 構 及 其 所 吸 附 的 水 分 子 性 質 表 其 中 包 括 厭 水 區 厚 度 D co ; 截 面 積 A o ; 傾 斜 角 θo; 親 水 頭 部 區 厚 度 D Ho ; 頭 部 區 中 的 PO 4 到 界 面 的 厚 度 I h ; 頭 部 區 所 吸 附 的 水 含 量 之 總 體 積 V wo ; 分 佈 在 PO 4 以 下 區 域 的 水 含 量 之 體 積 V wo 及 在 之 上 水 含 量 的 體 積 V wo ; 水 分 子 吸 附 在 頭 部 區 的 能 ε b. DMPC Bilayer Structure D A o (Å 2 co (Å) ) θ o (deg) D Ho (Å) I h (Å) gel (10 o C) 30.6 46.2 30.6 23.2 4.85 Associated Waters V V ε b (10-15 wo' (Å 3 ) V wo'' (Å 3 wo (Å 3 ) ) erg) 203 81.3 121.7 3.78 61

第 四 節 脂 膜 有 序 - 無 序 的 相 變 由 本 章 的 第 一 節 已 證 實 : 飽 和 碳 氫 鏈 的 脂 膜 如 DMPC DLPC 等, 由 流 體 態 相 變 到 膠 體 態 時, 親 水 頭 部 區 厚 度 具 有 不 變 性, 顯 示 脂 質 分 子 頭 部 甘 油 基 分 子 團 的 指 向 維 持 不 變, 即 垂 直 膜 面 方 向 ; 改 變 的 僅 是 厭 水 區 變 厚 這 結 果 證 實 近 幾 年 測 量 流 體 態 脂 膜 厭 水 區 所 用 的 一 個 重 要 的 假 設 為 真 ; 然 而, 這 種 飽 和 碳 氫 鏈 脂 膜 在 流 體 態 與 膠 體 態 頭 部 結 構 相 同 的 事 實, 是 否 可 以 適 用 到 其 他 種 類 的 脂 膜? 本 節 將 利 用 X- 光 片 層 繞 射 / 滲 透 壓 技 術, 測 量 飽 和 碳 氫 鏈 的 DMPC 與 飽 和 但 具 有 甲 烷 基 支 鏈 的 DPhPC 脂 膜, 比 較 兩 者 結 構 在 相 變 時 的 差 異, 以 驗 證 在 相 變 時 頭 部 區 結 構 的 不 變 性 是 否 真 的 為 脂 膜 共 通 的 性 質? 實 驗 結 果 如 下 : 由 DMPC 與 DPhPC 脂 膜 的 T-Π 相 態 圖 之 比 較, 如 圖 4-15(a) (b) 所 示, 發 現 DMPC 的 共 存 線 具 有 正 斜 率, 而 DPhPC 具 有 負 斜 率 值 ; 同 時 由 DMPC 的 相 圖, 得 知 脂 膜 在 乾 的 相 態 對 應 的 是 低 溫 相 態 ( 如 膠 體 態 L β 和 漣 漪 態 P β ), 這 表 示 在 等 溫 降 濕 所 產 生 的 相 變, 應 是 一 種 無 序 到 有 序 的 相 變 ; 而 在 DPhPC 脂 膜, 其 乾 的 相 態 對 應 的 是 高 溫 相 態, 由 熱 力 學 得 知, 在 高 溫 相 態 應 較 為 無 序, 故 研 判 流 體 態 (L α phase) 的 DPhPC 以 等 溫 降 濕 產 生 的 相 變, 應 為 一 種 有 序 到 無 序 的 相 變, 明 顯 地 與 DMPC 的 相 變 相 反 本 文 將 DPhPC 乾 的 無 序 相 態 稱 之 為 62

L α -phase Π (10 8 dyne/cm 2 ) Π (10 8 dyne/cm 2 ) 6 (a) 4 L α ' 2 L α DPhPC 0 0 20 40 60 80 6 (b) 4 2 DMPC P β' L β' L α 0 20 25 30 35 T ( o C) 圖 4-15 (a) (b) 分 別 為 DPhPC 與 DMPC 脂 膜 的 T-Π 相 態 圖 為 了 確 定 以 上 的 觀 點, 本 文 進 一 步 由 熱 力 學 的 角 度 加 以 分 析 令 水 合 的 脂 膜 系 統 的 Gibbs 自 由 能 為 G, 則 在 等 壓 (1 大 氣 壓 不 變 ) 的 實 驗 過 程 中,dG = -S dt + μ l dn l + μ w dn w, 其 中 S 為 系 統 的 熵,μ l 和 N l 分 別 為 脂 質 分 子 的 化 學 能 與 個 數,μ w 和 N w 分 別 為 脂 膜 中 的 水 之 水 分 63

子 化 學 能 與 個 數 又 由 Euler relation 得 G = μ l N l + μ w N w, 故 可 由 Gibbs-Duhem relation 得 到 : S N w S Vw dμ l = dt dμw = dt + dπ (1) Nl Nl Nl Nl 式 中 滲 透 壓 Π 定 義 為,μ w = μ o - v w Π, 其 中 μ o 為 液 態 水 的 水 分 子 之 化 學 能, v w 為 一 顆 水 分 子 的 體 積 (1) 式 中 的 V w 為 脂 膜 中 所 含 的 水 之 總 體 積, 而 括 弧 表 示 將 物 理 量 歸 一 成 每 一 個 脂 質 分 子 來 表 示 相 變 時, 根 據 (1) 式, 可 得 Clausius-Clapeyron 方 程 式 [28], dπ = dt ph. bd. [ S Nl] [ S Nl] [ Vw Nl] [ Vw Nl] (2) (2) 式 左 邊 的 (dπ/dt) ph.bd. 可 由 Π T 相 態 圖 中 的 共 存 線 得 到 ; 式 中 右 邊 有 加 符 號 代 表 乾 的 相 態, 沒 加 此 符 號 代 表 濕 的 相 態, 所 以 (2) 式 中 的 分 母 必 為 正 值 對 於 DMPC 脂 膜 而 言, 其 (dπ/dt) ph.bd. 為 正, 故 [S / N l ] > [S / N l ], 表 示 乾 的 相 態 其 熵 較 小, 亦 即 較 為 有 序 但 對 於 DPhPC 脂 膜 而 言, 其 (dπ/dt) ph.bd. 為 負, 故 [S / N l ] < [S / N l ], 表 示 乾 的 DPhPC 脂 膜 相 態 有 較 大 的 熵, 亦 即 較 為 無 序 與 DMPC 相 態 性 質, 64

迥 然 不 同 雖 然 DPhPC 等 溫 降 濕 產 生 的 相 變, 由 以 上 分 析 得 知 為 一 種 有 序 到 無 序 的 相 變, 但 相 變 時, 脂 膜 分 子 結 構 產 生 何 種 變 化, 仍 需 進 一 步 作 結 構 分 析 圖 4-16 (a) 和 (b) 所 示, 分 別 為 分 析 DPhPC 與 DMPC 繞 射 DPhPC 25.0 o C (a) ρ (arb. unit) L α L α ' -20-10 0 10 20 DMPC 34.0 o C (b) ρ (arb. unit) L α L β' -20-10 0 10 20 z (Å) 圖 4-16 (a) (b) 分 別 為 DphPC 在 25 o C 與 DMPC 在 34 o C 時, 各 滲 透 壓 下 的 電 子 密 度 分 佈 圖 其 中 實 線 所 示 為 濕 的 相 態 ( 即 流 體 態 L α ), 而 虛 線 所 示 為 乾 的 相 態 ( 在 DPhPC 為 L α,dmpc 為 膠 體 態 L β ) 65

數 據 後 所 得 到 的 電 子 密 度 分 佈 圖 ( 典 型 代 表 ) 比 較 (a) 與 (b), 發 現 在 L α -phase 時,DPhPC 與 DMPC 具 有 相 似 形 狀 的 電 子 密 度 分 佈 圖, 這 表 示 兩 種 脂 膜 在 此 相 態 時 其 分 子 結 構 非 常 近 似 但 在 乾 的 相 態 (DPhPC 的 L α -phase ; DMPC 的 L β -phase) 時, 兩 者 卻 展 現 不 同 的 電 子 密 度 分 佈 圖 在 本 章 第 三 節 中 對 膠 體 態 DMPC 已 有 論 述, 知 道 此 相 態 的 碳 氫 鏈 會 伸 直 傾 斜 呈 有 序 排 列, 故 乾 的 DMPC 脂 膜 如 圖 4-16(b) 所 示 其 PtP( 兩 主 峰 間 的 距 離, 另 參 考 圖 4-17) 增 厚 為 合 理 之 結 果 但 對 於 DPhPC 而 言, 乾 的 L α -phase 其 PtP 反 而 變 薄, 而 且 中 間 CH 3 尾 尾 相 接 處 沒 有 展 現 明 顯 的 低 值 這 兩 個 異 常 特 徵, 顯 示 DPhPC 分 子 結 構 在 相 變 時, 迥 異 於 DMPC 其 詳 細 的 結 構 分 析 敘 述 如 下 : 每 個 脂 質 分 子 的 含 水 量 之 體 積, 即 [V w /N l ] =1/2 D A - V l, 其 中 V l 為 一 個 脂 質 分 子 的 體 積, 可 視 為 常 數 因 此 相 變 時 脂 膜 含 水 量 的 相 對 變 化 為, ( D A) δd δa δd δd = + = ( D A) D A D Dc δ c (3) 由 式 (3) 的 正 負 值, 可 知 含 水 量 是 增 多 或 是 減 少 由 圖 4-17(c) 得 知, D 增 厚 ~2 Å, 即 δd~2 Å ; 由 圖 4-17 (d) 得 知 DMPC 在 降 濕 相 變 後, PtP 增 厚 ~4 Å ( 亦 即 δptp~4 Å), 如 前 ( 本 章 第 一 節 ) 實 驗 證 實 DMPC 66

的 I h 具 有 不 變 性, 由 D c = PtP 2 I h 得 知,δD c = δptp~4 Å 因 此 實 驗 得 知 δd < δd c 且 D > D c, 則 由 (3) 式 可 知 DMPC 脂 膜 去 濕 相 變 其 含 水 量 的 確 減 少, 為 合 理 之 結 果 另 一 方 面, 由 圖 4-17(a) 與 (b) 得 知,DPhPC 在 降 濕 相 變 後, 其 PtP 變 薄 ~4 Å ( 亦 即 δptp~-4 Å), 而 其 D 也 變 薄 ~2 Å, 即 δd~-2 Å 如 果 DPhPC 的 I h 也 與 DMPC 一 樣 具 有 不 變 性 D (Å) 52 50 48 46 44 L α L α ' DPhPC 5.0 o C 15.0 25.0 35.0 50.0 (a) 56 54 52 50 48 L β' L α DMPC 28.0 o C 30.0 32.0 34.0 (c) 0 2 4 6 0 2 4 6 40 L α (b) 44 42 L β' (d) PtP (Å) 38 36 34 32 L α ' 0 2 4 6 Π (10 8 dyne/cm 2 ) 40 38 36 34 L α 0 2 4 6 Π (10 8 dyne/cm 2 ) 圖 4-17 (a) (b) 分 別 為 DphPC 在 各 溫 度 滲 透 壓 下 測 得 的 D 與 PtP (c) (d) 分 別 為 DMPC 在 各 溫 度 滲 透 壓 下 測 得 的 D 與 PtP 67

的 話, 則 δd c =δptp~-4 Å, 由 (3) 式 得 知, 去 濕 相 變 會 造 成 含 水 量 增 大, 為 不 合 理 的 結 果, 與 去 濕 過 程 違 背 這 表 示 DPhPC 的 I h 具 有 不 變 性 是 個 錯 誤 之 假 設, 亦 即 DPhPC 脂 膜 在 去 濕 相 變 時, 其 頭 部 分 子 群 的 結 構 應 產 生 改 變 由 於 DPhPC 脂 膜 在 L α -phase 時 具 有 如 同 DMPC 的 電 子 密 度 分 佈 圖, 因 此 可 推 論 其 I h 應 與 DMPC 一 樣, 即 頭 部 甘 油 基 分 子 團 的 指 向 應 呈 現 垂 直 膜 面 方 向, 而 在 L α -phase 時, 由 上 述 的 推 論, 得 知 I h 必 需 改 變, 故 頭 部 甘 油 基 分 子 團 的 指 向 不 再 垂 直 膜 面 而 應 有 傾 斜 將 以 上 所 得 的 結 論 並 參 考 DMPC 的 分 子 結 構 ( 如 圖 4-18(b) 所 示 ), 本 文 推 論 DPhPC 分 子 的 兩 個 碳 氫 鏈 之 支 鏈 應 為 錯 排 結 構, 且 在 相 變 時, 兩 碳 氫 鏈 會 上 下 互 移, 而 改 變 其 支 鏈 錯 排 順 序, 如 圖 4-18(a) 所 示 由 此 研 究, 得 知 飽 和 碳 氫 鏈 的 脂 膜, 在 發 生 相 變 時, 僅 有 碳 氫 鏈 結 構 產 生 改 變, 而 一 旦 外 接 甲 烷 基 於 碳 氫 鏈 上, 則 脂 膜 的 碳 氫 鏈 與 頭 部 區 之 結 構 在 相 變 時 都 會 改 變 顯 示 頭 部 區 不 變 的 特 性 並 不 適 用 於 所 有 脂 膜 這 是 一 個 重 要 的 警 訊 -- 不 同 種 類 的 脂 膜 具 有 其 獨 特 性, 所 以 要 將 瞭 解 一 種 脂 膜 的 知 識 適 用 於 另 一 種 脂 膜 時, 需 要 格 外 小 心 謹 慎! 68

L α L α ' (a) I h PtP/2 L α L β ' (b) PtP/2 圖 4-18 (a) 為 DPhPC 在 流 體 態 與 L α -phase 的 分 子 結 構 圖 ; (b) 為 DMPC 在 流 體 態 與 L β -phase 的 分 子 結 構 圖 圖 中 黑 色 點 為 碳 原 子, 淺 藍 色 為 氫 原 子, 紅 色 為 氧 原 子, 橙 色 為 磷 原 子, 藍 色 為 氮 原 子, 連 接 點 與 點 的 棒 子 代 表 原 子 間 的 鍵 結 69

第 四 章 總 結 本 文 使 用 單 一 指 向 性 的 多 片 層 平 面 狀 脂 膜 來 產 生 繞 射, 並 利 用 滲 透 壓 外 插 法 克 服 脂 膜 擾 動 帶 來 的 問 題, 使 X- 光 繞 射 技 術 能 夠 測 量 到 脂 膜 的 細 部 結 構 厭 水 區 厚 度 親 水 區 厚 度 以 及 兩 區 之 界 面, 其 解 析 度 可 達 0.1 Å ; 同 時 也 能 夠 測 量 到 脂 膜 的 厚 度 熱 膨 脹 係 數 與 等 溫 截 面 積 壓 縮 係 數 應 用 這 種 X- 光 片 層 繞 射 / 滲 透 壓 技 術 得 到 的 研 究 成 果 如 下 :(1) 發 現 飽 和 碳 氫 鏈 脂 膜 的 親 水 區 頭 部 厚 度 I h 具 有 不 變 性, 與 脂 膜 碳 鏈 長 度 溫 度 濕 度 以 及 相 態 無 關 ; 其 截 面 積 的 熱 膨 脹 係 數 與 壓 縮 係 數 僅 與 相 對 溫 度 T-T m ( 其 中 脂 膜 溫 度 為 T, 相 變 溫 度 為 T m ) 有 關 ;(2) 證 實 流 體 態 脂 膜 的 臨 界 膨 脹 是 因 為 有 部 分 區 域 的 脂 膜 分 子, 其 碳 氫 鏈 有 部 分 變 得 有 序, 而 增 厚 該 區 脂 膜, 使 整 個 脂 膜 厚 度 呈 現 不 均 勻 而 有 明 顯 的 起 伏 漲 落, 增 加 脂 膜 間 的 距 離 而 造 成 臨 界 膨 脹 ; 同 時 脂 膜 平 均 厚 度 也 會 有 少 許 增 加 ;(3) 證 實 滲 透 壓 對 膠 體 態 的 脂 膜 存 在 一 個 門 檻, 高 於 此 門 檻, 滲 透 壓 才 會 使 脂 膜 截 面 積 開 始 收 縮 這 個 門 檻 效 應 可 以 決 定 水 分 子 吸 附 在 脂 膜 頭 部 區 的 個 數 分 佈 以 及 被 吸 附 的 能 量 ;(4) 發 現 具 有 飽 和 碳 氫 鏈 的 脂 膜, 在 發 生 相 變 時, 僅 有 碳 氫 鏈 結 構 產 生 改 變, 而 一 旦 外 接 甲 烷 基 於 碳 氫 鏈 上, 則 脂 膜 的 碳 氫 鏈 與 頭 部 區 之 結 構 在 相 變 70

時 都 會 改 變 本 文 所 改 良 的 X- 光 片 層 繞 射 技 術, 測 量 結 構 可 達 0.1 Å 的 解 析 度, 足 以 運 用 於 研 究 生 物 分 子 或 藥 物 分 子 與 脂 膜 的 交 互 作 用, 預 期 它 將 成 為 生 物 科 技 生 命 科 學 研 究 中 的 一 個 重 要 技 術 71

參 考 文 獻 1. 歐 陽 鐘 汕 和 劉 寄 星, 從 肥 皂 泡 到 液 晶 生 物 膜, 新 世 紀 物 理 研 習 叢 書 9, 牛 頓 出 版, 台 灣 (1995) 87. 2.S. R. Schwarze, A. Ho, A. V. Akbani and S. F. Dowdy, Scince 285 (1999) 1569. 3. 倫 斯 伯 格 著, 涂 可 欣 譯, 一 粒 細 胞 見 世 界, 科 學 天 地 4, 天 下 出 版, 台 灣 (1999) 85. 4.D. Hultmark, H. Steiner, T. Rasmuson and H. G. Boman, Eur. J. Biochem. 106 (1980) 7. 5.M. Zasloff, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 (1987) 5449. 6.H. G. Boman, J. Marsh and J. A. Goode, Antimicrobial peptide, Ciba Foundatuon Symposium 186(1994). 7.R. H.Pearson, and I. Pascher, Nature. 281 (1979 ) 499. 8.H. Hauser, I. Pascher, R. H. Pearson, and S. Sundell, Biochim. Biophys. Acta. 650 (1981) 21. 9.P. B. Hitchcock, R. Mason, K. M. Thomas, and G. G. Shipley, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 71 (1974) 3036. 10. G. S. Smith, E. B. Sirota, C. R. Safinya, and N. A. Clark, Phys. Rev. Lett. 60 (1988) 813. 11. G. S. Smith, E. B. Sirota, C. R. Safinya, R. J. Plano and N. A. Clark, J. Chem. Phys. 92 (1990) 4519. 12. C. Tanford, The Hydrophobic Effect: Formation of Micelles and Biological Membranes. Wiley, New York, (1980) 1. 13. J. Israelachvili, R. Horn, and D. Marcelja, Q. Rev. Biophys. 13 (1980) 72

121. 14. Marsh, Biochim. Biophys. Acta. 1286 (1996) 183. 15. J. Lemmich, K. Mortensen, J. H. Ipsen, T. Honger, R. Bauer and O. G. Mouritsen, Phys. Rev. Lett. 75 (1995) 3958. 16. R. Zhang, W. Sun, S. Tristram-Nagle, R. L. Headrick, R. M. Suter and J. F. Nagle, Phys. Rev. Lett. 74 (1995) 2832. 17. J. F. Nagle, D. A. Wilkinson, Biophy. J. 23 (1978) 159. 18. D. M. Small, J. Lipid Res. 8 (1967) 551. 19. A. Tardieu, V. Luzzati and F. C. Reman, J. Mol. Biol.75 (1973) 711. 20. J. F. Nagle and D. A. Wilkinson, Biophys. J. 23 (1978) 159. 21. J. F. Nagle and M. C. Wiener, Biochim. Biophys. Acta, 942 (1988) 1. 22. W. -J. Sun, R. M. Suter, M. A. Knewtson, C. R. Worthington, S. Tristram-Nagle, R. Zhang and J. F. Nagle, Phys. Rev. E 49 (1994) 4665. 23. H. Hauser, I. Pascher, R. H. Pearson and S. Sundell, Biochem. Biophys. Acta, 650 (1981) 21. 24. T. J. McIntosh and S. A. Simon, Biochemistry 25 (1986) 4058. 25. M. C. Wiener, R. M. Suter, and J. F. Nagle, Biophys. J. 55 (1989) 315. 26. H. I. Petrache, S. E. Feller and J. F. Nagle, Biophys. J. 72 (1997) 2237. 27. M.C. Wiener and S. H. White, Biophys. J. 61 (1992) 434. 28. L. D. Landau, E. M. Lifshitz, Statistical Physics, Pergamon Press, New York, 1968, pp. 256. 73

附 錄 一 Calculation of DMPC/H 2 O Absorption Coefficient DMPC : C 36 H 72 NPO 8 MW = 677.94 (g/mole) From X-ray table of μ m : Mass Absorption Coefficient (cm 2 /g) μ H m =0.435(cm 2 /g) MW H =1.0129688 μ C m = 4.60 (cm 2 /g) MW C =12.0 μ O m = 7.52(cm 2 /g) MW O =16.0 μ N m = 11.5(cm 2 /g) MW N =14.0 μ P m = 74.1(cm 2 /g) MW P =31.0 μ m DMPC =(μ m H 72 MW H +μ m C 36 MW C + μ m O 8 MW O μ m N 1 MW N +μ m P 1 MW P )/ MW DMPC =(0.435 72 1.0129688+4.6 36 12+7.52 8 16+ 11.5 1 14+74.1 1 31) / 677.94 =(31.72+1987.2+962.56+161+2297.1)/ 677.94 =5439.58 / 677.94 =8.02 (cm 2 /g) μ m H 2 O = μ m H 2/18 +μ m O 16/18 74

=0.435 2/18+7.52 16/18 =0.048333+6.68712963 =6.735(cm 2 /g) From μ m to μ μ=μ m ρ μ: absoption coefficient μ H 2 O =6.735/1=6.735(cm -1 ) μ DMPC =8.02 /0.98=8.18(cm -1 ) Note: ρ DMPC =1/0.98 (Rand, R. P., and V. A. Parsegian. 1989. Hydration forces between phosphlipid bilayers. Biochim. Biophys. Acta. 988:351-376.) 75

附 錄 二 決 定 多 片 層 脂 膜 繞 射 振 幅 之 真 值 的 方 法 1. 膨 脹 (Swelling) 法 : 利 用 不 同 脂 膜 厚 度 下 測 得 的 形 態 因 子 ( 或 稱 為 繞 射 振 幅 ), 將 其 堆 放 在 一 起, 並 依 據 各 階 次 振 幅 正 負 值 組 合 起 來 的 連 續 性 加 以 研 判 各 階 次 繞 射 振 幅 的 正 負, 如 下 圖 所 示 但 因 為 此 法 常 會 有 多 種 振 幅 組 合 看 起 來 也 很 連 續, 使 得 研 判 的 正 負 可 信 度 降 低 DPhPC 25 o C F(q) 0 L α 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 q(å -1 ) 76

2. 圖 像 辨 識 法 : 依 據 脂 膜 雙 層 的 分 子 結 構 可 以 研 判 電 子 密 度 分 佈 是 否 合 理, 例 如 脂 膜 兩 個 磷 酸 根 PO 4 的 位 置 應 為 兩 個 最 高 峰 ; 兩 個 甘 油 基 的 碳 氧 原 子 聚 集 之 處 應 為 兩 個 次 高 峰 ; 兩 個 碳 氫 鏈 的 尾 尾 CH 3 相 接 處, 應 為 最 低 谷 且 位 於 脂 膜 中 央 根 據 以 上 的 研 判 條 件, 由 各 階 次 振 幅 正 負 值 組 合 所 得 到 的 個 電 子 密 度 分 佈 圖 中, 選 取 合 理 者, 即 為 圖 像 辨 識 法 實 際 上, 通 常 能 夠 滿 足 電 子 密 度 特 徵 的 組 合 為 唯 一, 如 圖 1-5 所 示 故 此 法 具 有 高 可 信 度, 但 是 很 費 時, 因 此 實 際 更 有 效 率 的 作 法, 是 先 以 膨 脹 (Swelling) 法 作 粗 選, 再 以 圖 像 辨 識 法 來 精 選, 如 此 即 可 有 效 且 正 確 地 得 到 形 態 因 子 的 真 值 與 脂 膜 結 構 77

附 錄 三 膠 體 態 的 DMPC 其 碳 氫 鏈 長 度 D hc 的 合 理 估 計 圖 3-7(b) 為 膠 體 態 脂 膜 的 雙 層 結 構 之 分 子 模 型, 此 模 型 是 由 兩 個 脂 質 分 子 所 組 成, 其 中 每 個 脂 質 分 子 的 β-chain 會 對 應 到 另 一 個 脂 質 分 子 的 γ-chain 假 定 甘 油 基 的 C3-C2-O21 以 及 L 形 的 β-chain 上 的 C21-C22 等 原 子, 為 腳 鏈 傾 斜 的 轉 軸 ( 其 中,C3 與 C22 即 分 別 為 γ chain 和 β chain 的 轉 動 軸 點 ) 依 此, 可 以 轉 動 傾 斜 的 長 度, 其 D hc =[l c-o-c +(n-1) l c-c ]+[(n-2) l c-c ]+l CH3-CH3, 其 中 的 兩 個 括 弧 分 別 代 表 γ chain 及 β chain 的 長 度, l c-c =1.27Å 為 在 結 晶 結 構 時 C-C 在 碳 鏈 軸 上 的 投 影 距 離,l c-o-c = 2.26 Å 是 由 結 晶 結 構 直 接 得 到 的 數 據,l CH3-CH3 為 兩 個 膜 分 子 尾 端 的 CH 3 分 子 間 之 距 離, 我 們 根 據 在 結 晶 態 的 DLPE 脂 膜 分 子 結 構 估 計 得 到 3.91Å [Elde et al., Proc. R. Soc. Lond. A. 354 (1977) 157] 由 這 些 數 據 我 們 可 以 估 計 n=14 的 DMPC, 其 D hc =37.9Å 這 數 值 與 文 中 使 用 的 36.7Å 相 當 接 近, 故 D hc =36.7Å 為 合 理 值 78

附 錄 四 舊 有 截 面 積 壓 縮 係 數 計 算 式 的 錯 誤 以 往 的 理 論 [Parsegian et al., 1979; Lis et al., 1982; Koenig et al., 1997] 計 算 滲 透 壓 Π 對 脂 膜 產 生 的 界 面 張 力 σ, 都 以 Π 對 水 合 脂 膜 系 統 所 作 的 功,-ΠdV w, 為 基 礎, 其 中 V w = DA-2V L 為 每 一 對 脂 膜 分 子 含 水 的 體 積 定 義 D w 為 平 均 水 層 的 厚 度 ( 包 括 頭 部 區 的 水 以 及 脂 膜 間 的 水 ), 則 V w = AD w 故 -ΠdV w = -Π D w da-πadd w, 則 膜 脂 的 界 面 張 力 σ = -D w Π, 根 據 截 面 積 壓 縮 係 數 定 義 K a =A ( σ / A), 代 入 σ = -D w Π 即 得 : K a = - A [ (D w Π )/ A] (1) 因 為 多 片 層 脂 膜 不 是 均 向 性 系 統, 因 此 -ΠdV w = -Π D w da-πadd w 很 有 問 題 假 若 A 與 D w 是 兩 個 獨 立 變 數, 則 一 個 V w 將 可 以 對 應 到 很 多 D w 與 A 的 組 合, 其 中 每 一 個 組 合 都 應 對 到 不 同 的 熱 力 學 狀 態, 因 此 V w 將 不 會 是 熱 力 學 變 數 反 之, 假 如 A 與 D w 相 互 有 關, 亦 即 只 要 得 知 其 中 一 個 即 可 決 定 另 一 個, 則 將 dv w 展 開 分 為 兩 個 獨 立 的 da 與 dd w 項 是 不 正 確 的 在 實 驗 上 是 脂 膜 的 含 水 量 利 用 滲 透 壓 來 控 制, 所 以 D w 79