中 国 农 学 通 报,3(3):4347 Chinese Agricultural cience Bulletin 市 售 草 鱼 鳃 中 细 菌 的 分 离 鉴 定 及 分 析 胡 秀 彩 1, 兰 云, 沈 晓 静, 吕 爱 军 1 1, 朱 爱 华 ( 1 江 苏 师 范 大 学 江 苏 省 药 用 植 物 生 物 技 术 重 点 实 验 室, 江 苏 徐 州 ; 江 苏 师 范 大 学 生 命 科 学 学 院, 江 苏 徐 州 ) 摘 要 : 对 徐 州 市 售 草 鱼 细 菌 带 染 状 况 及 分 析, 结 果 表 明 从 其 鳃 中 分 离 到 4 株 革 兰 氏 阴 性 短 杆 菌, 暂 时 编 号 为 ZYF1 ZYF ZYF3 和 ZYF4, 查 阅 数 值 编 码 鉴 定 ZYF1 菌 株 为 志 贺 菌 (higella sp.), ZYF ZYF3 菌 株 为 大 肠 埃 希 菌 (Escherichia coli),zyf4 菌 株 为 泉 居 沙 雷 菌 (erratia fonticola) 药 敏 试 验 结 果 表 明,4 株 分 离 菌 的 耐 药 率 分 别 为 7.8% 7.4% 6.% 和 8.8%, 均 对 氨 苄 西 林 阿 莫 西 林 复 方 新 诺 明 磺 胺 异 恶 唑 和 甲 氧 苄 啶 等 种 抗 生 素 耐 药 本 研 究 显 示 市 售 草 鱼 存 在 志 贺 菌 大 肠 埃 希 菌 带 染 现 象, 对 多 种 抗 生 素 耐 药, 这 为 食 源 性 细 菌 鉴 定 及 鱼 病 防 治 提 供 参 考 关 键 词 : 草 鱼 ; 鳃 ; 分 离 鉴 定 ; 药 敏 试 验 中 图 分 类 号 :378 文 献 标 志 码 :A 论 文 编 号 :3 dentification and Antimicrobial esistance Analysis of Bacteria solated from the Gills of Commercial Grass Carp (Ctenopharyngodon idellus) Hu Xiucai 1, Lan Yun, hen Xiaojing, Lv Aijun, Zhu Aihua ( 1 Key Laboratory of Biotechnology for Medicinal Plant of Jiangsu Province, Jiangsu Normal University, Xuzhou Jiangsu ; chool of Life ciences, Jiangsu Normal University, Xuzhou Jiangsu ) Abstract: nvestigation was conducted on bacterial contamination and antimicrobial resistance of the strains isolated from the gills of commercial Grass carp (Ctenopharyngodon idellus) in Xuzhou, four isolated strains were gramnegative and short rodshaped bacteria, and tentatively named ZYF 1, ZYF, ZYF3 and ZYF 4, respectively. According to the values of coding method of four strains, ZYF1 was identified as higella sp., ZYF and ZYF3 were identified as Escherichia coli, and ZYF 4 was identified as erratia fonticola. The antimicrobial susceptibility assay indicated that the resistance rates of ZYF 1, ZYF, ZYF 3 and ZYF 4 strains were 7.8% 7.4% 6.% and 8.8%, respectively. Four strains showed antibiotic resistance to eleven kinds of antibiotics, such as ampicillin, amoxicillin, trimethoprim sulfamethoxazole, sulfisoxazole, trimethoprim and so on. t is concluded that there are higella and Escherichia coli contamination in commercially available Ctenopharyngodon idellus in Xuzhou, and the bacteria showed multidrug resistances in antimicrobial susceptibility assay. The conclusion will provide scientific references for identification of foodborne bacteria and control of bacterial disease in fish. Key words: Ctenopharyngodon idellus; gill; isolation and identification; antimicrobial susceptibility assay 引 言 志 贺 菌 属 (higella) 埃 希 菌 属 (Escherichia) 和 沙 雷 菌 属 (erratia) 等 均 为 肠 杆 菌 科 细 菌, 也 是 主 要 的 肠 道 [] 致 病 菌, 可 引 起 人 兽 及 鱼 类 疾 病 张 红 见 等 从 鲫 鱼 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 项 目 嗜 水 气 单 胞 菌 诱 导 斑 马 鱼 皮 肤 免 疫 应 答 的 分 子 机 制 (38847), 江 苏 省 青 蓝 工 程 () 第 一 作 者 简 介 : 胡 秀 彩, 女,76 年 出 生, 江 苏 铜 山 人, 实 验 师, 硕 士, 主 要 从 事 资 源 微 生 物 学 研 究 Tel:8343,Email:huxiucai@6.com 通 讯 作 者 : 吕 爱 军, 男,73 年 出 生, 内 蒙 古 锡 盟 人, 副 教 授, 博 士, 主 要 从 事 微 生 物 及 免 疫 学 研 究 通 信 地 址 : 江 苏 省 徐 州 市 铜 山 区 上 海 路 号, 江 苏 师 范 大 学 生 命 科 学 学 院,Tel:8343,Email:lajand@6.com 收 稿 日 期 :3, 修 回 日 期 :3
44 中 国 农 学 通 报 http://www.casb.org.cn (Carassius carp) 鳃 中 分 离 到 沙 门 菌 (almonella) 和 志 贺 菌 (higella), 发 现 鱼 类 污 染 肠 道 致 病 菌 现 象 严 重 胡 秀 彩 等 研 究 鲤 鱼 (Cyprinus carpio) 肠 道 细 菌 获 得 结 果 [] [4] 与 张 红 见 等 报 道 基 本 一 致 Onyango 等 研 究 表 明 罗 非 鱼 (Oreochromis mossambicus) 带 染 细 菌 主 要 为 志 [] 贺 菌 大 肠 埃 希 菌 和 沙 门 菌 等 肠 杆 菌 Baya 等 从 白 鲈 鱼 (White perch) 中 分 离 到 粘 质 沙 雷 菌 (erratia marcescens), 报 道 该 菌 为 鱼 类 潜 在 病 原 菌 之 一 Akoachere 等 从 赤 鯛 (Pagrus pagrus) 金 鲳 (Monodactylus sebae) 和 鲇 鱼 (Arius heudelottii) 等 多 种 鱼 类 鳃 皮 肤 和 肠 道 中 分 离 到 埃 希 菌 沙 雷 菌 和 克 雷 伯 菌 (Klebsiella) 等 条 件 致 病 菌, 表 明 人 类 致 病 菌 污 染 鱼 类 现 象 普 遍 因 此, 研 究 鱼 类 食 源 性 细 菌 污 染 状 况 及, 对 鱼 类 健 康 养 殖 公 共 卫 生 及 水 产 品 安 全 检 疫 等 具 有 重 要 意 义 鱼 类 鳃 具 有 气 体 交 换 排 泄 代 谢 物 和 参 与 渗 透 调 节 功 能, 其 表 面 积 大 细 菌 易 聚 集, 是 细 菌 栖 息 繁 殖 场 所 之 一 近 年 来, 关 于 鱼 类 鳃 中 细 菌 研 究, 仍 处 于 起 步 阶 段 最 近, 王 艺 等 从 市 售 鲫 鱼 (Carassius carp) 鳃 中 分 离 到 1 株 迟 钝 爱 德 华 氏 菌 (Edwardsiella tarda), 报 道 是 一 种 人 鱼 共 患 病 原 菌 目 前, 针 对 草 鱼 (Ctenopharyngodon idellus) 鳃 中 细 菌 的 分 离 鉴 定 及 耐 药 性 分 析, 国 内 外 尚 未 见 文 献 报 道 本 研 究 从 徐 州 市 售 草 鱼 鳃 中 分 离 到 4 株 细 菌, 并 进 行 生 理 生 化 鉴 定 相 关 研 究, 不 仅 有 助 于 了 解 鱼 类 食 源 性 细 菌 污 染 情 况 及 耐 药 机 制, 而 且 为 鱼 病 防 治 等 提 供 科 学 参 考 1 材 料 与 方 法 1.1 材 料 草 鱼 ( 体 重 约. kg) 购 自 江 苏 省 徐 州 市 某 农 贸 市 场, 随 机 选 择 健 康 活 泼 的 草 鱼, 迅 速 带 回 实 验 室 饲 养 备 用 LB 培 养 基 肠 杆 菌 科 细 菌 生 化 编 码 鉴 定 管 (GYZ e) 和 药 敏 纸 片 等 均 购 自 杭 州 微 生 物 试 剂 有 限 公 司 1. 方 法 细 菌 分 离 参 照 王 艺 等 方 法 进 行 无 菌 操 作 取 适 量 的 鳃 组 织, 用 无 菌 生 理 盐 水 冲 洗 3 次, 放 入 生 理 盐 水 中 振 荡 min, 取 µl 生 理 盐 水 涂 布 于 LB 平 板, 培 养 过 夜, 挑 取 单 菌 落 经 ~3 次 反 复 传 代 获 得 纯 种 菌 株, 分 别 接 种 于 LB 培 养 基, 培 养 ~4 h, 于 4 保 存 备 用, 进 行 革 兰 氏 染 色 和 镜 检 细 菌 生 理 生 化 及 药 敏 试 验 参 照 胡 秀 彩 等 方 法 进 行 无 菌 操 作 挑 取 适 量 细 菌 接 种 于 细 菌 生 化 鉴 定 管, 于 恒 温 培 养 48 h 后, 观 察 记 录 结 果 采 用 KB 法 进 行 药 敏 试 验, 选 用 种 抗 生 素 对 4 株 细 菌 进 行 药 物 抑 菌 试 验, 测 量 抑 菌 圈 直 径 取 平 均 值 结 果 与 分 析.1 细 菌 的 形 态 及 生 化 特 征 从 徐 州 市 售 草 鱼 鳃 中 分 离 得 到 4 株 细 菌, 暂 时 编 号 为 ZYF1 ZYF ZYF3 和 ZYF4, 革 兰 氏 染 色 均 为 革 兰 氏 阴 性 短 杆 菌 ; 其 中 ZYF1 菌 落 为 黄 色 中 等 大 小 半 透 明 表 面 光 滑,ZYF 和 ZYF3 菌 落 均 为 浅 黄 色 圆 形 边 缘 整 齐,ZYF4 菌 落 呈 白 色 较 小 不 透 明 选 用 肠 杆 菌 科 细 菌 生 化 编 码 鉴 定 管 进 行 项 生 化 特 性 检 测, 包 括 硫 化 氢 产 生 苯 丙 氨 酸 脱 氨 酶 葡 萄 糖 酸 盐 靛 基 质 M 枸 橼 酸 盐 尿 素 动 力 葡 萄 糖 产 气 赖 氨 酸 脱 羧 酶 鸟 氨 酸 脱 羧 酶 棉 子 糖 山 梨 醇 侧 金 盏 花 醇 和 木 糖 试 验 结 果 表 明 :4 株 细 菌 均 能 利 用 葡 萄 糖 产 酸 产 气,M 试 验 阳 性, 硫 化 氢 苯 丙 氨 酸 脱 氨 酶 葡 萄 糖 酸 盐 和 脲 酶 试 验 阴 性 ( 见 表 1); 结 合 菌 落 及 形 态 特 征 生 理 生 化 特 性,ZYF1 菌 株 编 码 值 为 61,ZYF ZYF3 菌 株 编 码 值 为 6,ZYF4 菌 株 编 码 值 为 3377, 查 询 数 值 编 码 表, 鉴 定 结 果 表 明 ZYF1 菌 株 为 志 贺 菌 (higella sp.),zyf 和 ZYF3 菌 株 为 大 肠 埃 希 菌 (Escherichia coli),zyf4 菌 株 为 泉 居 沙 雷 菌 (erratia fonticola) 表 1 草 鱼 鳃 中 分 离 菌 的 生 化 特 性 肠 杆 菌 科 细 菌 生 化 编 码 鉴 定 管 菌 株 硫 化 氢 产 生 苯 丙 氨 酸 脱 氨 酶 葡 萄 糖 酸 盐 靛 基 质 M 试 验 枸 橼 酸 盐 尿 素 动 力 葡 萄 糖 产 气 赖 氨 酸 脱 羧 酶 鸟 氨 酸 脱 羧 酶 棉 子 糖 山 梨 醇 侧 金 盏 花 醇 木 糖 ZYF1 ZYF/ZYF3 ZYF4 注 : 代 表 阴 性, 代 表 阳 性. 药 敏 试 验 结 果 对 所 测 种 抗 生 素 药 敏 试 验 结 果 分 析 发 现,4 株 细 菌 耐 药 率 达 6% 以 上,ZYF 1 ZYF ZYF 3 和 ZYF4 分 离 株 的 耐 药 率 分 别 为 7.8% 7.4% 6.% 和
胡 秀 彩 等 : 市 售 草 鱼 鳃 中 细 菌 的 分 离 鉴 定 及 分 析 4 8.8%, 均 对 氨 苄 西 林 阿 莫 西 林 哌 拉 西 林 复 方 新 诺 明 磺 胺 异 恶 唑 洁 霉 素 甲 硝 唑 甲 氧 苄 啶 替 考 拉 宁 制 菌 霉 素 和 克 林 霉 素 等 种 抗 生 素 耐 药 ; 其 中 ZYF ZYF3 相 似, 仅 对 丁 胺 卡 那 霉 素 红 霉 素 和 奥 复 星 存 在 差 异, 这 与 ZYF ZYF3 均 为 大 肠 埃 希 菌 的 生 化 鉴 定 结 果 相 符 ;ZYF1 ZYF4 耐 药 率 达 7% 以 上, 而 对 头 孢 噻 吩 头 孢 克 肟 头 孢 噻 肟 先 锋 霉 素 Ⅳ 四 环 素 制 菌 霉 素 萘 啶 酸 诺 氟 沙 星 奥 复 星 氯 霉 素 利 福 平 等 多 种 抗 生 素 不 同 此 外,4 株 细 菌 对 庆 大 霉 素 卡 那 霉 素 乙 基 西 梭 霉 素 和 阿 奇 霉 素 敏 感 ; 表 草 鱼 鳃 中 分 离 菌 药 敏 试 验 抗 生 素 浓 度 /μg ZYF1 ZYF ZYF3 ZYF4 丁 胺 卡 那 霉 素 3 4 庆 大 霉 素 1 1 卡 那 霉 素 3 乙 基 西 梭 霉 素 3 头 孢 噻 吩 3 1 头 孢 克 肟 3 4 先 锋 霉 素 Ⅳ 3 氨 苄 西 林 1 1 阿 莫 西 林 1 哌 拉 西 林 1 复 方 新 诺 明 3 4 磺 胺 异 恶 唑 3 洁 霉 素 8 甲 硝 唑 甲 氧 苄 啶 替 考 拉 宁 3 四 环 素 3 8 头 孢 孟 多 3 头 孢 噻 肟 3 4 阿 奇 霉 素 红 霉 素 制 霉 菌 素 1 萘 啶 酸 3 诺 氟 沙 星 1 31 奥 复 星 氯 霉 素 3 1 6 7 利 福 平 克 林 霉 素 呋 喃 妥 因 3 注 : 表 示 耐 药, 表 示 中 敏, 表 示 高 度 敏 感 ZYF1 对 诺 氟 沙 星 氯 霉 素 耐 药, 而 ZYF ZYF3 和 ZYF4 菌 株 对 种 抗 生 素 均 敏 感 ( 见 表 ) 3 讨 论 鱼 类 鳃 不 仅 在 呼 吸 代 谢 毒 物 降 解 及 排 泄 等 方
46 中 国 农 学 通 报 http://www.casb.org.cn 面 发 挥 功 能, 也 是 鱼 类 细 菌 的 主 要 栖 息 繁 殖 场 所, 易 受 病 原 菌 污 染 因 此, 研 究 鱼 类 鳃 中 细 菌 对 了 解 食 源 性 细 菌 污 染 状 况 鱼 类 健 康 养 殖 等 有 重 要 意 义 近 年 来, 环 境 污 染 导 致 养 殖 鱼 类 带 染 细 菌 现 状, 倍 受 国 内 外 学 者 关 注 [4,6,8] 与 鱼 类 肠 道 细 菌 研 究 相 比 [], 目 前 对 鳃 中 细 菌 的 分 离 鉴 定 研 究 报 道 较 少 近 几 [] [4] [] 年, 相 继 从 鲫 鲤 罗 非 鱼 和 鲈 鱼 等 鱼 类 鳃 肠 道 中 检 测 到 志 贺 菌 沙 门 菌 大 肠 杆 菌 和 沙 雷 菌 等 致 病 菌, 揭 示 鱼 类 细 菌 污 染 情 况 严 重 试 验 从 市 售 草 鱼 鳃 中 分 离 到 志 贺 菌 大 肠 埃 希 菌 和 泉 居 沙 雷 菌, 并 且 市 售 草 鱼 尚 无 明 显 病 变, 说 明 很 可 能 为 水 体 污 染 所 致, 其 导 致 人 类 食 源 性 细 菌 污 染 发 病 规 律 有 待 进 一 步 研 究 研 究 表 明, 鱼 类 鳃 中 细 菌 与 周 围 水 环 境 有 关, 水 中 [] 病 原 菌 可 通 过 鳃 而 感 染 鱼 类 himotori 等 报 道 志 贺 菌 人 工 接 种 鱼 贝 类 可 再 分 离 获 得, 证 实 志 贺 菌 能 引 起 [1] 养 殖 水 体 污 染 AlBahry 等 通 过 研 究 城 市 污 水 污 染 海 水 和 鱼 中 细 菌, 指 出 城 市 污 水 给 沿 海 鱼 类 带 来 严 重 污 染, 认 为 鱼 鳃 肠 道 细 菌 是 监 测 沿 海 污 水 排 放 对 鱼 [4] 类 影 响 因 素 之 一 Onyango 等 通 过 对 市 售 罗 非 鱼 体 内 细 菌 检 测, 发 现 主 要 为 志 贺 菌 大 肠 杆 菌 和 沙 门 菌 等 肠 杆 菌, 推 测 城 市 污 水 污 染 为 罗 非 鱼 感 染 主 要 原 因 之 一 Akoachere 等 通 过 对 鱼 皮 肤 鳃 和 肠 道 细 菌 进 行 分 离 鉴 定, 发 现 细 菌 主 要 来 自 污 染 水 体 中 的 埃 希 菌 沙 雷 菌 和 柠 檬 酸 杆 菌 (Citrobacter) 等 肠 道 致 病 菌, 其 中 皮 肤 污 染 率 为 4.6%, 鳃 污 染 率 为 8.% 由 此 可 见, 这 些 细 菌 可 能 来 自 养 殖 水 体, 从 水 中 进 入 鳃 后 再 大 量 繁 殖, 推 断 鱼 鳃 很 可 能 是 一 些 条 件 致 病 菌 的 栖 息 场 所 笔 者 对 市 售 草 鱼 鳃 中 细 菌 进 行 分 离 鉴 定, 得 到 与 国 外 学 者 类 似 结 论 [1,1] 因 此, 应 该 引 起 相 关 部 门 和 消 费 者 重 视, 对 市 售 鱼 类 等 水 产 品 加 强 监 管 监 测, 积 极 做 好 预 防 控 制 工 作, 以 减 少 食 源 性 水 产 品 病 原 菌 污 染 发 生 在 鱼 类 养 殖 过 程 中, 水 环 境 条 件 改 变, 如 水 温 溶 解 氧 和 水 污 染 等 均 可 破 坏 鳃 中 菌 群 平 衡, 促 使 条 件 致 病 菌 异 常 增 殖, 导 致 鱼 病 常 有 暴 发 ; 同 时, 药 物 不 合 理 使 用 或 滥 用, 导 致 诸 多 耐 药 菌 株 产 生, 进 一 步 增 加 [] 了 鱼 病 防 治 难 度 江 艳 华 等 研 究 发 现 养 殖 海 虾 中 副 溶 血 弧 菌 (Vibrio parahaemolyticus) 存 在 较 严 重 污 染, 其 中 6% 的 菌 株 对 氨 苄 西 林 和 阿 莫 西 林 耐 药, 部 [] 分 菌 株 呈 现 多 重 Onyuka 等 从 水 和 鱼 体 中 分 离 得 到 大 肠 埃 希 菌 沙 门 菌 和 霍 乱 弧 菌 (Vibrio cholerae) 等, 发 现 分 离 菌 对 诺 氟 沙 星 和 环 丙 沙 星 敏 感, 对 氨 苄 西 林 复 方 新 诺 明 和 四 环 素 具 强 胡 秀 彩 等 从 市 售 鲤 鱼 肠 道 中 分 离 获 得 志 贺 菌, 证 实 其 对 头 孢 孟 多 高 度 敏 感, 对 复 方 新 诺 明 磺 胺 异 恶 唑 洁 霉 素 和 甲 氧 苄 啶 等 耐 药 Akoachere 等 研 究 表 明 鱼 类 鳃 皮 肤 和 肠 道 中 埃 希 菌 沙 雷 菌 和 克 雷 伯 菌 等 肠 杆 菌 污 染 严 重, 所 有 菌 株 对 环 丙 沙 星 氧 氟 沙 星 和 复 方 新 诺 明 敏 感, 其 中 4.7% 的 分 离 菌 株 对 氨 苄 青 霉 [] 素 耐 药 颜 秉 秉 等 从 团 头 鲂 肠 道 中 分 离 的 弗 氏 志 贺 菌 对 洁 霉 素 复 方 新 诺 明 和 头 孢 噻 吩 等 3 种 抗 生 [] 素 % 以 上 具 有 于 清 华 对 医 院 感 染 沙 雷 菌 分 析 发 现, 对 氨 苄 西 林 头 孢 唑 林 哌 拉 西 林 耐 药 率 在 8% 以 上 实 验 药 敏 结 果 分 析 发 现 志 贺 氏 菌 大 肠 埃 希 菌 泉 居 沙 雷 菌 等 4 株 分 离 细 菌 对 β 内 酰 胺 类 ( 氨 苄 西 林 阿 莫 西 林 哌 拉 西 林 ) 磺 胺 类 ( 复 方 新 诺 明 磺 胺 异 恶 唑 ) 以 及 洁 霉 素 甲 硝 唑 和 甲 氧 苄 啶 等 药 物 具 强, 对 所 测 种 抗 生 素 耐 药 率 达 6% 以 上, 推 测 这 种 现 状 不 仅 与 临 床 过 度 使 用 药 物 有 关, 而 且 耐 药 菌 株 可 造 成 鱼 类 等 水 产 品 污 染 实 验 对 草 鱼 鳃 中 细 菌 进 行 分 离 鉴 定 及 分 析, 结 果 表 明 阿 奇 霉 素 以 及 氨 基 糖 苷 类 药 物 ( 庆 大 霉 素 卡 那 霉 素 乙 基 西 梭 霉 素 ) 能 够 有 效 抑 制 4 株 分 离 细 菌, 这 为 水 产 健 康 养 殖 鱼 病 防 治 以 及 水 产 品 安 全 检 疫 等 提 供 科 学 参 考 参 考 文 献 [1] 张 红 见, 韩 志 辉, 李 小 龙. 鲫 鱼 鳃 中 沙 门 氏 菌 的 分 离 与 鉴 定 [J]. 青 海 畜 牧 兽 医 杂 志,,():. [] 张 红 见, 韩 志 辉, 顾 锡 霞. 西 宁 市 售 鲤 鱼 鳃 中 志 贺 氏 菌 的 检 测 及 血 清 学 分 型 [J]. 甘 肃 畜 牧 兽 医,1,4(3):. 胡 秀 彩, 胡 宏 晓, 吕 爱 军. 鲫 鱼 肠 道 中 沙 门 氏 菌 志 贺 氏 菌 分 离 鉴 定 及 药 敏 试 验 [J]. 中 国 畜 牧 兽 医,,38(4):. [4] Onyango MD, Wandili, Kakai, et al. solation of almonella and higella from fish harvested from the Winam Gulf of Lake Victoria, Kenya [J]. J nfect Developing Countries,,3():. DO: 1.38/jidc.6 [] Baya AM, Toranzo AE, Lupiani B, et al. erratia marcescens: A potential pathogen for fish [J]. Journal of Fish Diseases, (1): 6. DO: 1./j.6761..tb63.x Akoachere JF, Bughe N, Oben BO, et al. Phenotypic characterization of human pathogenic bacteria in fishes from the coastal waters of outh West Cameroon: Public health implications [J]. eviews of Environmental Health,, 4 (): 76. DO: 1./EVEH..4..7 王 艺, 李 槿 年, 兰 云, 等. 鲫 鱼 鳃 中 迟 钝 爱 德 华 氏 菌 的 分 离 与 鉴 定 [J]. 江 苏 农 业 科 学,,41():1. [8] Toranzo AE, Magariños B, omalde JL. A review of the main
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