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2015 年 3 月 Vol.33 No.3 March 2015 Chinese Journal of Chromatography 256 ~ 266 研 究 论 文 DOI: 10.3724 / SP.J.1123.2014.11001 高 效 液 相 色 谱 离 子 阱 质 谱 法 快 速 筛 查 改 善 睡 眠 类 保 健 芦 丽, 宫 旭, 谭 力 ( 江 苏 省 食 品 药 品 监 督 检 验 研 究 院, 江 苏 南 京 210008) 摘 要 : 建 立 了 高 效 液 相 色 谱 离 子 阱 质 谱 (HPLC IT MS) 同 时 测 定 改 善 睡 眠 类 保 健 食 品 中 非 法 添 加 的 24 种 镇 静 催 眠 药 的 快 速 筛 查 方 法 样 品 经 甲 醇 超 声 提 取 20 min, 经 0 45 μm 滤 膜 过 滤 后 进 行 HPLC IT MS 分 析 检 测 采 用 Phenomenex Luna C18 色 谱 柱 分 离, 流 动 相 A 为 0 05% (v / v) 甲 酸 水 溶 液, 流 动 相 B 为 甲 醇 乙 腈 (15 25, v / v) 溶 液, 等 度 洗 脱 ; 采 用 电 喷 雾 离 子 (ESI) 源 及 正 负 离 子 切 换 模 式, 扫 描 MS 1 ~ MS 3 三 级 质 谱, 利 用 24 种 药 物 的 MS / MS (MS 2 ) 和 MS / MS / MS(MS 3 ) 质 谱 对 样 品 进 行 定 性 筛 查 24 种 镇 静 催 眠 药 品 在 一 定 线 性 范 围 内 线 性 关 系 良 好, 相 关 系 数 (r 2 ) 均 大 于 0 999, 检 出 限 在 4 0~ 446 6 μg / L 之 间,3 个 添 加 水 平 的 回 收 率 为 88 6% ~ 110 3%, 相 对 标 准 偏 差 (RSD) 在 0 8% ~ 9 8% 之 间 27 批 样 品 经 筛 查 发 现 有 18 批 样 品 检 出 褪 黑 素 该 方 法 快 速 灵 敏 处 理 方 法 简 单, 可 用 于 保 健 食 品 中 非 法 添 加 镇 静 催 眠 类 药 品 的 快 速 筛 查 关 键 词 : 高 效 液 相 色 谱 离 子 阱 质 谱 ; 镇 静 催 眠 药 品 ; 保 健 食 品 ; 快 速 筛 查 中 图 分 类 号 :O658 文 献 标 识 码 :A 文 章 编 号 :1000 8713(2015)03 0256 11 Fast screening of 24 sedative hypnotics illegally added in improving sleep health foods by high performance liquid chromatography ion trap mass spectrometry LU Li, GONG Xu, TAN Li (Jiangsu Institute for Food and Drug Control, Nanjing 210008, China) Abstract: A fast screening method was established for the simultaneous determination of 24 sedative hypnotics illegally added in improving sleep health foods by high performance liquid chromatography ion trap mass spectrometry ( HPLC IT MS). The method was based on the son ication assisted extraction of the improving sleep health food samples using methanol. The ex tract was then filtrated with 0 45 μm filter membrane and the filtrate was separated on a Phe nomenex Luna C18 column with isocratic elution at a flow rate of 0 3 ml / min. A binary mobile phase was 0 05% ( v / v) formic acid ( solvent A) methanol / acetonitrile (15 25, v / v, solvent B). The electrospray ionization ( ESI) source in positive ion mode or negative ion mode was used to scan MS 1 -MS 3 spectra for the 24 sedative hypnotics. The MS 2 and MS 3 spectra were used for qualitative analysis of samples. The calibration graphs were linear in their concentra tion ranges with the correlation coefficients ( r 2 ) more than 0 999. The limits of detection (LODs) were 4 0-446 6 μg / L. The recoveries for all the drugs in the improving sleep health foods were 88 6% - 110 3% with the relative standard deviations no more than 9 8% at three spiked levels. Twenty seven batches of the improving sleep health foods were tested. Melatonin was found in eighteen batches. The method is fast, specific, sensitive, easy and suitable for fast screening of 24 sedative hypnotics illegally added in improving sleep health foods. Key words: high performance liquid chromatography ion trap mass spectrometry ( HPLC IT MS); sedative hypnotics; health foods; fast screening 通 讯 联 系 人.Tel:(025)86630712,E mail:flyluli@ 126.com. 基 金 项 目 : 中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院 项 目 (2012BAK08B02). 收 稿 日 期 :2014 11 03

第 3 期 芦 丽, 等 : 高 效 液 相 色 谱 离 子 阱 质 谱 法 快 速 筛 查 改 善 睡 眠 类 保 健 257 随 着 现 代 生 活 节 奏 的 加 快 生 活 压 力 的 增 大, 越 来 越 多 的 人 受 到 失 眠 症 的 困 扰 [1] 镇 静 催 眠 药 是 一 类 通 过 抑 制 中 枢 神 经 系 统 而 缓 解 过 度 兴 奋 和 引 起 近 似 生 理 睡 眠 的 药 物, 对 中 枢 神 经 系 统 的 抑 制 作 用 随 着 剂 量 增 加 而 加 深, 使 用 镇 静 催 眠 药 更 易 发 生 不 良 反 应, 这 类 药 物 具 有 潜 在 的 依 赖 性, 长 期 使 用 可 产 生 耐 受 性, 以 及 身 体 和 心 理 依 赖 性 [2] 目 前 中 国 国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 局 批 准 上 市 的 宣 称 具 有 改 善 睡 眠 作 用 的 保 健 食 品 中, 大 部 分 产 品 以 褪 黑 素 为 原 料, 还 有 一 部 分 产 品 的 原 料 是 具 有 安 神 作 用 的 中 药 材, 如 刺 五 加 酸 枣 仁 柏 子 仁 远 志 天 麻 合 欢 皮 夜 交 藤 珍 珠 等 [3] 相 比 西 药, 保 健 食 品 的 副 作 用 相 对 较 小, 但 是 起 效 缓 慢 个 体 差 异 较 大 某 些 生 产 厂 家 为 了 谋 取 利 益, 利 用 保 健 品 成 分 复 杂 质 量 标 准 不 完 善 等 监 管 漏 洞, 在 保 健 食 品 中 非 法 添 加 镇 静 催 眠 化 学 药 品 以 提 高 其 产 品 的 疗 效, 欺 骗 消 费 者 建 立 保 健 食 品 中 非 法 添 加 镇 静 催 眠 药 品 的 快 速 检 测 方 法 对 防 止 和 打 击 此 类 不 法 行 为 保 障 人 民 健 康 具 有 极 为 重 要 的 意 义 目 前 对 这 类 药 物 的 分 析 检 测 方 法 主 要 有 气 相 色 谱 质 谱 法 ( GC MS ) [4,5] 高 效 液 相 色 谱 法 (HPLC) [6] 高 效 液 相 色 谱 质 谱 法 (HPLC MS) [7-12] 等 在 各 类 基 质 中 这 类 药 品 的 检 测 均 有 报 道, 包 括 血 液 [4,8,12] 尿 液 [8] 饲 料 [7] 食 品 [10] [11] 中 成 药 及 [5,6,9,11] 保 健 食 品 等, 其 中 已 报 道 的 保 健 食 品 中 非 法 添 加 镇 静 催 眠 药 品 局 限 在 苯 二 氮 卓 类 巴 比 妥 类 等 精 神 药 品 的 检 测 研 究 方 面, 未 涉 及 一 些 生 物 源 性 和 植 物 源 性 成 分 ; 且 这 些 研 究 多 采 用 三 重 四 极 杆 质 谱 建 立 的 定 量 分 析 方 法, 对 目 标 化 合 物 的 定 性 分 析 和 质 谱 裂 解 规 律 并 无 涉 及, 不 利 于 定 性 判 定 是 否 非 法 添 加 [5,6,9], 已 不 能 满 足 市 场 监 管 要 求 随 着 医 药 行 业 的 发 展, 更 多 的 化 学 药 物 用 于 失 眠 症 的 治 疗, 生 产 企 业 也 会 选 择 添 加 尚 未 被 监 测 的 更 加 复 杂 的 生 物 源 性 植 物 源 性 活 性 成 分 建 立 专 属 性 强 灵 敏 度 高 快 速 准 确, 能 同 时 检 测 几 十 种 镇 静 催 眠 药 品 的 分 析 方 法 势 在 必 行 本 研 究 收 集 了 临 床 上 具 有 镇 定 催 眠 效 果 的 24 种 药 物, 建 立 了 可 以 对 其 同 时 检 测 和 确 证 的 高 效 液 相 色 谱 离 子 阱 质 谱 (HPLC IT MS) 快 速 筛 查 方 法, 并 对 其 质 谱 裂 解 规 律 进 行 了 探 讨, 为 保 健 食 品 中 非 法 添 加 化 学 药 品 的 监 管 提 供 了 有 力 的 工 具 1 实 验 部 分 1.1 仪 器 试 剂 与 材 料 Agilent 1100 高 效 液 相 色 谱 仪,MSD Trap 离 子 阱 质 谱 仪, 配 电 喷 雾 离 子 ( ESI) 源 ( 美 国 Agilent 公 司 ); KH 250DB 型 数 控 超 声 波 清 洗 器 ( 昆 山 禾 创 超 声 仪 器 公 司 生 产 ); Centrifuge 5424 R 型 离 心 机 ( 德 国 Eppendorf 公 司 ); 甲 醇 乙 腈 和 甲 酸 均 为 色 谱 纯 ( 美 国 Sigma 公 司 ); 实 验 用 水 为 Milli Q 纯 水 系 统 ( 美 国 Millipore 公 司 ) 制 备 ;XP6 型 微 量 电 子 天 平 ( 瑞 士 Mettler Toledo 公 司 ) 宣 称 具 有 改 善 睡 眠 功 能 的 保 健 食 品 样 品 来 自 于 2014 国 家 保 健 食 品 安 全 风 险 监 测 抽 样 24 种 镇 静 催 眠 药 对 照 品 : 马 来 酸 咪 达 唑 仑 ( 批 号 171250 201002, 纯 度 99 9%) 艾 司 唑 仑 ( 批 号 171219 201003, 纯 度 99 7%) 阿 普 唑 仑 ( 批 号 171218 201104, 纯 度 99 1%) 三 唑 仑 ( 批 号 171230 201203, 纯 度 99 6%) 氯 氮 卓 ( 批 号 171248 200702, 纯 度 99 7%) 硝 西 泮 ( 批 号 171217 200402, 纯 度 100 0%) 奥 沙 西 泮 ( 批 号 171229 201104, 纯 度 100 0%) 地 西 泮 ( 批 号 171225 201304, 纯 度 99 9%) 劳 拉 西 泮 ( 批 号 171253 201102, 纯 度 99 2%) 酒 石 酸 唑 吡 坦 ( 批 号 171258 200601, 纯 度 100 0%) 氯 硝 西 泮 ( 批 号 171227 201103, 纯 度 100 0%) 巴 比 妥 ( 批 号 171220 200602, 纯 度 100 0%) 苯 巴 比 妥 ( 批 号 171222 200605, 纯 度 100 0%) 异 戊 巴 比 妥 ( 批 号 171221 201203, 纯 度 99 9%) 司 可 巴 比 妥 ( 批 号 9201, 纯 度 100%, 国 家 麻 醉 品 实 验 室 ) 戊 巴 比 妥 ( 批 号 20140221, 纯 度 98%, 美 国 SIGMA 公 司 ) 氯 美 扎 酮 ( 批 号 GL01 KQFT, 纯 度 98 0%, 日 本 TCI 公 司 ) 褪 黑 素 ( 批 号 80717, 纯 度 99 50%, 德 国 Dr. Ehren storfer 公 司 ) 佐 匹 克 隆 ( 批 号 100870 200801, 纯 度 99 9%) 马 来 酸 氯 苯 那 敏 ( 批 号 100047 200606, 纯 度 99 7%) 扎 来 普 隆 ( 批 号 100670 200401, 纯 度 100 0%) 盐 酸 文 拉 法 辛 ( 批 号 100543 200401, 纯 度 100 0%) 青 藤 碱 ( 批 号 110774 200507, 纯 度 100 0%) 罗 通 定 ( 批 号 100452 200301, 纯 度 100 0%) 未 标 明 来 源 的 对 照 品 均 来 自 中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院 1.2 实 验 条 件 色 谱 条 件 : 色 谱 柱 为 Phenomenex Luna C18 柱 (150 mm 2 0 mm, 3 μm); 流 动 相 A 为 0 05% (v / v) 甲 酸 水 溶 液, 流 动 相 B 为 甲 醇 乙 腈 (15 25, v / v) 溶 液, 流 动 相 A 与 流 动 相 B 按 体 积 比 60 40 等 度 洗 脱 25 min; 流 速 :0 3 ml / min; 柱 温 :40 ; 进 样 体 积 :10 μl 质 谱 条 件 : 电 喷 雾 电 离 正 离 子 模 式 ( ESI + ) 和 负 离 子 模 式 (ESI - ) 切 换 ; 雾 化 器 压 力 :2 62 10 5 Pa; 干

258 色 谱 第 33 卷 燥 气 流 速 :10 L / min; 干 燥 气 温 度 :350 ; 裂 解 电 压 :1 20 V; 扫 描 MS 1 ~ MS 3 三 级 质 谱 典 型 对 照 品 ( 佐 匹 克 隆 ) 标 准 溶 液 的 MS 1 ~ MS 3 谱 图 见 图 1, 24 种 镇 静 催 眠 药 品 的 定 性 特 征 离 子 见 表 1 No. Drug Scan mode Table 1 Retention time / min 图 1 佐 匹 克 隆 对 照 品 标 准 溶 液 的 MS 1 ~ MS 3 谱 图 Fig. 1 MS 1 -MS 3 spectra of zopiclone standard 表 1 24 种 镇 静 催 眠 药 品 的 定 性 特 征 离 子 Qualitative characteristic ions of the 24 sedative hypnotics Ion in MS 1 (m / z) Ion in MS 2 (m / z) Ion in MS 3 (m / z) 1 midazolam + 2.1 326.1 ([M+H] + ) 306.2 / 291.1 / 244.0 273.2 2 estazolam + 9.4 295.1 ([M+H] + ) 267.0 / 241.0 / 191.9 239.9 / 205.0 3 alprazolam + 11.8 309.1 ([M+H] + ) 281.0 / 205.7 245.0 / 204.9 4 triazolam + 12.4 343.1 ([M+H] + ) 308.1 / 279.2 253.1 5 chlordiazepoxide + 2.3 300.0 ([M+H] + ) 283.0 / 241.0 255.0 / 241.0 / 227.0 6 nitrazepam + 8.1 282.1 ([M+H] + ) 235.9 207.1 / 180.0 7 oxazepam + 9.7 287.0 ([M+H] + ) 269.0 / 241.0 241.0 8 diazepam + 20.7 285.1 ([M+H] + ) 257.1 / 222.0 / 193.0 / 182.0 / 154.0 / 105.0 113.0 9 lorazepam + 10.6 321.0 ([M+H] + ) 303.0 / 275.0 275.0 10 zolpidem + 1.4 308.2 ([M+H] + ) 235.1 220.0 263.2 243.2 / 235.2 1.9 308.2 ([M+H] + ) 235.0 220.1 263.1 235.1 11 clonazepam - 9.4 314.3 ([M-H] - ) 277.8 / 247.7 277.9 / 231.8 12 barbital - 2.6 183.2 ([M-H] - ) 139.8 96.1 13 phenobarbital - 4.0 231.0 ([M-H] - ) 187.9 184.7 14 amobarbital - 7.8 225.1 ([M-H] - ) 181.9 / 137.9 / 85.0 138.1 15 secobarbital - 9.8 237.2 ([M-H] - ) 193.8 191.8 16 pentobarbital - 7.5 225.1 ([M-H] - ) 181.9 / 138.1 / 85.0 178.7 17 chlormezanone - 4.9 272.3 ([M-H] - ) 207.8 / 179.7 / 152.6 179.8 / 151.8 + 4.8 274.0 ([M+H] + ) 154.0 / 134.0 124.9 18 melatonin + 2.9 233.1 ([M+H] + ) 216.0 / 191.1 / 174.0 159.1 465.2 ([2M+H] + ) 233.0 / 216.1 / 174.0 / 159.0 216.1 / 191.0 / 174.0 19 zopiclone + 1.2 389.1 ([M+H] + ) 345.2 / 262.9 / 247.0 / 245.0 262.9 / 247.0 / 245.0 / 217.1

第 3 期 芦 丽, 等 : 高 效 液 相 色 谱 离 子 阱 质 谱 法 快 速 筛 查 改 善 睡 眠 类 保 健 259 No. Drug Scan mode Retention time / min 表 1 ( 续 ) Table 1 ( Continued) Ion in MS 1 (m / z) Ion in MS 2 (m / z) Ion in MS 3 (m / z) 20 chlorphenamine + 1.4 275.1 ([M+H] + ) 230.1 202.9 / 167.0 / 118.1 1.8 275.1 ([M+H] + ) 230.0 201.8 / 180.3 / 166.9 21 zaleplon + 6.3 306.1 ([M+H] + ) 264.1 / 236.0 / 144.1 259.1 / 236.0 22 venlafaxine + 1.3 278.1 ([M+H] + ) 260.2 / 215.0 / 147.1 / 121.1 215.1 / 147.0 / 121.0 1.7 278.2 ([M+H] + ) 260.1 / 147.2 215.1 / 147.2 / 121.0 23 sinomenine + 1.2 330.2 ([M+H] + ) 255.1 / 213.1 / 181.1 223.1 24 rotundine + 1.3 356.2 ([M+H] + ) 192.0 / 165.0 176.9 / 150.0 Precursor ion of MS 3. 1.3 标 准 溶 液 的 配 制 精 密 称 取 适 量 的 上 述 24 种 药 品 对 照 品, 以 甲 醇 为 溶 剂, 分 别 制 备 成 质 量 浓 度 为 1 g / L 的 单 标 准 对 照 品 储 备 液, 于 -20 冰 箱 中 保 存 分 别 精 密 量 取 上 述 24 种 单 标 准 对 照 品 储 备 液 适 量, 置 于 50 ml 容 量 瓶 中, 加 甲 醇 定 容 至 刻 度, 制 备 成 含 马 来 酸 咪 达 唑 仑 艾 司 唑 仑 阿 普 唑 仑 三 唑 仑 氯 氮 卓 硝 西 泮 奥 沙 西 泮 地 西 泮 酒 石 酸 唑 吡 坦 均 为 2 mg / L, 劳 拉 西 泮 20 mg / L 的 混 合 对 照 品 储 备 液 A; 含 氯 硝 西 泮 10 mg / L, 巴 比 妥 苯 巴 比 妥 司 可 巴 比 妥 100 mg / L, 异 戊 巴 比 妥 130 mg / L 的 混 合 储 备 液 B; 只 含 戊 巴 比 妥 100 mg / L 的 对 照 品 储 备 液 C; 含 褪 黑 素 12 mg / L, 佐 匹 克 隆 46 mg / L, 马 来 酸 氯 苯 那 敏 14 mg / L, 扎 来 普 隆 84 mg / L, 盐 酸 文 拉 法 辛 和 罗 通 定 3 mg / L, 青 藤 碱 5 mg / L, 氯 美 扎 酮 179 mg / L 的 混 合 对 照 品 储 备 液 D 以 不 含 目 标 化 合 物 的 胶 囊 和 口 服 液 样 品 为 空 白 基 质, 分 别 精 密 量 取 上 述 混 合 对 照 品 储 备 液 A 1 0 ml 至 5 10 15 20 25 50 ml 量 瓶 中, 用 甲 醇 定 容 至 刻 度, 制 备 成 含 马 来 酸 咪 达 唑 仑 艾 司 唑 仑 阿 普 唑 仑 三 唑 仑 氯 氮 卓 硝 西 泮 奥 沙 西 泮 地 西 泮 酒 石 酸 唑 吡 坦 质 量 浓 度 范 围 为 0 04 ~ 0 4 mg / L, 劳 拉 西 泮 浓 度 范 围 为 0 4 ~ 4 4 mg / L 的 基 质 系 列 对 照 品 溶 液 以 不 含 目 标 化 合 物 的 胶 囊 和 口 服 液 样 品 为 空 白 基 质, 分 别 精 密 量 取 上 述 混 合 对 照 品 储 备 液 B 1 0 ml 至 10 20 50 100 200 ml 量 瓶 中, 用 甲 醇 定 容 至 刻 度, 制 备 成 含 氯 硝 西 泮 质 量 浓 度 范 围 为 0 05 ~ 1 mg / L, 巴 比 妥 苯 巴 比 妥 司 可 巴 比 妥 质 量 浓 度 范 围 为 0 5 ~ 10 mg / L, 异 戊 巴 比 妥 质 量 浓 度 范 围 为 0 6 ~ 13 mg / L 的 基 质 系 列 对 照 品 溶 液 戊 巴 比 妥 对 照 品 储 备 液 C 同 法 配 制, 制 备 成 含 戊 巴 比 妥 0 5 ~ 10 mg / L 的 基 质 系 列 对 照 品 溶 液 以 不 含 目 标 化 合 物 的 胶 囊 和 口 服 液 样 品 为 空 白 1.8 356.2 ([M+H] + ) 192.0 / 165.0 177.0 / 150.0 基 质, 分 别 精 密 量 取 上 述 混 合 对 照 品 储 备 液 D 0 5 1 0 2 5 5 0 10 0 20 0 ml 至 20 ml 量 瓶 中, 用 甲 醇 定 容 至 刻 度, 制 备 成 含 褪 黑 素 质 量 浓 度 范 围 为 0 3 ~ 12 mg / L, 佐 匹 克 隆 质 量 浓 度 范 围 为 1 ~ 46 mg / L, 马 来 酸 氯 苯 那 敏 质 量 浓 度 范 围 为 0 3 ~ 14 mg / L, 扎 来 普 隆 质 量 浓 度 范 围 为 2 ~ 84 mg / L, 盐 酸 文 拉 法 辛 和 罗 通 定 质 量 浓 度 范 围 为 0 06 ~ 3 mg / L, 青 藤 碱 质 量 浓 度 范 围 为 0 1 ~ 5 mg / L, 氯 美 扎 酮 质 量 浓 度 范 围 为 4 ~ 179 mg / L 的 基 质 系 列 对 照 品 溶 液 1.4 样 品 处 理 取 供 试 品 ( 软 胶 囊 硬 胶 囊 片 剂 口 服 液 ), 准 确 称 量 ( 固 体 制 剂 取 一 次 口 服 剂 量, 液 体 制 剂 精 密 量 取 15 0 ml), 置 于 50 ml 容 量 瓶 中, 加 甲 醇 约 40 ml, 超 声 提 取 20 min, 放 至 室 温, 加 甲 醇 定 容 至 刻 度, 摇 匀, 经 0 45 μm 滤 膜 过 滤, 滤 液 用 甲 醇 水 (1 1, v / v) 溶 液 稀 释 3 倍 后 进 行 HPLC IT MS 测 定 2 结 果 与 讨 论 2.1 实 验 条 件 的 考 察 2.1.1 HPLC IT MS 条 件 的 优 化 首 先 利 用 流 动 注 射 的 方 式 对 24 种 待 测 化 合 物 的 裂 解 电 压 进 行 了 优 化, 设 定 裂 解 电 压 的 30% 至 200% 作 为 梯 升 裂 解 电 压, 此 处 设 定 的 裂 解 电 压 为 1 0 V, 梯 升 电 压 0 3 V 升 至 2 0 V, 从 单 独 的 母 离 子 产 生 MS 2 谱, 重 复 此 过 程, 由 MS 2 中 分 离 得 到 的 母 离 子 ( 基 峰 离 子 ) 裂 解 生 成 MS 3 谱 为 了 使 多 数 待 测 化 合 物 获 得 良 好 的 离 子 化 效 率, 及 产 生 子 离 子 的 技 术 可 重 现, 选 择 裂 解 电 压 为 1 2 V 为 了 获 得 良 好 的 分 离 效 果 和 离 子 化 效 率, 本 实 验 对 流 动 相 进 行 了 优 化 分 别 比 较 了 甲 醇 和 乙 腈 作 为 有 机 相, 水 乙 酸 和 甲 酸 作 为 水 相 的 分 离 效 果 结 果 将 甲 醇 和 乙 腈 按 15 25 的 体 积 比 混 合 作 为 有 机 相 的 分 离 效 果 最 好 水 相 中 加 入 甲 酸, 多 个 化 合 物 的

260 色 谱 第 33 卷 拖 尾 峰 形 得 到 明 显 的 改 善, 响 应 值 增 大 ; 甲 酸 浓 度 过 高, 响 应 降 低 最 终 将 流 动 相 确 定 为 甲 醇 乙 腈 (15 25, v / v) 作 有 机 相,0 05% ( v / v) 甲 酸 水 溶 液 作 水 相, 等 度 洗 脱 分 离 2.1.2 提 取 溶 剂 的 选 择 本 实 验 中 24 种 目 标 化 合 物 于 甲 醇 中 均 有 较 好 的 溶 解 度, 故 选 择 不 同 浓 度 的 甲 醇 水 溶 液 作 提 取 溶 剂, 比 较 其 提 取 效 果 结 果 表 明 : 甲 醇 浓 度 越 高 对 目 标 化 合 物 的 提 取 效 率 越 高, 对 于 大 多 数 保 健 品, 以 100% 甲 醇 提 取 后, 滤 液 比 较 洁 净, 无 需 进 一 步 净 化, 简 化 了 样 品 前 处 理 过 程, 最 终 确 定 以 甲 醇 为 提 取 液, 为 了 提 高 离 子 化 效 率, 滤 液 再 用 甲 醇 水 (1 1, v / v) 溶 液 稀 释 2.2 方 法 学 考 察 2.2.1 标 准 曲 线 将 上 述 1 3 节 中 含 基 质 的 系 列 对 照 品 溶 液 经 0 45 μm 滤 膜 过 滤, 滤 液 按 1 2 节 条 件 测 定, 以 其 质 量 浓 度 为 横 坐 标, 对 MS 1 谱 中 提 取 母 离 子 色 谱 (EIC) 峰 峰 面 积 作 线 性 回 归 结 果 表 明 :24 种 镇 静 催 眠 药 品 在 1 3 节 中 各 自 质 量 浓 度 范 围 内 线 性 关 系 良 好 (r 2 >0 999) 2.2.2 检 出 限 取 系 列 对 照 品 溶 液 质 量 浓 度 最 低 点 溶 液, 用 甲 醇 倍 比 稀 释 后 测 定, 以 信 噪 比 约 为 3 时 对 应 的 各 对 照 品 溶 液 浓 度 为 检 出 限, 各 目 标 药 物 的 检 出 限 结 果 见 表 2 表 2 24 种 镇 静 催 眠 药 品 的 检 出 限 及 其 在 空 白 口 服 液 和 胶 囊 保 健 食 品 中 的 加 标 回 收 率 和 精 密 度 Table 2 Limits of detection ( LODs), recoveries and relative standard deviations ( RSDs) of the 24 sedative hypnotics spiked in blank oral liquid and capsule samples at three spiked levels Drug LOD / (μg / L) Oral liquid Low Middle High Recoveries (RSD) / % (n = 6) Capsule Low Middle High Midazolam 4.2 94.6 (5.9) 106.8 (3.5) 104.4 (6.1) 99.1 (3.9) 102.5 (7.3) 104.6 (5.3) Estazolam 4.1 103.5 (7.3) 104.6 (8.3) 98.9 (3.4) 94.7 (6.3) 97.4 (5.4) 93.5 (4.7) Alprazolam 4.0 94.8 (4.3) 98.7 (4.7) 95.5 (1.2) 106.3 (8.4) 95.9 (3.1) 96.9 (7.4) Triazolam 4.4 105.2 (2.8) 96.8 (3.9) 100.7 (8.6) 101.3 (2.2) 96.8 (2.1) 107.8 (5.7) Chlordiazepoxide 4.0 102.7 (3.5) 93.1 (8.4) 105.0 (4.7) 104.3 (7.4) 102.5 (3.9) 106.8 (3.0) Nitrazepam 4.3 96.2 (6.8) 99.8 (4.8) 94.8 (3.9) 99.7 (5.3) 95.5 (8.4) 99.0 (3.5) Oxazepam 4.1 92.2 (4.8) 100.5 (8.9) 104.6 (7.2) 93.1 (9.0) 98.1 (7.8) 97.4 (5.8) Diazepam 4.1 103.6 (2.7) 98.0 (3.8) 95.2 (3.6) 88.6 (3.2) 108.3 (9.2) 104.5 (4.7) Lorazepam 43.7 98.6 (1.6) 108.4 (8.3) 97.8 (4.8) 98.3 (2.9) 106.4 (5.4) 94.5 (5.8) Zolpidem 4.9 107.0 (6.2) 92.1 (4.5) 107.3 (7.4) 100.2 (7.3) 100.3 (4.2) 94.7 (6.7) Clonazepam 5.1 102.1 (3.9) 101.1 (6.2) 95.1 (3.7) 99.0 (8.3) 96.1 (4.8) 92.5 (1.0) Barbital 50.6 104.6 (8.7) 97.3 (3.5) 96.4 (7.9) 107.9 (3.6) 100.3 (5.8) 99.8 (4.7) Phenobarbital 52.2 108.2 (4.6) 110.3 (7.3) 90.7 (3.6) 109.1 (4.7) 103.2 (7.9) 90.5 (4.6) Amobarbital 65.0 99.5 (7.3) 93.2 (7.9) 103.4 (5.8) 92.6 (4.0) 105.3 (7.8) 95.8 (5.9) Secobarbital 50.3 101.3 (5.6) 95.7 (2.6) 94.8 (4.7) 96.9 (3.1) 96.4 (3.4) 104.8 (4.4) Pentobarbital 50.2 94.7 (2.1) 100.6 (4.0) 94.3 (3.8) 96.7 (6.7) 98.9 (5.0) 102.4 (2.0) Chlormezanone 151.4 (ESI - ) 95.5 (4.9) 103.2 (9.6) 101.1 (3.6) 101.0 (7.1) 93.9 (5.9) 105.9 (4.5) 446.6 (ESI + ) 97.3 (4.7) 92.8 (3.1) 105.8 (5.2) 93.1 (7.4) 101.6 (2.9) 100.6 (3.0) Melatonin 30.5 96.3 (4.7) 96.2 (3.2) 97.5 (9.8) 104.3 (8.3) 107.2 (3.4) 106.9 (5.9) Zopiclone 114.4 105.4 (8.1) 98.1 (3.0) 93.4 (7.5) 94.7 (4.8) 97.5 (5.5) 100.2 (5.5) Chlorphenamine 33.9 101.5 (6.0) 97.1 (1.9) 101.2 (2.8) 90.3 (5.6) 95.8 (4.2) 97.0 (3.1) Zaleplon 119.6 104.3 (3.5) 100.4 (1.0) 106.1 (4.7) 94.7 (5.5) 90.1 (8.9) 102.1 (8.2) Venlafaxine 6.7 90.8 (3.6) 103.8 (4.9) 98.1 (3.2) 98.3 (7.9) 94.7 (3.0) 97.0 (4.1) Sinomenine 13.7 108.5 (2.6) 97.4 (3.8) 97.3 (3.7) 103.7 (7.0) 98.9 (1.9) 96.1 (3.0) Rotundine 6.4 100.5 (3.0) 107.4 (2.7) 93.4 (9.0) 101.0 (3.3) 93.8 (0.8) 98.7 (4.5) 2.2.3 加 标 回 收 率 精 密 度 和 重 现 性 以 不 含 目 标 化 合 物 的 胶 囊 和 口 服 液 样 品 为 空 白 基 质 进 行 加 标 回 收 率 测 定, 低 中 高 3 个 添 加 水 平 分 别 为 各 系 列 对 照 品 溶 液 中 最 低 浓 度 点 的 1 / 2 浓 度 点 系 列 对 照 品 溶 液 中 的 最 低 浓 度 点 系 列 对 照 品 溶 液 中 间 浓 度 点 平 行 测 定 6 次 以 评 价 该 方 法 的 准 确 度, 所 得 到 的 平 均 加 标 回 收 率 和 相 对 标 准 偏 差 (RSD) 见 表 2 为 了 利 用 MS 2 MS 3 谱 定 性 分 析 样 品, 必 须 得 到 重 现 的 子 离 子 谱 图 为 此, 本 实 验 考 察 了 不 同 天 测 定 同 一 浓 度 目 标 化 合 物 的 MS 2 MS 3 谱,MS 2 谱 中 的 基 峰 离 子 完 全 可 以 重 现,MS 3 谱 中 的 子 离 子 至 少 可 以 重 现 一 个, 定 性 结 果 符 合 欧 盟 非 强 制 执 行 法 案 2002 657 EC 质 谱 分 析 方 法 4 分 鉴 定 点 数 要 求 [13] : 低 分 辨 质 谱 至 少 需 要 一 个 母 离 子 (1 分 ) 和 两 个 子 离 子 (1 5 分 ) 定 性

第 3 期 芦 丽, 等 : 高 效 液 相 色 谱 离 子 阱 质 谱 法 快 速 筛 查 改 善 睡 眠 类 保 健 261 2.3 样 品 测 定 分 别 按 1 4 节 的 方 法 处 理 27 批 样 品, 按 1 2 节 的 方 法 测 定 先 扫 描 MS 1 和 MS 2 谱, 如 果 样 品 中 存 在 与 目 标 化 合 物 对 照 品 保 留 时 间 一 致 的 色 谱 峰 与 目 标 化 合 物 对 照 品 相 一 致 的 MS 1 谱 中 的 母 离 子 和 MS 2 谱 中 的 至 少 一 个 子 离 子, 然 后 再 扫 描 其 MS 3 谱 ; 若 出 现 至 少 一 个 与 目 标 化 合 物 对 照 品 的 MS 3 谱 相 一 致 的 子 离 子, 则 判 为 阳 性 样 品, 或 者 存 在 与 目 标 化 合 物 标 准 谱 图 相 一 致 的 MS 1 谱 的 母 离 子 和 MS 2 谱 的 两 个 子 离 子, 也 判 为 阳 性 样 品 样 品 测 定 结 果 : 27 批 宣 称 改 善 睡 眠 类 的 保 健 食 品 中 18 批 样 品 检 出 褪 黑 素, 其 配 方 原 料 中 均 注 明 有 褪 黑 素, 因 此 不 属 于 非 法 添 加 典 型 样 品 的 MS 1 ~ MS 3 谱 图 如 图 2 所 示 Fig. 2 图 2 典 型 样 品 的 MS 1 ~ MS 3 谱 图 MS 1 -MS 3 spectra of a representative sample 2.4 质 谱 数 据 分 析 和 裂 解 规 律 研 究 2.4.1 苯 二 氮 卓 类 药 物 实 验 发 现 苯 二 氮 卓 类 药 物 的 准 分 子 离 子 峰 附 近 常 出 现 m / z 相 差 2, 且 丰 度 比 约 为 3 1( 含 有 Cl 元 素 的 典 型 同 位 素 峰 ) 的 离 子 峰, 且 常 产 生 脱 氯 断 裂 的 碎 片 峰 (m / z 相 差 35 或 者 37) 这 是 由 于 苯 二 氮 卓 类 药 物 多 含 有 Cl 元 素, 可 以 根 据 碎 片 离 子 是 否 还 有 m / z 相 差 2 的 离 子 峰 判 断 碎 片 结 构 中 是 否 还 有 Cl 元 素 苯 二 氮 卓 类 药 物 含 有 1,4 苯 并 二 氮 卓 结 构, 若 二 氮 卓 环 上 有 -NCH 3 的 侧 链, 会 发 生 脱 N 断 裂, 由 七 元 环 变 为 八 元 环, 并 发 生 进 一 步 断 裂, 生 成 稳 定 的 五 元 环 或 者 六 元 环 若 含 有 羰 基 结 构 还 会 发 生 酰 胺 的 相 关 断 裂 对 苯 二 氮 卓 类 药 物 的 质 谱 碎 片 裂 解 途 径 进 行 推 测, 具 体 如 图 3 所 示

262 色 谱 第 33 卷 Fig. 3 图 3 推 测 苯 二 氮 卓 类 药 物 的 质 谱 裂 解 途 径 示 意 图 Tentative scheme fragmentation pathways of benzodiazepines

第 3 期 芦 丽, 等 : 高 效 液 相 色 谱 离 子 阱 质 谱 法 快 速 筛 查 改 善 睡 眠 类 保 健 263 图 3 ( 续 ) Fig. 3 ( Continued) 2.4.2 巴 比 妥 类 药 物 根 据 巴 比 妥 药 物 的 分 子 式 可 知, 巴 比 妥 为 丙 二 酰 脲 衍 生 物 在 电 喷 雾 负 离 子 模 式 下, 该 类 分 子 式 结 构 可 能 发 生 了 [M-H] - [ M-H-CHON] - 断 裂, 裂 解 路 径 如 图 4 所 示 根 据 此 裂 解 规 律, 可 对 实 测 目 标 分 析 物 进 行 确 证 分 析 2.4.3 其 他 镇 静 催 眠 类 药 物 其 他 镇 静 催 眠 类 药 物, 包 括 氯 美 扎 酮 褪 黑 素 佐 匹 克 隆 马 来 酸 氯 苯 那 敏 扎 来 普 隆 盐 酸 文 拉 法 辛 青 藤 碱 罗 通 定, 结 构 中 都 含 有 N 原 子 或 者 酰 胺 结 构, 因 此 会 发 生 相 关 断 裂, 其 质 谱 裂 解 路 径 如 图 5 所 示

264 色 谱 第 33 卷 Fig. 4 图 4 巴 比 妥 类 药 物 的 质 谱 裂 解 途 径 示 意 图 Scheme fragmentation pathways of barbiturates Fig. 5 图 5 其 他 镇 静 催 眠 类 药 物 的 质 谱 裂 解 途 径 示 意 图 Scheme fragmentation pathways of other sedative hypnotics

第 3 期 芦 丽, 等 : 高 效 液 相 色 谱 离 子 阱 质 谱 法 快 速 筛 查 改 善 睡 眠 类 保 健 265 图 5 ( 续 ) Fig. 5 ( Continued) 2.5 讨 论 离 子 阱 质 谱 图 包 含 与 分 子 总 体 结 构 的 较 小 部 分 相 关 的 子 离 子 质 量 信 息, 所 以 离 子 阱 质 谱 具 有 最 高 的 全 扫 描 MS 2 采 集 灵 敏 度, 其 碎 片 离 子 谱 被 认 为 是

266 色 谱 第 33 卷 分 子 的 指 纹 谱 图 ; 另 一 方 面, 离 子 阱 对 于 母 离 子 的 裂 解 选 择 性 更 好,MS 2 谱 中 的 子 离 子 是 直 接 由 母 离 子 产 生 的, 裂 解 后 对 子 离 子 进 一 步 分 离 裂 解 产 生 MS 3 子 离 子, 所 以 离 子 阱 产 生 的 子 离 子 谱 图 比 其 他 仪 器 更 清 楚,MS 3 子 离 子 化 的 步 骤 提 高 了 对 母 离 子 结 构 的 专 属 性, 使 得 离 子 阱 成 为 结 构 解 析 的 独 特 仪 器 因 此, 利 用 MS 2 MS 3 谱 子 离 子 定 性, 灵 敏 度 更 高 专 属 性 更 强, 得 到 更 多 的 化 合 物 裂 解 信 息 和 规 律 根 据 此 裂 解 规 律, 可 对 实 测 目 标 化 合 物 进 行 确 证 分 析 3 结 论 本 文 建 立 了 HPLC IT MS 检 测 保 健 品 食 中 非 法 添 加 24 种 镇 静 催 眠 药 的 快 速 筛 查 方 法, 从 实 际 样 品 的 检 测 结 果 来 看, 本 方 法 专 属 性 强 灵 敏 度 高, 适 用 于 保 健 品 中 非 法 添 加 镇 静 催 眠 药 品 的 定 性 确 证, 为 控 制 保 健 品 质 量 打 击 保 健 食 品 行 业 非 法 添 加 行 为 提 供 了 有 效 的 工 具 参 考 文 献 : [1] Chinese Society of Psychiatry. Thirty to Forty Percent Peo ple Are Insomnia: Cannot Sleep with Anxiety and Cannot Wake up Early with Depression ( 中 国 医 学 会 精 神 病 学 分 会. 全 国 三 至 四 成 的 人 正 在 失 眠 : 睡 不 着 是 焦 虑 醒 得 早 是 抑 郁 ). (2012 12 22 ). http: // www. 21jk. com. cn / cmamh / content. asp? articleid = 79175 [2] Ministry of Health. Guiding Principles for Clinical Applica tion of Psychotropic Drugs ( 卫 生 部. 精 神 药 品 临 床 应 用 指 导 原 则 ). (2007 01 25) [2007 01 25]. http: // www.nhfpc.gov. cn / yzygj / s3577/ 200804 / 0c9e4ea8f5d549da8afd943a7a5d2f88. shtml [3] China Food and Drug Administration. Data Query: Domestic Health Food ( 国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局. 数 据 查 询 : 国 产 保 健 食 品 ). [ 2014 11 01]. http: // app1. sfda. gov. cn / data search / face3 / base. jsp? tableid = 30&tableName = TA BLE30&title = 国 产 保 健 食 品 &bcid = 118103385532690845640177699192 [4] Chang Q, Ma H Y, Wang F J, et al. Chinese Journal of Chromatography ( 常 青, 马 虹 英, 王 方 杰, 等. 色 谱 ), 2011, 29(11): 1082 [5] Wang Z L, Zhang J L, Zhang Y N. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society ( 王 占 良, 张 建 丽, 张 亦 农. 质 谱 学 报 ), 2009, 30(5): 282 [6] Lin F, Li T, Li J, et al. Food Science ( 林 芳, 李 涛, 李 继, 等. 食 品 科 学 ), 2013, 34(22): 218 [7] Wu N P, Ban F G, Peng L, et al. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society ( 吴 宁 鹏, 班 付 国, 彭 丽, 等. 质 谱 学 报 ), 2012, 32(2): 94 [8] Zhang X Y, Cai X X, Zhang X Y. Chinese Journal of Chro matography ( 张 秀 尧, 蔡 欣 欣, 张 晓 艺. 色 谱 ), 2010, 28(1): 23 [9] Zhu L, Ruan L P, Liu H L, et al. Chinese Journal of Chro matography ( 朱 琳, 阮 丽 萍, 刘 华 良, 等. 色 谱 ), 2013, 31 (7): 709 [10] Sun T, Wang L X, Zeng S M, et al. Chinese Journal of Chromatography ( 孙 婷, 王 鹭 骁, 曾 三 妹, 等. 色 谱 ), 2014, 32(7): 302 [11] Yan A H, Li X L, Xi C X, et al. Chinese Journal of Analyti cal Chemistry ( 严 爱 花, 李 贤 良, 郗 存 显, 等. 分 析 化 学 ), 2013, 41(6): 509 [12] Shi Y T, Guo J Q, Wang H J, et al. Chinese Journal of Chromatography ( 石 银 涛, 郭 璟 琦, 王 绘 军, 等. 色 谱 ), 2014, 32(7): 687 [13] Commission Decision 2002 / 657 / EC