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毓邬
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1 第 41 卷 2013 年 2 月分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究报告 Chinese Journal of Analytical Chemistry 第 2 期 253 ~ 257 DOI: / SP. J 液相色谱鄄串联质谱法测定牛奶中 6 种甲状腺拮抗剂残留邱元进 * 林永辉杨方张琼苏芝娇 ( 福建出入境检验检疫局, 福州 ) 摘要建立了牛奶中甲巯咪唑硫脲嘧啶甲基硫氧嘧啶丙基硫氧嘧啶苯基硫氧嘧啶和 2 鄄巯基苯并咪唑 6 种甲状腺拮抗剂残留的液相色谱鄄串联质谱分析方法样品经乙腈沉淀蛋白后, 上清液以衍生剂 4 鄄碘苄溴在 ph = 8.0 下衍生 2 h, 衍生液调节至 ph = 3.0, 以乙酸乙酯提取溶剂挥干后以 20% 甲醇复溶,Oasis HLB 固相萃取小柱净化,4 ml 50% 甲醇鄄乙腈溶液洗脱,Luna C 18 色谱柱分离, 乙腈和 5 mmol/l 乙酸铵溶液 ( 含 0.2% 甲酸 ) 进行梯度洗脱, 电喷雾正离子模式电离 (ESI + ), 多反应监测 (MRM) 模式检测, 内标法定量结果表明 : 牛奶中 6 种目标物在优化条件下分离良好, 响应值高, 峰形尖锐对称, 在 5 ~ 100 mg/kg 范围内呈良好的线性关系, 相关系数 r 2 均大于 0.99; 检出限为 0.14 ~ 0.32 mg/kg, 定量限为 0.48 ~ 1.1 mg/kg;10, 20 和 50 mg/kg 添加水平的平均回收率为 82.8% ~ 113.6%, 相对标准偏差 2.4% ~ 14.3% 关键词液相色谱鄄串联质谱 (LC 鄄 MS/MS); 甲状腺拮抗剂 ; 4 鄄碘苄溴 ; 残留 1 引言 : 甲状腺拮抗剂 ( Thyroid antagonists,tas) 是抑制甲状腺功能类药物的总称, 主要包括甲巯咪唑 (TAP) 硫脲嘧啶 (2 鄄 Thiouracil, TU) 甲基硫氧嘧啶 (MTU) 丙基硫氧嘧啶 (PTU) 苯基硫氧嘧啶 (PhTU) 2 鄄巯基苯并咪唑 (MBI) 等此类药物曾作为饲料添加剂被广泛使用, 其主要作用是通过抑制甲状腺激素分泌, 增大动物的皮下组织肌肉和肠胃对水分的吸收, 达到增重的目的但 TAs 具有致畸和致癌作用 [1], 食用残留此类药物的食品存在巨大的安全风险因此, 欧盟早在 1981 年即禁止此类药物用于动物产品 [2] TAs 类药物极性强, 在反相色谱中保留较弱, 很难与杂质分离 ; 且分子量小, 质谱检测噪音高, 硫脲嘧啶及同系物同时存在多种互变异构体 [3], 以上因素均影响药物提取效率, 并且在色谱分离过程中易形 [4,5] [6 ~ 8] 成肩峰或分裂峰, 干扰检测液相色谱法检测灵敏度过低, 而液相色谱鄄串联质谱法则只在简单基质中干扰较少 GB/T 鄄 2007 [8] 采用液相色谱鄄串联质谱法检测动物源性食品中 6 种 TAs 残留但 TAP, TU, MTU 和 MBI 的测定下限离欧盟要求的 10 mg/kg 相去甚远 [14], 并且提取过程中需加入对人体危害极大的巯基乙醇作为提取助剂由于直接检测 TAs 困难, 研究者通过衍生化反应改善 TAs 检测灵敏度, 目前此类方法主要有气相 [9,10] [11 ~ 色谱法和液相色谱鄄串联质谱法 13] 气相色谱法检测硫脲嘧啶同系物通常需要两次衍生化反应将巯基和羟基封端, 反应需溶剂转换, 费时费力液相色谱鄄串联质谱法仅需反应一次, 灵敏度高, 快速简便本研究利用 TAs 中的硫醇基在弱碱性条件下与 4 鄄碘苄溴 (4 鄄 IBBr) 发生亲核取代反应, 生成硫醚, 建立了牛奶中 6 种 TAs 残留的超高效液相色谱鄄串联质谱检测方法衍生化产物分子构型单一, 稳定性高, 峰形尖锐对称 ; 极性降低, 在色谱中与杂质分离较好 ; 分子量增大, 远离质谱高噪音区, 并且由于卤代衍生物易离子化, 可显著增强目标物的响应值和选择性本方法快速简便专属性强灵敏度高, 为其它动物源性食品中 TAs 类药物检测提供了实用的方法 2 实验部分 2. 1 仪器与试剂 Prominence UFLC 高效液相色谱仪 (Shimadzu 公司 );API 4000 QTRAP 三重四级杆质谱仪, 配电喷 2012 鄄 06 鄄 21 收稿 ;2012 鄄 10 鄄 30 接受本文系国家质检总局科技计划 (No. 2012IK033) 资助 * E 鄄 mail: xmulyh@163.com

2 2 54 分析化学第 41 卷雾离子源 (AB Sciex 公司 );IM3 涡旋振荡器 (IKA 公司 );Oasis HLB 固相萃取小柱 (60 mg/3 ml,waters 公司 );0.22 mm 有机系滤膜 ( 津腾公司 ); 数显恒温水浴锅 HH 鄄 6( 国华电器有限公司 ) 甲巯咪唑 (1 鄄 Methyl 鄄 2 鄄 mercaptoimidazol, tapazole, TAP) 硫脲嘧啶 (2 鄄 Thiouracil, TU) 甲基硫氧嘧啶 (6 鄄 Methyl 鄄 2 鄄 thiouracil, MTU) 和丙基硫氧嘧啶 (6 鄄 Propyl 鄄 2 鄄 thiouracil, PTU), 均购自 Dr. Ehrenstorfer 公司 ; 苯基硫氧嘧啶 (6 鄄 Phenyl 鄄 2 鄄 thiouracil, PhTU) 2 鄄巯基苯并咪唑 (2 鄄 Mercaptobenzimidazole, MBI) 以及内标物 5,6 鄄二甲基鄄 2 鄄硫氧嘧啶 (5,6 鄄 Dimethyl 鄄 2 鄄 thiouracil, DMTU), 均购自 Sigma 公司 ; 所有标准品纯度均逸 95% 4 鄄碘苄溴 (4 鄄 Iodobenzyl bromide, 4 鄄 IBBr, 纯度逸 95%, 梯希爱上海化成有限公司 ); 乙酸铵 ( 优级纯,Acros 公司 ); 乙酸乙酯乙腈甲醇甲酸 ( 色谱纯,Merck 公司 ); 其它试剂均为国产分析纯 ; 实验用水为 Milli 鄄 Q synthesis 系统制备的超纯水 2. 2 标准溶液配制标准储备液配制 : 将 TAP,TU,MTU,PTU,PhTU 和 MBI 用甲醇分别配制成 100 mg/l 的标准储备液分别准确量取 5 ml 上述标准储备液至 100 ml 容量瓶内, 以甲醇定容, 此混合标准工作液浓度为 5 mg/l 将 DMTU 用甲醇溶解, 配制成 100 mg/l 的内标储备液取 1 ml 内标储备液, 甲醇稀释至 100 ml, 即为 1 mg/l 内标工作液 2. 3 样品处理称取 5 g( 精确到 0.01 g) 试样于 50 ml 具塞塑料离心管中, 准确加入 0.1 ml 内标工作液, 涡旋混合 30 s, 加入 5 ml 乙腈, 涡旋混合 30 s 后, 以 4500 r/min 离心 5 min, 移取上清液至另一个具塞离心管中, 加入 20 ml 磷酸盐缓冲溶液 (0.1 mol/l,ph = 8.0), 涡旋混匀, 加入 0.5 ml 4 鄄 IBBr 的甲醇溶液 (5 mg/ml), 置于 40 益水浴中避光振荡衍生 2 h; 取出, 冷却至室温后, 以 37% HCl 调节 ph = 3.0 依 0.1,40 ml 乙酸乙酯分两次提取, 合并有机层,35 益下旋转蒸发除去溶剂, 以 1 ml 甲醇溶解残渣后, 加入 4 ml 水, 待净化用 3 ml 甲醇 3 ml 水活化 HLB 固相萃取小柱, 将上述待净化液上样, 依次用 5 ml 水,5 ml 20% (V / V) 甲醇淋洗并抽干,4 ml 50% (V / V) 甲醇鄄乙腈洗脱, 收集洗脱液,40 益下氮气浓缩至约 0.5 ml, 加水定容至 1.0 ml, 经 0.22 mm 滤膜过滤后, 供液相色谱鄄串联质谱分析 2. 4 实验条件色谱条件 Phenomenex luna C 18 色谱柱 (150 mm 伊 2.0 mm, 3 mm); 流速 :0.3 ml/min; 柱温 : 35 益 ; 进样量 :10 ml; 流动相 :A 相为 0.2% 甲酸鄄 5 mmol/l 乙酸铵溶液,B 相为乙腈梯度洗脱程序 :0 ~ 2 min, 20% B;2 ~ 4 min, 20% ~ 95% B;4 ~ 5 min, 95% B;5 ~ 6 min, 95% ~ 20% B;6 ~ 10 min, 20% B 质谱条件电离模式 : 电喷雾电离正离子模式 ( ESI+); 检测方式 : 多反应监测 ( MRM); 电喷雾电压 ( IS): 5000 V, 气帘气 ( Curtain gas): MPa, 雾化气 ( Gas1): MPa, 辅助气 ( Gas2): MPa, 离子源温度 (TEM): 500 益其它条件见表 1 表 1 6 种 TAs 及 DMTU 保留时间和质谱参数 Table 1 Retention times and mass spectrometric parameters of six thyroid antagonists(tas) and 5,6 鄄 dimethyl 鄄 2 鄄 thiouracil (DMTU) 保留时间 Retention time ( min) 定性离子对 Ion pair (m / z) 去簇电压 Declustering potential (V) 碰撞能量 Collision energy (ev) 甲巯咪唑 1 鄄 Methyl 鄄 2 鄄 mercaptoimidazol, TAP 5.34 硫脲嘧啶 2 鄄 Thiouracil, TU 6.13 甲基硫氧嘧啶 6 鄄 Methyl 鄄 2 鄄 thiouracil, MTU 6.30 乙鄄巯基苯并咪唑 2 鄄 Mercaptobenzimidazole, MBI 6.43 丙基硫氧嘧啶 6 鄄 Propyl 鄄 2 鄄 thiouracil, PTU 6.76 苯基硫氧嘧啶 6 鄄 Phenyl 鄄 2 鄄 thiouracil, PhTU ,6 鄄二甲基鄄 2 鄄硫氧嘧啶 5,6 鄄 Dimethyl 鄄 2 鄄 thiouracil, DMTU >217.0 * 331.1> >217.0 * 345.1> >217.0 * 358.9> >217.0 * 367.0> >217.0 * 387.2> >217.0 * 421.2> >217.0 * 373.0> * : Quantitative ion.

3 第 2 期邱元进等 : 液相色谱鄄串联质谱法测定牛奶中 6 种甲状腺拮抗剂残留结果与讨论 3. 1 样品处理方法优化本研究以正交试验为基础, 对衍生溶液 ph 值提取液 ph 值及洗脱溶剂选择等对实验结果影响较大的因素进行优化, 每个因素选取 4 个变量, 每个变量进行 3 次平行实验, 所得结果以平均值计, 以同种的最大值作为 100%, 计算各个的相对回收率并作图牛奶中含有大量蛋白质, 可能会对目标物提取产生影响本研究将乙腈沉淀蛋白后的上清液和未处理的牛奶分别进行衍生化反应后, 按优化方法实验, 发现牛奶经蛋白沉淀处理后,6 种 TAs 响应值均有提高, 其中 PTU 和 PhTU 响应值提高约 10 倍因此本研究选择乙腈沉淀蛋白后再进行衍生化处理衍生化反应需在弱碱性条件下进行, 分别选取 ph 为 7.5, 8.0, 8.5 和 9.0 的磷酸盐缓冲液进行实验如图 1 所示, 在 ph =8.0 时,6 种相对回收率均大于 % 因此, 选择衍生化反应的最佳 ph 值为 8.0 调节衍生化反应后的待提取溶液 ph 值是一项关键性工作,pH 值过低, 可能将杂质带入待净化溶液中 ; 而 ph 值过高则可能不利于后续提取步骤的进行本研究将待提取液的 ph 值分别调节至 1.0, 2.0, 3.0 和 4.0 进行实验, 如图 2 所示,pH 值变化对 MTU 和 PTU 相对回收率影响较大, 宜选择 ph = 3.0 为最佳平衡值图 1 衍生化反应溶液 ph 值对 TAs 相对回收率的影响 (n =3) Fig. 1 Influences of ph of derivative solution on TAs rel 鄄 ative recoveries (n = 3) 1. TAP;2. TU; 3. MTU; 4. PTU; 5. PhTU; 6. MBI. 图 2 待提取溶液 ph 值对 TAs 相对回收率的影响 (n = 3) Fig. 2 Influences of ph of extracted solution on TAs rela 鄄 tive recoveries(n = 3) 1. TAP; 2. TU; 3. MTU; 4. PTU; 5. PhTU; 6. MBI. 对比了将衍生化后的溶液酸化处理后直接固相萃取柱净化和乙酸乙酯提取后净化发现, 若不以乙酸乙酯提取, 直接固相萃取柱净化, 甲巯咪唑衍生物回收率低于 20% ; 两种处理方式对其它 5 种目标物的回收率几乎无差别待净化液经 Oasis HLB 固相萃取小柱净化后, 需用洗脱溶剂将其洗脱实验表明,5 ml 甲醇很难将极性稍弱的 PTU 衍生物 PTU 鄄 BI 和 PhTU 衍生物 PhTU 鄄 BI 洗脱 ;5 ml 乙腈可完全洗脱 PTU 鄄 BI, 但 PhTU 鄄 BI 仅能洗脱约 85% ; 而 5 ml 50% 甲醇鄄乙腈溶液可将目标物完全洗脱由图 3 可知,1 ml 50% 甲醇鄄乙腈溶液即可将 % 的目标物洗脱,4 ml50% 甲醇鄄乙腈溶液可将目标物完全洗脱 3. 2 线性方程方法灵敏度及精密度称取 5 g 的阴性牛奶, 分别准确加入 100 ml 内标工作液,0, 25, 50, 100, 250 和 500 ml 混合标准工作液, 按 2.3 节和 2.4 节处理后, 即为 0, 5, 10, 20, 50 和 100 mg/kg 的校正标准溶液曲线在选定的实验条件下, 以峰面积 (y) 为纵坐标, 质量浓度 (x, mg/kg) 为横坐标作图结果表明,6 种 TAs 峰面积与浓度在 5 ~ 100 mg/kg 范围均呈良好的线性关系, 相关系数 r 2 >0.99 以信噪比 S / N = 3 作为方法的检出限 (LOD),S / N = 10 作为方法的定量限 (LOQ), 得出牛奶中 6 种 TAs 的 LODs 为 0.14 ~ 0.32 mg/kg,loqs 为 0.48 ~ 1.1 mg/kg( 表 2)

4 表 2 牛奶中 6 种 TAs 测定线性方程相关系数检出限和定量限 Table 2 Linear equations, correlation coefficients, limit of detec 鄄 tions and limit of quantitations of six TAs in milk 线性方程 Linear equation 相关系数 r 2 检出限 LOD 定量限 LOQ TAP y = x TU y = x MTU y = x PTU y = x PhTU y = x MBI y = x y: peak area; x: mass concentration ; linear range: 5 ~ 100 mg/kg. 以阴性牛奶为基质, 在 10, 20 和 50 mg/kg 的添图 3 6 种 TAs 及内标物 DMTU 的洗脱曲线图 Fig. 3 DMTU Elution curves of six TAs and internal standard 加水平下进行添加回收实验, 每个水平平行测定 6 次, 平均回收率在 82.8% ~ 113.6% 之间, 相对标准偏差 (RSD) 在 2.4% ~ 14.3% 之间, 符合残留分析的要求, 结果见表 3 表 3 牛奶中 6 种 TAs 的平均回收率和相对标准偏差 (RSD) Table 3 Average recoveries (R s ) and relative standard deviations (RSDs) of six TAs in milk 2 56 分析化学第 41 卷 TAP TU MTU 加标浓度 Spiked 回收率 Recoveries (% ) RSD (%, n = 6) 图 4 为牛奶中 6 种 TAs 及内标 DMTU 的 MRM 色谱图, 外标均为 10 mg/kg, 内标为 20 mg/kg 3. 3 实际样品分析选取市场上销售的各品牌纯牛奶共计 11 份, 以阴性牛奶分别添加混合标准工作液至各 TAs 浓度分别为 0, 5, 10, 20, 50 和 100 mg/kg, 并将所有牛奶样品加入 20 mg/kg 内标后, 采用本方法进行分析检测, 其中一份检出甲巯咪唑, 一份检出 2 鄄巯基苯并咪唑, 检出值均略低于下限分析结果表明, 本方法快速简便灵敏度高抗干扰强, 满足兽药残留分析的要求, 可作为常规方法对牛奶中甲状腺拮抗剂进行日常批量分析检测 PTU PhTU MBI 加标浓度 Spiked 回收率 Recoveries (% ) RSD (%, n = 6) 图 4 牛奶中添加 6 种 TAs 及 DMTU 的 MRM 色谱图 Fig. 4 MRM chromatograms of milk sample spiked with six TAs and internal standard DMTU References 1 International Agency for Research on Cancer, http: / / monographs. iarc. fr / ENG / Classification / index. php 2 Commission of the European Communities. Offical Journal of the European Communities, 1981, 81 / 602 / EEC 3 Rostkowska H, Szczepaniak K, Nowak M J, Leszczynski J, KuBulat K, Person W B. J. Am. Chem. Soc., 19, 112(6):

5 第 2 期邱元进等 : 液相色谱鄄串联质谱法测定牛奶中 6 种甲状腺拮抗剂残留 Buick R K, Barry C, Traynor I M,McCaughey W J, Elliott C T. J. Chromatogr. B, 1998, 720(1): Chernov 忆 yants M S, Dolinkin A O, Khokhlov E V. J. Anal. Chem., 2009, 64(8): Vanden Bussche J, Vanhaecke L, Deceuninck Y,Verheyden K, Wille K, Bekaert K, Le Bizec B, De Brabander H F. J. Chromatogr. A, 2010, 1217(26): Abuin S, Centrich F, Rubies A,Companyo R, Prat M D. Anal. Chim. Acta, 2008, 617(1): GB / T 鄄 Determination of Residues of Thyreostats in Foodstuffs of Animal Origin HPLC 鄄 MS / MS Method. National Standards of the People 忆 s Republic of China GB / T 鄄动物源性食品中甲状腺拮抗剂残留量检测方法高效液相色谱鄄串联质谱法. 中国国家标准 9 Zou Q H, Liu Y, Xie M X, Han Ji, Zhang L. Anal. Chim. Acta, 2005, 551(1): Zhang L, Liu Y, Xie M X, Qiu Y M. J. Chromatogr. A, 2005, 1074(1): Pinel G, Bichon E, Pouponneau K,Maume D, Andre F, Le Bizec B. J. Chromatogr. A, 2005, 1085(2): Lohmus M, Kallaste K, Le Bizec B. J. Chromatogr. A, 2009, 1216(46): Vanden Bussche J, Kieboom J A L, De Clercq N, Deceuninck Y, Le Bizec B, De Brabander H F, Vanhaecke L. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(10): CRL Guidance Paper (7 December 2007), http: / / www. rivm. nl / bibliotheek / digitaaldepot / crlguidance2007. pdf Determination of Six Thyroid Antagonists Residues in Milk by Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry QIU Yuan 鄄 Jin, LIN Yong 鄄 Hui *, YANG Fang, ZHANG Qiong, SU Zhi 鄄 Jiao (Fujian Entry 鄄 exit Inspection and Quarantine Bureau, Fuzhou , China) Abstract A liquid chromatography 鄄 tandem mass spectrometric method was established for the determination of six thyroid antagonists residues in milk including tapazole, 2 鄄 thiouracil, 6 鄄 methyl 鄄 2 鄄 thiouracil, 6 鄄 propyl 鄄 2 鄄 thiouracil, 6 鄄 phenzyl 鄄 2 鄄 thiouracil and 2 鄄 mercaptobenzimidazole. The supernate of sample was derived with 4 鄄 iodobenzyl bromide (4 鄄 IBBr) at ph 8. 0 for 2 h after protein precipitation by acetonitrile. The solution was then checked to ph = 3. 0 with HCl solution and extracted with ethyl acetate. After solvent evaporation, resi 鄄 due was dissolved with 20% methanol aqueous. Purification was carried out on an Oasis HLB cartridge, 4 ml 50% methanol 鄄 acetonitrile solution was used to elute. Separations of six antagonists and internal standard were performed on a Luna C 18 column with mobile phase containing acetonitrile and 0. 2% ( V / V) formic acid 鄄 5 mmol / L ammonium acetate aqueous solution in a gradient elution mode. The identification and quantification of drugs were carried out by positive electrospray ionization (ESI + ) in multiple reaction monitoring ( MRM) mode, the quantification analyses were performed by internal standard method. Results indicated that chroma 鄄 tographic peaks of 6 thyroid antagonists were sharp, symmetry, and had been separated well with each other. The calibration curves showed good linearity in the range of mg / kg with correlation coefficients R 2 >0. 99 in milk. Limits of detections ( LODs) of six thyroid antagonist were mg / kg, limits of quantities ( LOQs) were mg / kg, respectively. The average recoveries spiked at 10, 20 and 50 mg / kg levels in milk were 82. 8% %, and the relative standard deviations (RSDs) were 2. 4% %. Keywords Liquid chromatography tandem mass spectrometry; Thyroid antagonists; 4 鄄 Iodobenzyl bromide; Residue ( Received 21 June 2012; accepted 30 October 2012)

DOI /j.issn Food Research And Development UPLC-MS/MS 5 0.

DOI /j.issn Food Research And Development UPLC-MS/MS 5 0. 118 217 5 38 1 DOI 1.3969/j.issn.5-6521.217.1.28 Food Research And Development 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1. 731 2. 731 - UPLC-MS/MS 5. 1 mol/l ProElut PXC 5 % - Thermo Hypersil Gold mm 2.1 mm 1.9 μm ESI