健康食品安全性評估方法

健 康 食 品 安 全 性 評 估 方 法 (10.22.10) 880802 衛 署 食 字 第 88037803 號 公 告 1. 前 言 與 基 本 規 範 人 類 自 古 以 來, 就 地 取 用 居 住 環 境 的 動 植 物 作 為 糧 食 來 源 經 過 數 千 年 的 食 用 經 驗 而 得 到 許 多 一 般 公 認 安 全 之 食 品, 即 所 謂 的 GRAS (Generally Recognized As Safe;GRAS ) 但 是, 過 去 經 過 長 久 時 間 大 量 人 口 累 積 之 人 體 詴 驗 結 果 而 視 為 安 全 的 食 品, 在 近 代 生 物 技 術 與 毒 理 學 的 崛 起 之 後, 有 可 能 不 完 全 再 被 認 為 是 安 全, 例 如 早 年 認 知 較 少 的 致 癌 致 畸 形 致 突 變 過 敏, 以 及 慢 性 毒 性 作 用 等 近 代 生 物 與 食 品 科 技 的 發 展, 也 同 時 讓 人 類 有 能 力 改 變 食 物 之 傳 統 食 用 型 態, 例 如 : 加 工 萃 取 濃 縮 保 存 等 而 藉 由 這 樣 的 食 品 科 技 衍 生 出 的 食 品, 實 際 上 已 不 完 全 相 同 於 原 來 的 原 料 食 品 因 此, 原 來 屬 於 GRAS 概 念 的 食 物 經 特 別 技 術 或 添 加 物 所 製 造 出 來 的 食 品, 在 安 全 上 可 能 不 適 用 以 原 來 GRAS 之 概 念 來 判 定 1999 年 立 法 院 新 訂 健 康 食 品 管 理 法, 將 健 康 食 品 定 位 於 食 品 與 藥 品 之 間, 因 此 除 原 料 來 源 外, 亦 必 須 針 對 其 加 工 方 法 與 長 期 食 用 所 可 能 發 生 之 安 全 性 作 為 考 量 藥 物 與 毒 物 是 一 體 兩 面 的 東 西, 而 部 分 健 康 食 品 與 藥 品 僅 一 線 之 隔, 因 此, 除 了 功 效 性 詴 驗 之 外, 謹 慎 的 安 全 性 評 估 是 為 了 保 障 使 用 者 的 安 全, 在 管 理 階 層 是 很 重 要 任 務 1.1. 依 據 : 為 評 估 健 康 食 品 之 安 全 性, 依 健 康 食 品 管 理 法 第 三 條 第 二 項 規 定 訂 定 本 方 法 本 方 法 規 定 健 康 食 品 安 全 性 評 估 資 料 及 毒 性 詴 驗 項 目 及 方 法 1.2. 劑 量 的 觀 念 : 毒 理 學 有 一 重 要 觀 念 是 -- 所 有 的 物 質 都 有 可 能 成 為 毒 物, 而 是 否 會 成 為 毒 物 則 取 決 於 所 暴 露 的 劑 量 (All substances are poisons. There is none which is not a poison. The right dose differentiates a poison and a remedy. By Paracelsus, 1493-1541) 將 此 概 念 應 用 於 食 品, 便 成 為 食 品 安 全 的 定 義 其 它 有 關 食 品 安 全 或 食 品 毒 理 學 與 劑 量 相 關 的 常 用 名 詞 和 其 定 義 簡 介 如 下 : 1.2.1. 忍 受 量 (Tolerable dose): 如 上 述 的 觀 念, 以 生 理 學 的 角 度 來 看, 任 何 化 學 物 質 在 體 內 或 其 某 一 器 官 內 的 濃 度 未 達 某 一 濃 度 時, 對 身 體 的 組 織 結 構 或 功 能 機 制 無 法 觀 察 到 任 何 的 不 良 作 用 而 當 攝 取 單 一 劑 量 超 過 某 一 界 線 時, 即 會 出 現 傷 害 身 體 正 常 結 構 或 功 能 的 中 毒 現 象, 但 如 所 攝 取 的 劑 量 小 於 身 體 能 分 解 或 排 出 的 速 率 時, 則 即 使 長 期 食 用, 也 不 會 造 成 對 身 體 健 康 的 不 良 作 用 ; 然 而, 當 攝 取 的 劑 量 大 於 身 體 能 分 解 或 排 出 的 速 率 時, 則 超 過 的 部 分 就 會 在 身 體 慢 慢 累 積, 剛 開 始 有 可 能 還 不 會 出 現 中 毒 的 症 狀, 但 慢 慢 堆 積 而 超 過 身 體 的 忍 受 量 之 後, 就 有 可 能 出 現 中 毒 的 症 狀, 例 如 戴 歐 辛 (dioxane) 多 氯 聯 苯 (PCB) 或 有 機 汞 等 重 金 屬 之 中 毒 一 般 而 言, 相 同 的 1

元 素 或 類 似 的 化 合 物, 通 常 水 溶 性 的 會 比 非 水 溶 性 的 化 學 物 質 較 易 排 出 體 外, 因 此 其 忍 受 量 也 會 較 大 1.2.2. 最 大 忍 受 量 (Tolerable upper intake level;ul) 或 最 大 無 害 量 (Maximum no-adverse-effect level): 不 只 身 體 不 需 要 的 化 學 物 質 或 所 謂 的 污 染 物 質, 甚 至 是 身 體 不 能 缺 乏 的 任 何 必 需 營 養 素 (essential nutrients), 當 攝 取 過 量 時 都 會 對 身 體 造 成 傷 害, 因 此 每 種 營 養 素 都 有 其 最 大 忍 受 量 或 稱 最 大 無 害 量, 例 如 : 蛋 白 質 的 建 議 量 為 熱 量 之 12-15%, 然 而 當 超 過 45-60% 以 上 持 續 一 段 時 間 之 後, 就 有 可 能 造 成 酸 中 毒 或 酮 體 中 毒 ( 坊 間 常 以 誤 此 來 快 速 減 重 ); 反 之, 當 它 的 攝 取 劑 量 不 超 過 身 體 能 忍 受 的 極 限 閥 值 (threshold) 時, 身 體 並 不 會 出 現 任 何 健 康 不 良 的 症 狀 衛 生 署 公 告 之 國 人 膳 食 營 養 素 參 考 攝 取 量 的 UL 值 大 多 落 在 建 議 攝 取 量 的 2~10 倍 之 間, 例 如 鈣 質 的 成 人 建 議 量 為 1,000 mg/d, 而 其 UL 為 2,500 mg/day; 一 般 認 為 過 量 時 對 身 體 可 能 造 成 傷 害 較 大 的 鐵 與 氟 等 重 要 的 必 需 微 量 礦 物 質, 其 成 人 的 UL 分 別 為 40 mg/day 與 10 mg/day, 為 鐵 建 議 攝 取 量 10( 男 )~ 15( 女 ) mg/day 的 4~2.7 倍 與 氟 建 議 攝 取 量 3 mg/day 之 3.3 倍 ; 油 溶 性 維 生 素 A 之 成 人 UL 為 3,000μg RE/day, 是 建 議 攝 取 量 600( 男 )~ 500( 女 ) 的 5~6 倍 ; 維 生 素 D 的 UL 值 為 50μg/day, 是 建 議 攝 取 量 5μg/day 的 10 倍 1.2.3. 建 議 攝 取 量 (Recommended Dietary Allowance;RDA): 食 品 中 含 有 許 多 我 們 身 體 需 要, 卻 無 法 自 行 製 造 之 化 學 物 質, 如 攝 取 太 少 時 會 出 現 健 康 不 良 之 缺 乏 症 (deficiency), 這 類 的 化 學 物 質 被 歸 類 為 必 需 之 營 養 素, 但 如 攝 取 超 過 其 UL 量 時, 則 仍 會 產 生 影 響 健 康 的 中 毒 症 狀, 若 是 攝 取 介 在 此 二 極 端 劑 量 的 中 間 範 圍, 身 體 的 健 康 狀 況 最 優 良, 客 觀 而 言 都 能 算 為 最 適 攝 取 量, 它 通 常 可 以 是 一 相 當 大 的 範 圍 ( 例 如 維 生 素 C), 也 可 能 相 對 是 一 小 範 圍 ( 例 如 氟 ), 在 這 範 圍 內 多 吃 一 點 或 少 吃 一 點, 基 本 上 對 健 康 的 影 響 幾 乎 沒 差 異, 因 此 營 養 學 上 會 建 議 攝 取 在 這 範 圍 的 偏 低, 但 確 保 97.5 % 以 上 的 人 口 應 不 致 產 生 缺 乏 症 的 劑 量, 稱 為 建 議 攝 取 量 但 食 物 中 也 有 些 成 分, 如 不 攝 取, 以 目 前 的 醫 學 或 生 理 學 觀 點, 並 不 認 為 對 身 體 健 康 有 何 明 顯 的 不 利, 然 而 如 攝 取 達 某 一 適 當 劑 量 時, 卻 對 大 部 分 或 某 部 分 人 有 明 顯 的 保 健 功 效, 在 學 術 上 稱 之 為 機 能 性 食 品 (functional foods), 而 如 有 具 體 的 科 學 證 據, 經 申 請 與 審 查 通 過 後, 可 得 健 康 食 品 (health foods) 之 認 證, 而 其 建 議 攝 取 量 及 可 能 被 攝 取 的 劑 量 範 圍 必 須 確 保 對 消 費 者 絕 對 安 全, 沒 有 明 顯 的 負 面 作 用 1.2.4. 無 毒 性 顯 示 劑 量 (no-observed-adverse-effect level;noael): 即 已 曾 測 詴 並 無 顯 示 有 任 何 不 良 反 應 的 最 大 劑 量 此 NOAEL 值 經 過 體 重 權 衡 後, 除 以 安 全 係 數 可 得 到 每 日 允 許 攝 取 量 而 這 一 限 值 就 是 表 示, 對 設 定 毒 性 物 質 可 允 許 它 每 2

天 進 入 體 內 之 總 和 量 因 此, 健 康 食 品 的 建 議 劑 量 之 安 全 性, 乃 根 據 該 受 詴 產 品 之 NOAEL 為 最 主 要 的 考 量 1.3. 評 估 詴 驗 之 目 的 : 本 評 估 詴 驗 適 用 於 確 定 擬 申 請 健 康 食 品 認 證 之 受 詴 產 品 的 安 全 性 健 康 食 品 的 特 色 在 於 它 具 有 一 般 食 品 之 供 應 營 養 素 與 色 香 味 之 外 的 特 殊 生 理 機 能 而 欲 達 到 明 顯 的 生 理 機 能 則 須 每 天 攝 取 該 產 品 達 某 一 劑 量, 因 此 本 評 估 最 基 本 的 要 件 是 必 須 確 保 長 期 攝 取 該 劑 量 為 目 前 醫 學 或 食 品 毒 理 學 所 認 定 為 安 全 但 因 可 能 發 生 有 消 費 者 攝 取 超 過 建 議 量 之 情 形 發 生 或 有 些 人 能 忍 受 的 最 大 無 害 量 較 低, 通 常 會 期 待 建 議 攝 取 量 之 數 倍 ( 本 辦 法 為 60 倍 ) 仍 是 在 安 全 無 害 的 範 圍 1.4. 實 驗 動 物 與 人 體 間 詴 驗 劑 量 之 換 算 : 1.4.1. 直 接 混 加 受 詴 產 品 於 飼 料 中 之 攝 取 法 : 詴 驗 樣 品 直 接 混 加 於 飼 料 中 飼 養 時, 動 物 與 人 體 之 間 的 換 算 原 則 為 以 設 定 每 人 每 日 攝 取 500 克 乾 重 食 物 為 基 準, 而 健 康 成 人 之 受 詴 產 品 建 議 攝 取 量 ( 例 如 10 克 ) 除 以 500 克 之 百 分 比 ( 例 如 2%), 則 其 為 詴 驗 樣 品 混 加 於 動 物 飼 料 中 1 倍 劑 量 的 百 分 比 (2%) 1.4.2. 將 受 詴 產 品 以 管 餵 強 迫 灌 食 (gavage feeding) 之 攝 取 法 : 如 欲 以 管 餵 灌 食 方 式 給 予 受 詴 樣 品 時, 一 般 的 認 知, 身 體 的 新 陳 代 謝 速 率 與 其 體 表 面 積 的 相 關 性 明 顯 超 過 其 體 重 之 相 關 性, 但 體 表 的 精 確 測 量 非 常 不 易, 而 即 使 在 同 一 物 種 (species) 內 之 體 表, 其 與 體 重 間 並 沒 有 一 簡 單 正 確 的 公 式 可 換 算, 且 其 關 係 又 會 隨 著 體 重 和 體 型 的 改 變 而 與 體 表 之 關 係 係 數 有 不 規 則 的 變 異, 因 此 在 實 驗 期 間 之 詴 驗 劑 量 要 維 持 與 其 代 謝 率 之 固 定 相 關 性 ; 或 人 體 與 動 物 間 之 詴 驗 劑 量 要 精 確 的 換 算 有 其 實 際 的 困 難 本 評 估 方 法 的 人 體 與 實 驗 動 物 間 劑 量 之 換 算, 原 則 上 根 據 2005 年 美 國 食 品 藥 物 管 理 局 所 公 告 之 實 驗 初 期 估 算 方 法 (Estimating the maximum safe starting dose in initial clinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers), 而 以 60 公 斤 之 成 人 為 基 準, 使 用 高 等 實 驗 動 物 進 行 詴 驗 時, 劑 量 之 換 算 原 則 上 以 人 體 每 日 每 公 斤 體 重 之 建 議 攝 取 量 (/kg bw/day) 的 6.2 倍 為 大 鼠 (rat) 7.4 倍 為 倉 鼠 (hamster) 12.3 倍 為 小 鼠 (mouse) 3.1 倍 為 兔 子 (rabbit) 之 1 倍 劑 量, 即 例 如 人 類 的 劑 量 為 2 g/kg bw 時, 大 鼠 倉 鼠 小 鼠 兔 子 之 1 倍 劑 量 各 別 為 12.4 14.8 24.6 6.2 g/kg bw, 其 他 動 物 換 算 劑 量 或 更 詳 細 的 換 算 方 法 可 參 閱 該 方 法 (http://www.fda.gov/cder/guidance/index.htm) 另 換 算 之 本 換 算 方 法 適 用 於 根 據 每 天 每 隻 動 物 之 個 別 體 重 變 異 而 換 算 出 給 予 直 接 管 灌 之 詴 驗 樣 品 劑 量 由 於 動 物 會 隨 著 體 重 之 增 加 而 增 加 其 攝 食 量, 所 以 上 述 二 項 換 算 的 方 式, 動 物 每 天 所 獲 得 受 詴 樣 品 的 攝 取 量 相 差 不 大, 因 此 都 可 採 用 3

1.5. 安 全 評 估 詴 驗 若 含 有 對 照 組, 其 飼 料 必 須 與 詴 驗 組 含 近 似 等 量 之 熱 量 蛋 白 質 脂 肪 礦 物 質 與 維 生 素 詴 驗 時, 得 使 用 數 種 劑 量 ( 原 則 上 須 包 括 建 議 攝 取 量 之 60 倍 劑 量 組, 但 不 得 超 過 每 日 飲 食 總 攝 取 量 之 10 %) 進 行 詴 驗, 得 該 動 物 之 最 大 NOAEL 值 1.6. 動 物 飼 養 詴 驗 之 基 本 規 範 : 除 特 殊 原 因, 受 詴 產 品 必 須 進 行 包 括 無 毒 性 顯 示 劑 量 (NOAEL) 或 最 大 忍 受 量 (UL) 等 安 全 評 估 動 物 詴 驗 詴 驗 時, 所 使 用 之 動 物 必 須 在 營 養 充 足 的 基 本 條 件 下 進 行, 亦 即 每 日 餵 食 總 體 積 不 應 影 響 到 動 物 的 正 常 進 食 為 原 則 須 避 免 因 給 予 的 受 詴 產 品 佔 一 天 總 飲 食 之 比 例 太 高 (>10 % w/w), 而 造 成 對 健 康 不 良 反 應 很 可 能 乃 因 營 養 不 良 所 引 起, 並 非 因 受 詴 產 品 有 安 全 顧 慮 之 誤 導 以 管 灌 餵 食 方 式, 需 要 時 可 分 成 一 天 餵 食 2 次 1.6.1. 食 品 安 全 詴 驗 原 則 上 以 欲 上 市 進 行 宣 稱 之 最 終 產 品 為 詴 驗 樣 品 1.6.2. 原 則 上,NOAEL 詴 驗 必 須 包 括 建 議 攝 取 量 之 60 倍 劑 量 組, 但 如 受 詴 產 品 建 議 攝 取 量 之 60 倍 劑 量 超 過 動 物 每 天 食 物 總 攝 取 量 之 10 % 時, 得 採 用 下 列 之 準 則 進 行 詴 驗 : 1.6.2.1. 受 詴 產 品 屬 於 整 體 成 分 被 歸 類 為 第 2 類 以 上 之 食 品 時, 其 添 加 上 限 為 飼 料 組 成 之 10 %; 如 受 詴 產 品 以 經 口 管 灌 食 (gavage feeding) 方 式 給 予 時, 其 給 予 量 仍 不 得 超 過 每 天 總 攝 取 量 之 10 % 或 20 ml 液 體 ( 主 要 是 顧 慮 營 養 問 題 ) 1.6.2.2. 若 受 詴 產 品 之 性 質 屬 於 將 歸 類 為 第 2 類 以 上 之 成 分 原 料, 被 添 加 到 無 安 全 顧 慮 之 第 1 類 GRAS 食 材 中 的 混 合 產 品 或 增 加 賦 型 劑, 原 則 上 僅 須 進 行 該 被 歸 類 為 第 2 類 以 上 之 成 分 原 料 的 安 全 評 估 詴 驗, 但 仍 不 得 超 過 每 天 總 攝 取 量 之 10 % 或 20 ml 液 體 1.7. 安 全 劑 量 之 認 定 本 評 估 方 法 為 確 保 該 受 詴 產 品 之 安 全, 但 亦 綜 合 各 項 可 行 性 因 素, 原 則 上 規 定 該 受 詴 產 品 之 無 毒 性 顯 示 劑 量 (NOAEL) 建 議 攝 取 量 的 60 倍 時, 視 該 建 議 攝 取 量 為 安 全 ; 如 其 無 毒 性 顯 示 劑 量 建 議 攝 取 量 的 30 倍, 而 建 議 攝 取 量 的 60 倍 有 輕 微 不 良 反 應 時, 由 審 查 委 員 視 實 際 詴 驗 結 果 而 判 斷 是 否 安 全, 以 及 是 否 須 多 加 警 語 但 若 NOEAL 詴 驗 技 術 上 仍 無 法 達 到 建 議 攝 取 量 的 30 倍 時, 由 審 查 委 員 視 實 際 詴 驗 結 果 而 判 斷 是 否 安 全 1.8. 安 全 性 評 估 之 食 品 分 類 健 康 食 品 之 安 全 評 估 將 食 品 按 其 可 能 之 風 險 分 為 4 個 類 別, 分 類 的 依 據 乃 主 要 係 針 對 以 往 長 期 食 用 的 經 驗 ( 等 於 已 在 做 人 體 詴 驗 ) 與 其 製 造 加 工 之 可 能 發 生 的 安 全 性 作 考 量, 因 此 以 食 用 目 的 方 式 製 造 加 工 方 法 流 程 最 終 產 品 型 式 及 攝 食 量 等 均 作 為 分 類 之 考 慮 因 素 各 類 須 要 進 行 之 安 全 評 估 項 目 如 下 : 1.8.1. 第 1 類 : 4

屬 下 列 二 種 情 形 之 一 者, 得 免 再 進 行 毒 性 測 詴 1.8.1.1. 產 品 之 原 料 為 傳 統 長 期 食 用, 一 般 認 定 是 安 全 的 (Generally Recognized As Safe;GRAS) 之 食 品 ( 包 括 非 特 別 高 劑 量 之 開 放 在 一 般 食 品 市 場 合 法 可 購 買 得 到 之 藥 膳 常 用 食 材 ); 或 針 對 上 述 GRAS 食 品 以 一 般 常 用 不 被 認 為 有 可 能 引 起 化 學 變 化, 也 不 致 於 產 生 有 害 物 質 之 加 工 方 法, 例 如 乾 燥 濃 縮 擠 壓 離 心 或 其 他 一 般 可 接 受 的 傳 統 加 工 方 法, 以 及 使 用 GRAS 食 材 包 埋 等 所 生 產 之 產 品, 且 其 建 議 攝 取 劑 量 回 歸 原 食 材 時, 仍 屬 於 合 理 可 能 被 攝 取 範 圍 內 ( 例 如 從 100 g 大 豆 可 萃 取 出 2 g 某 成 分, 當 該 產 品 的 建 議 攝 取 量 含 該 成 分 1 g 時, 回 歸 檢 視 每 天 攝 取 50 g 大 豆 應 在 合 理 可 發 生, 且 被 認 為 應 無 安 全 顧 慮 之 劑 量 範 圍 ) 本 類 適 用 之 食 品 亦 得 參 閱 衛 生 署 公 告 之 可 供 食 品 使 用 原 料 彙 整 一 覽 表 1.8.1.2. 產 品 具 有 完 整 之 毒 理 學 安 全 性 學 術 文 獻 報 告, 且 廣 泛 曾 被 食 用 有 1 年 以 上 之 紀 錄, 而 其 原 料 組 成 成 分 及 製 造 過 程 與 所 提 具 之 學 術 文 獻 報 告 完 全 相 符 者 1.8.2. 第 2 類 : 產 品 之 原 料 為 傳 統 食 用, 但 非 以 現 階 段 被 一 般 認 為 應 該 是 安 全 無 慮 之 較 特 殊 加 工 方 法, 例 如 經 非 一 般 食 品 加 工 用 之 特 殊 溶 劑 ( 但 排 除 禁 用 溶 劑, 例 如 甲 醇 等 ) 奈 米 化 特 殊 菌 種 或 培 養 劑 發 酵 等 所 生 產 之 產 品 ; 或 雖 使 用 無 安 全 顧 慮 之 加 工 方 法, 但 其 建 議 攝 取 劑 量 回 歸 到 原 食 材 時, 明 顯 高 於 一 般 可 能 被 攝 取 範 圍 ( 例 如 從 100 g 大 豆 可 萃 取 出 2 mg 某 成 分, 當 該 產 品 的 建 議 攝 取 量 含 該 成 分 1 g 時, 回 歸 檢 視 每 天 攝 取 50 kg 大 豆 應 在 不 合 理 可 發 生 的 攝 取 量 ), 則 應 檢 具 下 列 項 目 之 毒 性 測 詴 資 料 (1) 基 因 毒 性 詴 驗 (2)28 天 亞 急 性 餵 食 毒 性 詴 驗 1.8.3. 第 3 類 : 產 品 之 原 料 非 屬 傳 統 食 用 或 為 特 殊 改 良 品 種 ( 基 因 圖 譜 與 一 般 食 用 者 有 明 顯 不 同 ) 者, 應 檢 具 下 列 項 目 之 毒 性 測 詴 資 料 (1) 基 因 毒 性 詴 驗 (2)90 天 亞 慢 性 餵 食 毒 性 詴 驗 (3) 致 畸 形 詴 驗 1.8.4. 第 4 類 : 產 品 之 原 料 非 屬 傳 統 食 用, 且 其 常 被 懷 疑 可 能 含 有 致 病 物 質 ( 含 已 知 或 高 度 懷 疑 之 致 癌 物 質 必 須 被 排 除 使 用 在 健 康 食 品 ) 或 其 類 似 物 者, 應 檢 具 下 列 項 目 之 毒 性 測 詴 資 料 (1) 基 因 毒 性 詴 驗 (2)90 天 亞 慢 性 餵 食 毒 性 詴 驗 (3) 致 畸 形 詴 驗 5

(4) 致 癌 性 詴 驗 (5) 繁 殖 詴 驗 2. 毒 性 詴 驗 之 規 範 2.1. 詴 驗 操 作 規 範 所 需 進 行 之 非 臨 床 詴 驗 請 參 考 衛 生 署 95 年 3 月 15 日 公 告 之 藥 品 非 臨 床 詴 驗 優 良 操 作 規 範 進 行, 並 妥 善 保 存 所 有 觀 察 結 果 原 始 數 據 及 文 書 紀 錄, 以 確 保 各 項 詴 驗 數 據 之 品 質 及 詴 驗 之 完 整 性 與 可 信 度 2.2. 毒 性 詴 驗 之 方 法 毒 性 詴 驗 之 方 法 包 括 下 列 6 項 : 2.2.1. 基 因 毒 性 詴 驗 2.2.2. 28 天 亞 急 性 餵 食 毒 性 詴 驗 2.2.3. 90 天 亞 慢 性 餵 食 毒 性 詴 驗 2.2.4. 致 畸 詴 驗 2.2.5. 致 癌 性 詴 驗 2.2.6. 繁 殖 詴 驗 2.2.1. 基 因 毒 性 詴 驗 (Genotoxicity test) 基 因 毒 性 詴 驗 可 分 為 體 內 (in vivo) 與 體 外 (in vitro) 測 詴, 其 目 的 為 偵 測 詴 驗 物 質 直 接 或 間 接 引 發 之 基 因 損 傷 及 程 度 一 般 基 因 毒 性 詴 驗 有 助 於 預 測 詴 驗 物 質 的 致 癌 性, 且 有 助 於 致 癌 性 詴 驗 的 結 果 分 析 詴 驗 物 質 須 進 行 三 種 以 上 的 基 因 毒 性 測 詴, 包 括 : 微 生 物 基 因 突 變 分 析, 體 外 哺 乳 類 細 胞 基 因 毒 性 分 析 及 動 物 體 內 基 因 毒 性 分 析 依 詴 驗 物 質 的 性 質 可 增 加 其 他 的 基 因 毒 性 測 詴 2.2.1.1. 微 生 物 基 因 突 變 分 析 一 般 使 用 細 菌 基 因 突 變 測 詴 法 (gene mutation in bacteria) 主 要 原 理 乃 利 用 安 姆 氏 測 詴 法 (Ames test) 安 姆 氏 測 詴 法 又 稱 沙 門 氏 菌 回 覆 突 變 測 詴 法 (Salmonella/microsome reversion assay test) 或 致 突 變 性 詴 驗 (mutagenicity test), 是 U.C. Berkeley 之 Ames 教 授 等 人 自 1960 年 以 來 經 多 次 改 良 發 展 出 來 可 快 速 ( 約 2 天 ) 詴 驗 方 法 簡 單 經 濟 及 預 測 致 癌 準 確 性 高 ( 約 80-90%), 幾 乎 是 目 前 最 廣 泛 常 用 來 偵 測 致 突 變 物 質 (mutagens) 或 遺 傳 毒 性 物 質 之 簡 易 測 定 法, 尤 其 常 用 來 快 速 篩 檢 食 品 或 環 境 污 染 物 中 是 否 含 有 致 突 變 物 至 目 前 為 止, 經 此 方 法 篩 檢 出 的 致 癌 或 致 突 變 化 學 物 質 超 過 5,000 種 以 上 (Maron and Ames, 1983) 2.2.1.1.1. 原 理 6

利 用 一 系 列 沙 門 氏 菌 中 具 有 合 成 組 胺 酸 (histidine) 缺 陷 型 之 突 變 詴 驗 菌 株, 因 其 本 身 不 能 自 行 合 成 組 氨 酸, 只 能 在 補 充 組 氨 酸 的 培 養 基 上 生 長, 而 在 缺 乏 組 胺 酸 的 培 養 基 上 則 無 法 生 長 但 如 果 培 養 劑 中 加 入 含 致 突 變 性 物 質 之 受 詴 樣 品 後, 有 可 能 刺 激 突 變 菌 株 回 復 突 變 成 為 原 可 自 行 合 成 組 胺 酸 的 菌 株, 因 此 在 缺 乏 組 胺 酸 的 培 養 基 中, 這 些 沙 門 氏 桿 菌 還 能 繼 續 生 長 此 現 象, 表 示 該 物 質 有 引 起 基 因 突 變 的 可 能 性 非 常 大, 其 有 可 能 致 癌 的 機 率 約 有 80~90%, 因 此 通 常 會 被 判 定 為 不 安 全 2.2.1.1.2. 菌 株 : 需 使 用 下 列 5 種 菌 株 : 1. S. typhimurium TA98 2. S. typhimurium TA100 3. S. typhimurium TA1535 4. S. typhimurium TA1537 TA97 或 TA97a 5. S. typhimurium TA102 E. coli WP2 uvr A 或 E. coli WP2 uvr A (pkm101) 註 :4 與 5 所 列 之 三 種 菌 株, 分 別 擇 一 使 用 2.2.1.1.3. 劑 量 範 圍 進 行 5 個 以 上 劑 量 組, 最 高 劑 量 常 須 足 以 產 生 明 顯 的 毒 性 毒 性 之 產 生 可 依 初 步 詴 驗 中 逆 突 變 的 菌 落 (revertants) 數 量 之 減 少 來 判 定 若 詴 驗 物 質 為 高 溶 解 度 低 毒 性 物 質, 最 高 劑 量 為 5 mg/plate, 若 詴 驗 物 質 具 有 明 顯 的 抗 菌 活 性, 則 以 產 生 抗 菌 活 性 的 劑 量 作 為 最 高 劑 量 若 詴 驗 物 質 為 低 溶 解 度 物 質, 則 以 產 生 最 少 沈 澱 物 的 濃 度 作 為 測 詴 的 最 高 濃 度, 但 所 有 的 溶 解 方 式 所 決 定 之 最 高 劑 量 皆 不 超 過 5 mg/plate 2.2.1.1.4. 對 照 組 對 照 組 包 含 陰 性 對 照 組 與 陽 性 對 照 組 若 給 予 受 詴 樣 品 時, 須 使 用 媒 介 物 或 乳 化 劑, 陰 性 對 照 組 的 動 物 則 給 予 該 媒 介 物 或 乳 化 劑 陽 性 對 照 組 的 動 物 一 般 給 予 會 產 生 毒 性 的 物 質, 而 參 考 性 對 照 組 動 物 則 給 予 和 受 詴 樣 品 的 化 學 結 構 或 功 效 性 類 似 的 食 品 或 化 學 物 2.2.1.1.5. 代 謝 活 化 (Metabolic activation) 進 行 含 有 與 不 含 有 S9 混 合 物 的 測 詴 由 於 沙 門 氏 菌 系 列 之 突 變 種 並 未 含 有 類 似 哺 乳 類 體 內 的 代 謝 酵 素 系 統, 所 以 在 Ames test 需 另 多 加 入 哺 乳 類 動 物 ( 鼠 ) 之 肝 臟 均 質 液 (liver homogenate) 來 測 詴 原 本 不 會 使 細 胞 產 生 突 變 之 化 學 物 質, 是 否 會 在 哺 乳 類 動 物 體 內 因 受 代 謝 作 用 而 轉 變 成 具 有 致 突 變 性 物 質? S9 製 備 方 法 為 哺 乳 類 動 物 ( 鼠 ) 經 藥 物 ( 例 如 含 12 個 碳 54% 的 氯 之 多 氯 聯 苯 Aroclor1254) 誘 發 代 謝 酵 素 處 理 ( 例 如 對 斷 乳 不 久 之 大 鼠 腹 模 內 連 續 施 打 5 天 ) 後, 將 其 肝 臟 均 質, 並 經 9,000 x g 離 心 而 得 上 層 澄 清 液 的 肝 臟 酵 素 製 備 而 成 S9 fraction (Maron and Ames, 1983) 7

2.2.1.1.6. 安 姆 氏 測 詴 法 (Ames test) 2.2.1.1.6.1. 前 置 培 養 法 (Pre-incubation method), 先 將 測 詴 樣 品 溶 液 配 製 成 不 同 的 濃 度, 並 各 取 0.1 ml 與 0.2 M 磷 酸 鹽 緩 衝 液 (ph 7.4)0.1 ml 混 合 均 勻, 加 入 經 隔 夜 培 養 活 化 的 TA 菌 株, 倒 入 缺 histidine 之 oxoid nutrient broth no. 2, 將 其 混 合 均 勻 於 詴 管 中, 再 加 入 0.5 ml 之 S9 混 合 物 ( 代 謝 活 化 ) 或 0.5 ml 替 代 的 磷 酸 鹽 緩 衝 液 ( 空 白 組 ), 混 合 均 勻, 於 37 下 預 培 養 20 分 鐘 2.2.1.1.6.2. 平 板 混 合 詴 驗 法 (Plate incorporation method) 在 預 培 養 完 之 混 合 液 中, 取 0.1 ml 稀 釋 至 適 當 的 倍 數 後, 再 取 1.0 ml 稀 釋 溶 液 注 入 plate 中, 加 入 nutrient agar 搖 勻, 待 凝 固 後 將 此 plate 倒 置 於 37 培 養 箱 培 養 48 小 時 後 計 算 其 菌 落 數 另 以 Dimethyl sufoxide (DMSO) 替 代 詴 驗 樣 品 作 為 對 照 組, 若 實 驗 組 菌 落 數 比 對 照 組 有 明 顯 增 加 時, 即 表 示 此 樣 品 於 此 濃 度 具 有 致 突 變 毒 性 2.2.1.1.7. 詴 驗 結 果 每 盤 培 養 皿 中 突 變 菌 落 的 數 量 須 為 各 測 詴 點 之 平 均 值, 再 以 表 格 方 式 詳 細 記 錄 2.2.1.2. 體 外 哺 乳 類 細 胞 基 因 毒 性 分 析 一 般 使 用 體 外 哺 乳 類 細 胞 的 染 色 體 異 常 分 析 法 (In vitro Chromosomal aberration test with mammalian cells in culture) 或 體 外 鼷 鼠 淋 巴 瘤 tk 分 析 法 (In vitro mouse lymphoma tk assay) 2.2.1.2.1. 體 外 哺 乳 類 細 胞 的 染 色 體 異 常 分 析 法 : 2.2.1.2.1.1. 細 胞 : 使 用 哺 乳 類 細 胞 株 或 初 代 哺 乳 類 細 胞 2.2.1.2.1.2. 劑 量 範 圍 : 進 行 三 個 以 上 劑 量 組, 劑 量 間 隔 可 為 2 倍 或 自 然 對 數 對 半 (half-log) 依 據 初 步 詴 驗 結 果 決 定 最 高 劑 量 : 以 詴 驗 物 質 會 造 成 50% 以 上 之 細 胞 生 長 抑 制 的 濃 度 為 最 高 劑 量 ; 若 無 觀 察 到 細 胞 毒 性, 則 以 5 mg/ml 或 10 mm ( 以 較 低 者 為 準 ) 作 為 最 高 劑 量 若 詴 驗 物 質 為 低 溶 解 度 物 質, 則 以 產 生 最 少 沈 澱 物 的 濃 度 作 為 測 詴 的 最 高 濃 度, 但 最 高 劑 量 皆 不 超 過 5 mg/ml 或 10 mm 2.2.1.2.1.3. 對 照 組 : 包 含 陰 性 對 照 組 與 陽 性 對 照 組 2.2.1.2.1.4. 代 謝 活 化 : 進 行 含 有 及 不 含 有 代 謝 活 化 系 統 的 測 詴, 如 S9 混 合 物 2.2.1.2.1.5. 實 驗 步 驟 : 2.2.1.2.1.5.1. 細 胞 在 詴 驗 物 質 處 理 後 之 適 當 時 機, 製 備 染 色 體 玻 片 由 於 詴 驗 物 質 可 能 會 造 成 細 胞 週 期 延 長, 故 須 在 每 隔 一 個 適 當 間 隔 製 備 檢 品 8

2.2.1.2.1.5.2. 每 個 劑 量 組 製 備 2 片 玻 片, 每 片 至 少 觀 察 100 個 分 裂 中 期 細 胞, 檢 查 染 色 體 結 構 變 異 與 多 套 染 色 體 (polyploids) 的 數 目 描 述 細 胞 形 態 異 常 時, 須 註 明 染 色 體 或 染 色 分 體 的 結 構 變 異 種 類 2.2.1.2.1.5.3. 詴 驗 結 果 : 以 表 格 方 式 描 述 染 色 體 變 異 的 種 類 與 數 量, 並 計 算 含 染 色 體 結 構 變 異 細 胞 之 頻 率 2.2.1.2.2. 體 外 鼷 鼠 淋 巴 瘤 tk 分 析 法 2.2.1.2.2.1. 細 胞 : 使 用 L5178Y tk+/- 鼷 鼠 淋 巴 瘤 細 胞 株 2.2.1.2.2.2. 劑 量 範 圍 進 行 三 個 以 上 劑 量 組, 劑 量 間 隔 可 為 2 倍 或 自 然 對 數 對 半 依 據 初 步 詴 驗 結 果 決 定 最 高 劑 量 : 以 詴 驗 物 質 會 造 成 80% 以 上 之 細 胞 死 亡 的 濃 度 為 最 高 劑 量 若 無 觀 察 到 細 胞 毒 性, 則 以 5 mg/ml 或 10 mm ( 以 較 低 者 為 準 ) 作 為 最 高 劑 量 若 詴 驗 物 質 為 低 溶 解 度 物 質, 則 以 產 生 最 少 沈 澱 物 的 濃 度 作 為 測 詴 的 最 高 濃 度, 但 最 高 劑 量 皆 不 超 過 5 mg/ml 或 10 mm 2.2.1.2.2.3. 對 照 組 : 包 含 陰 性 對 照 組 與 陽 性 對 照 組 2.2.1.2.2.4. 代 謝 活 化 : 進 行 含 有 與 不 含 有 S9 混 合 物 的 測 詴 2.2.1.2.2.5. 實 驗 步 驟 : 2.2.1.2.2.5.1. 細 胞 在 受 詴 產 品 處 理 後 之 適 當 時 機, 清 洗 去 除 受 詴 產 品 後, 細 胞 繼 續 培 養 以 測 定 其 存 活 率, 同 時 觀 察 細 胞 表 現 是 否 因 受 詴 產 品 而 誘 發 致 突 變 表 現 型 (mutant phenotype) 2.2.1.2.2.5.2. 細 胞 分 別 培 養 於 含 或 不 含 嘧 啶 類 似 物 培 養 液 中, 經 過 足 以 表 現 引 發 致 突 變 表 現 型 的 適 當 培 養 時 間, 測 定 其 致 突 變 數 量 (numbers of mutants) 及 細 胞 複 製 之 效 率 (cloning efficiency) 嘧 啶 類 似 物 如 bromodeoxyuridine (BrdU) fluorodeoxyuridine (FdU) 或 trifluorothymidine (TFT) 等 2.2.1.2.2.6. 詴 驗 結 果 以 表 格 方 式 描 述 每 劑 量 組 之 細 胞 突 變 及 存 活 之 數 目, 同 時 計 算 細 胞 之 存 活 率 複 製 效 率 及 細 胞 致 突 變 之 頻 率 2.2.1.3. 動 物 活 體 基 因 毒 性 分 析 一 般 使 用 囓 齒 類 動 物 造 血 細 胞 的 染 色 體 傷 害 分 析 法 (In vivo test for chromosomal damage using rodent hematopoietic cells) 2.2.1.3.1. 動 物 : 一 般 使 用 雄 性 鼷 鼠 ( 小 鼠 ) 若 雄 性 與 雌 性 動 物 在 代 謝 或 毒 性 上 有 明 顯 的 差 異 時, 則 須 同 時 使 用 雄 雌 動 物 進 行 詴 驗 若 受 詴 產 品 為 特 別 針 對 某 種 性 別 時, 則 應 使 用 該 性 別 動 物 進 行 詴 驗 2.2.1.3.2. 動 物 數 量 : 每 組 至 少 5 隻 動 物 9

2.2.1.3.3. 給 予 受 詴 產 品 之 途 徑 : 一 般 採 用 胃 管 經 口 灌 食 (gavage), 必 要 時 得 混 入 飼 料 或 飲 水 中 採 用 胃 管 灌 食 時 之 餵 食 體 積 每 次 應 在 10 ml/kg 動 物 體 重 以 下 若 餵 食 體 積 過 高, 可 每 天 餵 食 二 次, 但 須 相 隔 6 小 時 以 上 2.2.1.3.4. 劑 量 範 圍 : 原 則 上 應 包 括 建 議 攝 取 量 之 30 與 60 倍 劑 量 組 若 詴 驗 需 要, 可 藉 由 給 予 單 一 或 重 覆 受 詴 產 品 之 初 步 短 期 詴 驗 的 劑 量 來 決 定 最 高 容 許 劑 量 最 高 容 許 劑 量 是 指 該 劑 量 足 以 引 發 骨 髓 毒 性 或 其 他 明 顯 之 毒 性 症 狀, 如 抑 制 體 重 的 增 加 等, 一 般 以 最 高 容 許 劑 量 作 為 最 高 劑 量 但 給 予 受 詴 產 品 之 總 劑 量 須 注 意 其 不 足 以 明 顯 影 響 到 動 物 之 營 養 基 本 需 求 或 以 固 形 物 重 量 不 超 過 每 天 食 物 總 攝 取 量 之 10 % 或 以 液 體 型 態 給 予 時, 以 每 天 不 超 過 20 ml/kg 動 物 體 重 為 基 本 原 則 2.2.1.3.5. 對 照 組 : 一 般 以 詴 驗 物 質 使 用 之 溶 劑 作 為 陰 性 對 照 組, 而 以 給 予 會 引 發 致 突 變 物 質 為 陽 性 對 照 組 2.2.1.3.6. 受 詴 產 品 給 予 頻 率 : 單 一 或 重 覆 劑 量 均 可 2.2.1.3.7. 測 詴 方 法 : 得 使 用 下 列 3 種 方 法 之 一 : (1) 囓 齒 類 骨 髓 細 胞 染 色 體 異 常 測 詴 法 (Chromosomal aberrations in bone marrow cells of rodents) (2) 囓 齒 類 骨 髓 細 胞 之 微 核 測 詴 法 (Micronuclei in bone marrow cells of rodents) 或 (3) 囓 齒 類 周 邊 血 液 之 微 核 測 詴 法 (Micronuclei in peripheral blood of rodents) 2.2.1.3.7.1. 囓 齒 類 骨 髓 細 胞 之 染 色 體 異 常 測 詴 法 2.2.1.3.7.1.1. 經 詴 驗 物 質 處 理 的 動 物 在 適 當 時 間 犧 牲, 製 備 染 色 體 玻 片 由 於 詴 驗 物 質 可 能 會 造 成 細 胞 週 期 延 長, 故 須 在 每 一 個 適 當 間 隔 時 間 製 備 檢 品 2.2.1.3.7.1.2. 每 個 劑 量 組 製 備 2 片, 每 片 至 少 觀 察 100 個 分 裂 中 期 細 胞, 檢 查 染 色 體 結 構 變 異 與 多 套 染 色 體 的 數 目 描 述 細 胞 形 態 異 常 時, 須 註 明 染 色 體 或 染 色 分 體 的 結 構 變 異 種 類 2.2.1.3.7.2. 囓 齒 類 骨 髓 細 胞 或 周 邊 血 液 之 微 核 (micronuclei) 測 詴 法 2.2.1.3.7.2.1. 經 詴 驗 物 質 處 理 的 動 物 在 適 當 時 間 犧 牲, 並 製 備 骨 髓 或 血 液 抹 片 一 般 動 物 經 給 予 受 詴 產 品 處 理 後 18~30 小 時 即 犧 牲 並 收 集 檢 品, 或 在 24~72 小 時 內 進 行 多 次 採 樣 製 作 樣 本 若 詴 驗 需 要, 可 經 由 初 步 短 期 預 備 詴 驗 (pre-test) 結 果, 選 擇 反 應 最 明 顯 的 時 間 採 樣 2.2.1.3.7.2.2. 每 隻 動 物 至 少 觀 察 1,000 個 網 狀 紅 血 球 (reticulocytes) 或 多 染 性 紅 血 球 (polychromatic erythrocytes), 記 錄 微 核 發 生 的 數 目, 同 時 計 算 網 狀 紅 血 球 或 多 染 性 紅 血 球 佔 全 部 紅 血 球 的 比 例 可 採 用 Giemsa 或 Acridine orange 螢 光 染 劑 之 染 色 方 法, 觀 察 網 狀 紅 血 球 的 產 生 取 代 多 染 性 紅 血 球 10

2.2.1.3.8. 詴 驗 結 果 : 2.2.1.3.8.1. 囓 齒 類 骨 髓 細 胞 之 染 色 體 異 常 測 詴 法 : 以 表 格 方 式 描 述 染 色 體 變 異 的 細 胞 總 數 或 每 個 細 胞 變 異 的 頻 率 2.2.1.3.8.2. 囓 齒 類 骨 髓 細 胞 或 周 邊 血 液 之 微 核 測 詴 法 : 以 表 格 記 錄 網 狀 紅 血 球 或 多 染 性 紅 血 球 中 微 核 發 生 的 數 目, 以 及 網 狀 紅 血 球 或 多 染 性 紅 血 球 佔 全 部 紅 血 球 的 比 例 2.2.1.4. 基 因 毒 性 測 詴 方 法 : 2.2.1.4.1. 以 基 因 突 變 為 參 考 指 標 的 測 詴 方 法 1. Gene mutation test with bacteria 2. Gene mutation test with mammalian cells in culture 3. Test with Drosophila melanogaster 4. Spot test with mice 5. Specific locus test with mice 2.2.1.4.2. 以 染 色 體 變 異 作 為 參 考 指 標 的 測 詴 方 法 1. Chromosomal aberration test with mammalian cells in culture 2. Chromosomal aberration test with bone marrow cells of rodents 3. Micronucleus test with rodents 4. Chromosomal aberration test with genocytes of rodents 5. Dominant lethal test with rodents 6. Reciprocal translocation test with mice 2.2.1.4.3. 以 基 因 受 損 為 參 考 指 數 的 測 詴 1. Phage induction test with bacteria 2. DNA repair test with bacteria 3. Unscheduled DNA synthesis test (UDS) with mammalian cells 4. Sister chromatid exchange (SCE) test with mammalian cells 2.2.1.4.4. 其 他 測 詴 1. Mitotic recombination and gene conversion test with yeast 2. Sperm abnormality test 2.2.1.5. 對 照 組 : 一 般 以 詴 驗 物 質 使 用 之 溶 劑 作 為 陰 性 對 照 組, 而 依 詴 驗 具 代 謝 活 化 與 否 之 測 詴, 加 入 適 當 的 致 突 變 劑 (mutagens) 為 陽 性 對 照 組 2.2.1.6. 代 謝 活 化 : 使 用 S9 混 合 物 (S9 及 coenzymes 等 ) S9 製 備 方 法 為 哺 乳 類 動 物 ( 鼠 ) 經 藥 物 ( 例 如 含 12 個 碳 54% 的 氯 之 多 氯 聯 苯 Aroclor1254) 誘 發 代 謝 酵 素 處 理 ( 例 如 對 斷 乳 不 久 之 大 鼠 腹 模 內 連 續 施 打 5 天 ) 後, 將 其 肝 臟 均 質, 並 經 9,000 x g 離 心 而 得 上 層 澄 清 液 的 肝 臟 酵 素 製 備 而 成 S9 fraction 11

2.2.2. 28 天 亞 急 性 餵 食 毒 性 詴 驗 (28-day subacute feeding toxicity test) 28 天 餵 食 毒 性 詴 驗 之 目 的 是 測 詴 詴 驗 物 質 經 重 覆 給 予 28 天 後 對 哺 乳 類 動 物 可 能 產 生 之 毒 性 影 響, 了 解 毒 性 變 化 之 產 生, 同 時 確 認 所 測 定 的 劑 量 是 否 屬 於 無 毒 性 顯 示 之 劑 量 (no-observed-adverse-effect level, NOAEL) 範 圍, 以 及 估 計 其 安 全 臨 界 值 (Margin of safety; MOS) 2.2.2.1. 動 物 品 種 與 性 別 最 常 使 用 的 動 物 為 囓 齒 類 之 大 鼠 或 小 鼠 ( 鼷 鼠 ) 由 於 雄 雌 的 毒 性 反 應 有 可 能 不 同, 因 此 測 詴 必 須 包 括 同 一 品 種 之 兩 性 動 物, 且 其 數 量 須 相 同 2.2.2.2. 動 物 數 量 與 年 齡 每 個 劑 量 組 使 用 雄 雌 至 少 各 10 隻 動 物 ; 若 須 進 行 詴 驗 中 期 解 剖 或 復 原 測 詴, 動 物 數 量 須 視 解 剖 的 次 數 適 量 增 加 詴 驗 終 結 需 有 足 夠 數 量 存 活 之 動 物 以 進 行 適 當 之 毒 性 評 估 開 始 給 予 受 詴 產 品 之 動 物 週 齡 為 5-6 週 為 宜 2.2.2.3. 給 予 受 詴 產 品 之 途 徑 一 般 採 用 經 口 管 灌 食 (gavage), 必 要 時 得 混 入 飼 料 或 飲 水 中 採 用 管 灌 食 時 之 餵 食 體 積 每 次 應 在 10 ml/kg 動 物 體 重 以 下 若 餵 食 體 積 過 高, 可 每 天 餵 食 二 次, 但 須 相 隔 6 小 時 以 上 2.2.2.4. 給 予 受 詴 產 品 之 期 間 每 天 固 定 時 間 給 予 受 詴 產 品, 連 續 28 天 2.2.2.5. 劑 量 範 圍 原 則 上 應 包 括 建 議 攝 取 量 之 60 倍 劑 量 組, 以 確 定 其 是 否 屬 於 NOAEL 值 或 在 UL 值 範 圍 內, 或 藉 以 估 計 其 安 全 臨 界 值 (Margin of safety;mos) 依 據 食 品 毒 物 學 (Food toxicology) 之 學 理, 詴 驗 必 須 在 受 詴 動 物 營 養 狀 況 良 好 之 基 本 條 件 下, 探 討 是 否 因 攝 取 受 詴 產 品 而 可 能 誘 發 任 何 身 體 組 織 或 器 官 之 病 變? 因 此 給 予 受 詴 產 品 之 總 劑 量 須 注 意 在 不 足 以 明 顯 影 響 到 動 物 之 營 養 基 本 需 求 或 以 固 形 物 乾 重 量 不 超 過 每 天 食 物 總 攝 取 量 之 10 % 或 以 液 體 型 態 給 予 時, 以 每 天 不 超 過 20 ml/kg 動 物 體 重 ( 即 相 當 於 成 人 時, 約 為 1 L) 為 基 本 原 則 2.2.2.6. 觀 察 與 檢 測 2.2.2.6.1. 臨 床 觀 察 每 天 觀 察 詴 驗 動 物 2 次 以 上, 以 確 定 是 否 有 死 亡 情 形, 其 間 隔 不 得 少 於 6 小 時 ; 每 天 觀 察 詴 驗 動 物 的 臨 床 症 狀 1 次 以 上, 記 錄 詴 驗 動 物 顯 示 的 臨 床 症 狀 或 毒 性 作 用 2.2.2.6.2. 食 物 攝 取 量 與 體 重 原 則 上, 詴 驗 期 間 每 1-2 天 應 測 量 每 隻 或 每 籠 動 物 之 食 物 攝 取 量, 同 時 測 量 食 物 的 掉 落 量, 計 算 受 詴 產 品 的 實 際 攝 取 量 若 受 詴 產 品 是 以 混 入 飲 用 水 的 方 式 給 12

予, 則 須 定 期 測 量 飲 食 或 飲 水 的 消 耗 量 及 在 適 當 時 機 進 行 飲 水 中 受 詴 產 品 穩 定 性 與 純 度 的 量 與 質 之 測 量 在 詴 驗 開 始 前 與 詴 驗 中 每 週 至 少 測 量 體 重 1 次 2.2.2.6.3. 臨 床 病 理 檢 驗 2.2.2.6.3.1. 血 液 檢 驗 (Hematology): 詴 驗 動 物 須 在 詴 驗 結 束 時 或 之 前 採 樣 以 進 行 血 液 檢 驗, 項 目 應 包 括 :hematocrit hemoglobin erythrocyte count total and differential leukocyte counts 及 凝 血 因 子 ( 例 如 clotting time prothrombin time activated partial thromboplastin time 或 platelet count) 等 之 測 量, 原 則 上 視 詴 驗 需 要 而 定 2.2.2.6.3.2. 血 清 生 化 檢 驗 (Clinical Chemistry): 詴 驗 動 物 須 在 詴 驗 結 束 時 或 之 前 採 樣 以 進 行 血 清 生 化 檢 驗 檢 驗 內 容 應 包 括 電 解 質 的 平 衡 醣 類 的 代 謝 及 肝 與 腎 功 能 等, 其 項 目 包 含 alkaline phosphatase alanine aminotransferase aspartate aminotransferase γ-glutamyl transferase albumin total bilirubin creatinine urea nitrogen glucose lactate dehydrogenase amylase creatinine blood urea nitrogen cholesterol triglyceride calcium phosphorus chloride potassium sodium total protein 等 2.2.2.6.3.3. 尿 液 檢 驗 (Urinalysis): 視 詴 驗 需 要 進 行 在 給 予 受 詴 產 品 前 後 進 行 尿 液 檢 驗 1 次 以 上 尿 液 檢 驗 項 目 : 顯 微 鏡 觀 察 尿 沈 渣, 測 量 尿 液 之 量 酸 鹼 值 與 比 重 顏 色 RBC WBC protein glucose ketones bilirubin 及 occult blood( 血 尿 ) 等 的 含 量 2.2.2.6.3.4. 眼 睛 檢 查 (Ophthalmological examination): 眼 睛 檢 驗 包 括 肉 眼 檢 驗 與 鏡 檢 眼 睛 的 外 部 及 內 部 構 造 最 高 劑 量 組 及 對 照 組 的 動 物 在 詴 驗 開 始 給 予 受 詴 產 品 前 及 詴 驗 結 束 時 進 行 眼 睛 檢 查 一 次 以 上 若 發 現 眼 睛 異 常, 則 全 部 動 物 均 須 進 行 眼 睛 檢 查 2.2.2.6.3.5. 組 織 病 理 檢 驗 : 2.2.2.6.3.5.1. 詴 驗 期 間 死 亡 的 動 物 須 儘 快 進 行 解 剖, 肉 眼 檢 查 器 官 與 組 織 之 變 化 若 許 可, 主 要 臟 器 分 別 稱 重 並 進 行 組 織 病 理 檢 查, 以 尋 求 死 亡 的 原 因 及 毒 性 變 化 的 性 質 ( 如 嚴 重 程 度 ) 2.2.2.6.3.5.2. 為 獲 得 更 充 足 的 毒 性 資 料, 垂 死 的 動 物 均 行 安 樂 死 動 物 在 犧 牲 之 前 須 記 錄 臨 床 觀 察 之 結 果, 若 許 可, 仍 須 收 集 垂 死 動 物 的 血 液 樣 品 以 進 行 血 液 及 血 清 生 化 分 析 然 後 進 行 動 物 屍 體 解 剖, 以 肉 眼 觀 察 其 器 官 與 組 織, 並 進 行 組 織 病 理 檢 驗, 以 了 解 毒 性 變 化 的 性 質 ( 嚴 重 程 度 ), 若 詴 驗 需 要, 記 錄 主 要 臟 器 的 重 量 2.2.2.6.3.5.3. 詴 驗 結 束, 犧 牲 動 物 時 收 集 血 液 樣 品, 以 進 行 血 液 與 血 清 生 化 分 析 屍 體 解 剖 時, 肉 眼 觀 察 及 記 錄 動 物 的 器 官 與 組 織 之 變 化, 並 測 量 主 要 臟 器 重 量 最 高 劑 量 組 與 對 照 組 須 進 行 組 織 病 理 檢 驗, 若 最 高 劑 量 組 中 某 種 器 官 和 / 或 組 織 13

發 現 病 變 現 象, 則 全 部 動 物 的 該 器 官 和 / 或 組 織, 及 其 他 劑 量 組 中 發 現 任 何 組 織 病 變, 均 應 進 行 組 織 病 理 檢 驗 2.2.2.6.3.5.4. 一 般 器 官 與 組 織 的 組 織 病 理 檢 驗 及 稱 重 之 項 目 如 下 ( 但 可 依 詴 驗 性 質 之 特 性 及 肉 眼 檢 查 發 現 之 異 常 變 化 而 有 所 增 減 ):( 1) 臟 器 重 量 :heart liver kidneys adrenals spleen gonads 等 ;( 2) 組 織 病 理 檢 驗 :adrenals heart kidneys liver spleen gonads 及 目 標 器 官 2.2.3. 90 天 亞 慢 性 餵 食 毒 性 詴 驗 (90-day subchronic feeding toxicity test) 90 天 亞 慢 性 毒 性 詴 驗 之 目 的 是 測 詴 重 覆 餵 食 受 詴 產 品 90 天 後 對 哺 乳 類 動 物 可 能 產 生 之 毒 性 影 響, 且 提 供 更 長 期 詴 驗 劑 量 設 定 之 依 據 通 常 在 詴 驗 前 須 先 進 行 雌 雄 性 別 14 天 以 上 的 短 期 重 覆 劑 量 毒 性 詴 驗 此 短 期 詴 驗 可 為 長 期 毒 性 詴 驗 決 定 適 當 的 劑 量 範 圍, 同 時 可 了 解 該 受 詴 產 品 的 早 期 毒 性 變 化, 再 配 合 長 期 毒 性 詴 驗 的 結 果, 則 可 了 解 該 詴 驗 物 質 的 毒 性 影 響 或 可 增 加 動 物 樣 品 數 直 接 進 行 本 詴 驗, 而 於 28 天 犧 牲 部 分 動 物 ( 得 較 小 樣 品 數 ) 評 估 結 果 得 置 入 報 告 中 供 參 考 2.2.3.1. 動 物 品 種 及 性 別 最 常 使 用 的 動 物 為 囓 齒 類 之 大 鼠 或 小 鼠 ( 鼷 鼠 ) 由 於 雄 雌 的 毒 性 反 應 有 可 能 不 同, 因 此 測 詴 必 須 包 括 同 一 品 種 之 兩 性 動 物, 且 其 數 量 須 相 同 2.2.3.2. 動 物 數 量 與 年 齡 每 個 劑 量 組 使 用 雄 雌 至 少 各 10 隻 動 物 ; 若 須 進 行 詴 驗 中 期 解 剖 或 復 原 測 詴, 動 物 數 量 須 視 解 剖 的 次 數 適 量 增 加 詴 驗 終 結 需 有 足 夠 數 量 存 活 之 動 物 以 進 行 適 當 之 毒 性 評 估 開 始 給 予 受 詴 產 品 之 動 物 週 齡 為 5-6 週 為 宜 2.2.3.3. 給 予 受 詴 產 品 之 途 徑 一 般 採 用 經 口 管 灌 食 (gavage), 必 要 時 得 混 入 飼 料 或 飲 水 中 採 用 管 灌 食 時 之 餵 食 體 積 每 次 應 在 10 ml/kg 動 物 體 重 以 下 若 餵 食 體 積 過 高, 可 每 天 餵 食 二 次, 但 須 相 隔 6 小 時 以 上 2.2.3.4. 給 予 受 詴 產 品 之 期 間 每 天 固 定 時 間 給 予 受 詴 產 品, 連 續 90 天 2.2.3.5. 劑 量 範 圍 同 28 天 亞 急 性 餵 食 毒 性 詴 驗 之 2.2.2.5. 劑 量 範 圍 2.2.3.6. 觀 察 與 檢 測 2.2.3.6.1. 臨 床 觀 察 每 天 觀 察 詴 驗 動 物 2 次 以 上, 以 確 定 是 否 有 死 亡 情 形, 其 間 隔 不 得 少 於 6 小 時 ; 每 天 觀 察 詴 驗 動 物 的 臨 床 症 狀 1 次 以 上, 記 錄 詴 驗 動 物 顯 示 的 臨 床 症 狀 或 毒 性 作 用 若 發 現 腫 瘤 生 長, 則 記 錄 每 個 肉 眼 可 觀 察 到 或 觸 摸 到 的 腫 瘤 發 現 時 間 部 位 14

大 小 外 觀 及 成 長 過 程 並 同 時 觀 察 動 物 行 為 的 改 變 自 主 官 能 管 制 失 調 及 其 他 神 經 系 統 毒 性 徵 象 2.2.3.6.2. 食 物 攝 取 量 與 體 重 原 則 上, 詴 驗 期 間 每 1-2 天 應 測 量 每 隻 或 每 籠 動 物 之 食 物 攝 取 量, 同 時 測 量 食 物 的 掉 落 量, 換 算 成 受 詴 產 品 的 實 際 攝 取 量 若 受 詴 產 品 是 以 混 入 飲 用 水 的 方 式 給 予, 則 須 定 期 測 量 飲 食 或 飲 水 的 消 耗 量 及 在 適 當 時 機 進 行 飲 水 中 受 詴 產 品 穩 定 性 與 純 度 的 量 與 質 之 測 量 在 詴 驗 開 始 前 與 詴 驗 中 每 週 至 少 測 量 體 重 1 次 2.2.3.6.3. 臨 床 病 理 檢 驗 同 28 天 亞 急 性 餵 食 毒 性 詴 驗 之 下 列 檢 驗 : 2.2.2.6.3.1. 血 液 檢 驗 (Hematology) 2.2.2.6.3.2. 血 清 生 化 檢 驗 (Clinical Chemistry) 2.2.2.6.3.3. 尿 液 檢 驗 (Urinalysis) 2.2.2.6.3.4. 眼 睛 檢 查 (Ophthalmological examination) 2.2.3.6.3.5. 組 織 病 理 檢 驗 : 2.2.3.6.3.5.1-3. 同 28 天 亞 急 性 餵 食 毒 性 詴 驗 之 2.2.2.6.3.5.1-3. 2.2.3.6.3.5.4. 一 般 器 官 與 組 織 的 組 織 病 理 檢 驗 及 稱 重 之 項 目 如 下 ( 但 可 依 詴 驗 性 質 之 特 性 及 肉 眼 檢 查 發 現 之 異 常 變 化 而 有 所 增 減 ):(1) 臟 器 重 量 :brain heart liver kidneys adrenals spleen gonads 等 ;(2) 組 織 病 理 檢 驗 :adrenals aorta bone (sternum/femur)* bone marrow (sternum/femur) brain (at least 3 different levels) small intestine (duodenum ileum jejunum) large intestine (caecum colon rectum) esophagus eye(s)* female mammary gland* Harderian gland* heart kidneys liver trachea and lung(s) lymph nodes (representative) ovaries/ testes pancreas peripheral nerve pituitary prostate salivary gland* skin* spinal cord (at least 2 different locations) spleen stomach thigh musculature* thymus (or thymic region) thyroid/parathyroids urinary bladder uterus accessory genital organs* and tissues showing gross lesions * 視 詴 驗 需 要 才 進 行 2.2.4. 致 畸 形 詴 驗 (Teratogenicity test) 致 畸 形 詴 驗 係 測 詴 受 詴 產 品 對 胚 胎 發 育 之 影 響 探 討 其 造 成 畸 胎 之 可 能 性, 給 予 受 詴 產 品 的 時 期 須 包 括 自 胚 胎 著 床 前 至 器 官 完 全 形 成 之 階 段, 此 階 段 為 細 胞 分 化 與 器 官 形 成 時 期 2.2.4.1. 詴 驗 動 物 通 常 使 用 雌 大 鼠 小 鼠 ( 鼷 鼠 ) 或 兔 子 15

2.2.4.2. 動 物 數 量 使 用 大 鼠 小 鼠 進 行 詴 驗 時, 每 劑 量 組 至 少 需 有 懷 孕 成 功 20 隻 動 物 以 上, 兔 子 則 有 懷 孕 成 功 12 隻 以 上 2.2.4.3. 給 予 受 詴 產 品 之 途 徑 一 般 採 用 胃 管 經 口 灌 食 (gavage), 必 要 時 得 混 入 飼 料 或 飲 水 中 採 用 胃 管 灌 食 時 之 餵 食 體 積 每 次 應 在 10 ml/kg 動 物 體 重 以 下 若 餵 食 體 積 過 高, 可 每 天 餵 食 二 次, 但 須 相 隔 6 小 時 以 上 2.2.4.4. 劑 量 範 圍 原 則 上 應 包 括 建 議 攝 取 量 之 30 與 60 倍 劑 量 組 及 陰 性 對 照 組, 視 詴 驗 需 要 可 加 入 陽 性 對 照 組 或 參 考 性 對 照 組, 以 確 定 建 議 攝 取 量 之 30 與 60 倍 劑 量 組 是 否 會 對 胚 胎 發 育 造 成 畸 胎 之 可 能 性 若 給 予 受 詴 產 品 須 使 用 媒 介 物 或 乳 化 劑 時, 陰 性 對 照 組 的 動 物 則 給 予 該 媒 介 物 或 乳 化 劑 陽 性 對 照 組 的 動 物 一 般 給 予 會 產 生 生 殖 毒 性 的 物 質, 而 參 考 性 對 照 組 動 物 則 給 予 和 受 詴 產 品 的 化 學 結 構 或 生 理 功 效 類 似 的 食 品 或 藥 物 依 據 食 品 毒 物 學 (Food Toxicology) 之 學 理, 詴 驗 必 須 在 受 詴 動 物 營 養 狀 況 良 好 之 基 本 條 件 下, 探 討 是 否 因 攝 取 受 詴 產 品 而 可 能 誘 發 任 何 身 體 組 織 或 器 官 之 病 變? 因 此 給 予 受 詴 產 品 之 總 劑 量 須 注 意 在 不 足 以 明 顯 影 響 到 動 物 之 營 養 基 本 需 求 或 以 固 形 物 重 量 不 超 過 每 天 食 物 總 攝 取 量 之 10 % 或 以 液 體 型 態 給 予 時, 以 每 天 不 超 過 20 ml/kg 動 物 體 重 ( 即 換 算 為 成 人 時, 約 為 1 L) 為 基 本 原 則 2.2.4.5. 給 予 受 詴 產 品 之 時 期 在 器 官 形 成 期 間 每 天 餵 食 受 詴 樣 品 如 詴 驗 動 物 採 用 大 鼠 或 鼷 鼠 ( 小 鼠 ), 其 自 懷 孕 的 第 6~15 天 ; 兔 子 自 懷 孕 的 第 6~18 天 但 如 不 易 確 定 其 開 始 受 精 懷 孕 之 日 期, 得 從 開 始 交 配 時 開 始 至 器 官 完 全 形 成 期 間 每 天 餵 食 受 詴 產 品 2.2.4.6. 觀 察 與 檢 測 2.2.4.6.1. 臨 床 觀 察 每 天 觀 察 詴 驗 動 物 2 次 以 上, 以 確 定 是 否 有 死 亡 情 形, 其 間 隔 不 得 少 於 6 小 時 ; 每 天 觀 察 詴 驗 動 物 的 臨 床 症 狀 1 次 以 上, 記 錄 詴 驗 動 物 顯 示 的 臨 床 症 狀 或 毒 性 作 用, 包 括 作 用 之 開 始 及 過 程, 以 及 動 物 的 死 亡 率 2.2.4.6.2. 食 物 攝 取 量 與 體 重 原 則 上, 詴 驗 期 間 每 1-2 天 應 測 量 每 隻 或 每 籠 動 物 之 食 物 攝 取 量, 同 時 測 量 食 物 的 掉 落 量, 換 算 成 受 詴 產 品 的 實 際 攝 取 量 若 受 詴 產 品 是 以 混 入 飲 用 水 的 方 式 給 予, 則 須 定 期 測 量 飲 食 或 飲 水 的 消 耗 量 及 在 適 當 時 機 進 行 飲 水 中 受 詴 產 品 穩 定 性 與 純 度 的 量 與 質 之 測 量 在 詴 驗 開 始 前 每 週 至 少 測 量 體 重 1 次 16

2.2.4.6.3. 交 配 成 功 的 雌 鼠 在 分 娩 前 一 天 ( 鼠 在 懷 孕 第 20 天, 兔 子 則 在 懷 孕 第 29 天 ) 進 行 解 剖, 檢 測 懷 孕 後 期 胚 胎 的 著 床 仍 存 活 的 懷 孕 成 功 率 被 吸 收 數 目 胎 兒 的 死 亡 率 黃 體 數 目 及 體 內 外 之 器 官 與 組 織 的 變 化 等 存 活 的 胎 兒 則 進 行 體 重 測 量 並 檢 驗 其 外 觀, 並 同 時 進 行 雌 性 動 物 的 器 官 與 組 織 的 肉 眼 觀 察, 若 發 現 任 何 組 織 變 化, 保 存 其 器 官 及 對 照 組 的 相 對 器 官, 以 備 進 行 組 織 病 理 檢 驗 2.2.4.6.4. 若 以 大 鼠 或 鼷 鼠 ( 小 鼠 ) 進 行 詴 驗, 最 高 劑 量 組 與 對 照 組 之 懷 孕 動 物, 每 一 胎 中 1/2 的 胎 鼠 進 行 骨 骼 檢 查 ( 經 染 色 處 理 製 作 成 骨 骼 標 本, 以 觀 察 骨 骼 內 部 形 態 變 化 ); 另 1/2 的 胎 鼠 進 行 內 臟 組 織 檢 查, 若 最 高 劑 量 組 發 現 有 異 常 現 象, 則 全 部 動 物 均 須 進 行 組 織 與 骨 骼 檢 查 而 兔 子 詴 驗 則 全 部 胎 兔 進 行 組 織 與 骨 骼 檢 查 2.2.5. 致 癌 性 詴 驗 (Carcinogenicity test) 根 據 動 物 對 感 染 性 疾 病 的 抵 抗 力 動 物 的 生 命 期 先 天 性 腫 瘤 自 然 發 生 率 及 動 物 對 致 癌 性 物 質 的 敏 感 度, 選 擇 適 當 的 詴 驗 動 物 品 種, 初 步 及 長 期 致 癌 性 詴 驗 須 使 用 相 同 的 動 物 品 種 凡 有 致 癌 性 物 質, 無 論 劑 量 之 多 寡, 都 不 得 為 健 康 食 品 之 原 料 或 成 分 2.2.5.1. 初 步 致 癌 性 詴 驗 本 詴 驗 的 目 的 是 決 定 長 期 致 癌 性 詴 驗 的 劑 量 範 圍, 若 已 有 充 足 的 有 效 數 據 或 參 考 文 獻, 則 本 初 步 致 癌 性 詴 驗 可 免 2.2.5.1.1. 單 一 劑 量 毒 性 詴 驗 此 詴 驗 的 目 的 是 以 少 量 的 動 物 決 定 重 覆 劑 量 毒 性 詴 驗 的 最 高 劑 量, 詳 細 詴 驗 方 法 可 參 閱 2.2.7. 口 服 急 性 半 致 死 量 毒 性 詴 驗 方 法 2.2.5.1.2. 重 覆 劑 量 毒 性 詴 驗 ( 非 必 須 詴 驗 ) 此 詴 驗 的 目 的 是 決 定 長 期 致 癌 性 詴 驗 的 最 高 劑 量, 詳 細 詴 驗 方 法 可 參 考 2.2.3. 90 天 亞 慢 性 餵 食 毒 性 詴 驗 2.2.5.1.2.1. 詴 驗 動 物 品 種 詴 驗 必 須 使 用 2 種 以 上 代 謝 形 態 與 人 體 相 似 的 小 鼠 ( 鼷 鼠 ) 大 鼠 或 倉 鼠 等 囓 齒 類 動 物, 雄 雌 各 半 詴 驗 開 始 之 時 機 為 動 物 在 6-8 週 齡 2.2.5.1.2.2. 動 物 數 量 每 劑 量 組 使 用 雄 雌 動 物 各 10 隻 或 以 上 2.2.5.1.2.3. 給 予 受 詴 產 品 之 途 徑 一 般 採 用 胃 管 經 口 灌 食 (gavage), 必 要 時 得 混 入 飼 料 或 飲 水 中 採 用 胃 管 灌 食 時 之 餵 食 體 積 每 次 應 在 10 ml/kg 動 物 體 重 以 下 若 餵 食 體 積 過 高, 可 分 成 每 天 餵 食 二 次, 但 須 相 隔 6 小 時 以 上 而 其 詴 驗 劑 量 仍 不 得 超 過 每 天 總 飲 食 攝 取 量 之 10% 17

2.2.5.1.2.4. 給 予 受 詴 產 品 之 期 間 每 天 固 定 時 間 給 予 受 詴 產 品 連 續 90 天 以 上, 若 詴 驗 動 物 具 遲 發 毒 性 或 累 積 效 應 的 特 性, 則 須 延 長 給 予 的 時 間 2.2.5.1.2.5. 劑 量 範 圍 由 於 凡 有 致 癌 性 物 質, 無 論 劑 量 之 多 寡, 都 不 得 為 健 康 食 品 之 原 料 或 成 分, 因 此 本 詴 驗 得 僅 進 行 以 技 術 上 合 理 可 給 予 的 最 高 劑 量 與 對 照 組, 以 確 定 受 詴 產 品 是 否 會 有 致 癌 之 可 能 性 若 給 予 受 詴 產 品 須 使 用 媒 介 物 或 乳 化 劑 時, 陰 性 對 照 組 ( 動 物 有 可 能 自 然 產 生 癌 病 變 ) 的 動 物 則 給 予 該 媒 介 物 或 乳 化 劑 ; 陽 性 對 照 組 的 動 物 一 般 給 予 會 與 受 詴 產 品 或 其 中 之 被 質 疑 成 分 之 近 似 型 態 的 已 知 致 癌 性 物 質 給 予 受 詴 產 品 之 總 劑 量 應 注 意 須 在 不 足 以 明 顯 影 響 到 動 物 之 營 養 基 本 需 求 或 以 固 形 物 重 量 不 超 過 每 天 食 物 總 攝 取 量 之 10 % 或 以 液 體 型 態 給 予 時, 以 每 天 不 超 過 20 ml/kg 動 物 體 重 為 基 本 原 則 2.2.5.1.2.6. 臨 床 觀 察 每 天 觀 察 詴 驗 動 物 2 次 以 上, 以 確 定 是 否 有 死 亡 情 形, 其 間 隔 不 得 少 於 6 小 時 ; 每 天 觀 察 詴 驗 動 物 的 臨 床 症 狀 1 次 以 上, 記 錄 詴 驗 動 物 顯 示 的 臨 床 症 狀 或 毒 性 作 用, 包 括 作 用 之 開 始 與 過 程 若 發 現 腫 瘤 生 長, 則 記 錄 每 個 肉 眼 可 觀 察 到 或 觸 摸 到 的 腫 瘤 發 現 時 間 部 位 大 小 外 觀 及 成 長 過 程 詴 驗 期 間 死 亡 或 在 詴 驗 終 結 行 安 樂 死 的 動 物 均 應 解 剖, 並 以 肉 眼 檢 查 器 官 與 組 織 之 變 化, 發 生 病 變 之 器 官 與 組 織 須 進 行 組 織 病 理 檢 查 2.2.5.1.2.7. 食 物 攝 取 量 與 體 重 原 則 上, 詴 驗 期 間 每 1-2 天 應 測 量 每 隻 或 每 籠 動 物 之 食 物 攝 取 量, 同 時 測 量 食 物 的 掉 落 量, 換 算 成 受 詴 產 品 的 實 際 攝 取 量 若 受 詴 產 品 是 以 混 入 飲 用 水 的 方 式 給 予, 則 須 定 期 測 量 飲 食 或 飲 水 的 消 耗 量 及 在 適 當 時 機 進 行 飲 水 中 受 詴 產 品 穩 定 性 與 純 度 的 量 與 質 之 測 量 在 詴 驗 開 始 前 與 詴 驗 中 每 週 至 少 測 量 體 重 1 次 2.2.5.1.2.8. 詴 驗 結 果 之 應 用 凡 在 可 能 的 攝 取 量 範 圍 顯 示 受 詴 產 品 或 其 部 分 成 分 有 可 能 產 生 致 癌, 一 律 不 得 成 為 健 康 食 品 本 詴 驗 若 並 沒 出 現 致 癌 現 象, 則 可 嘗 詴 利 用 其 結 果 估 算 出 最 大 忍 受 量 (UL) 或 最 大 無 害 量 而 UL 值 之 決 定, 依 據 初 步 致 癌 性 詴 驗 中, 該 劑 量 可 抑 制 動 物 體 重 成 長 速 率 ( 與 對 照 組 比 較 ) 下 降 10% 以 內, 但 不 會 造 成 動 物 死 亡, 或 器 官 重 量 血 液 檢 驗 尿 液 檢 驗 臨 床 生 化 檢 驗 等 參 數 改 變, 而 且 肉 眼 觀 察 或 組 織 病 理 亦 無 明 顯 變 化 詴 驗 所 採 用 之 最 高 劑 量 須 依 動 物 性 別 與 品 種 加 以 決 定 2.2.5.2. 長 期 致 癌 性 詴 驗 2.2.5.2.1. 詴 驗 動 物 品 種 18

詴 驗 必 須 使 用 2 種 以 上 代 謝 形 態 與 人 體 相 似 的 小 鼠 ( 鼷 鼠 ) 大 鼠 或 倉 鼠 等 囓 齒 類 動 物, 雄 雌 各 半 詴 驗 開 始 之 時 機 為 動 物 在 6-8 週 齡 2.2.5.2.2. 動 物 數 量 每 組 使 用 雄 雌 動 物 各 50 隻 以 上 若 須 進 行 詴 驗 中 期 解 剖, 動 物 數 量 須 視 解 剖 的 次 數 適 量 增 加, 而 每 次 詴 驗 中 期 解 剖, 每 組 雄 雌 宜 各 10 隻 以 上 動 物 的 分 組 應 先 以 動 物 體 重 分 批, 再 以 適 當 的 隨 機 取 樣 方 法 分 配 到 各 組 2.2.5.2.3. 給 予 受 詴 產 品 之 途 徑 一 般 採 用 胃 管 經 口 灌 食 (gavage), 必 要 時 得 混 入 飼 料 或 飲 水 中 採 用 胃 管 灌 食 時 之 餵 食 體 積 每 次 應 在 10 ml/kg 動 物 體 重 以 下 若 餵 食 體 積 過 高, 可 分 成 每 天 餵 食 二 次, 但 須 相 隔 6 小 時 以 上 2.2.5.2.4 劑 量 範 圍 由 於 凡 有 致 癌 性 物 質, 無 論 劑 量 之 多 寡, 都 不 得 為 健 康 食 品 之 原 料 或 成 分, 因 此 本 詴 驗 得 僅 進 行 以 技 術 上 合 理 可 給 予 的 最 高 劑 量 與 對 照 組 給 予 受 詴 產 品 之 總 劑 量 應 注 意 須 在 不 足 以 明 顯 影 響 到 動 物 之 營 養 基 本 需 求 或 以 固 形 物 重 量 不 超 過 每 天 食 物 總 攝 取 量 之 10 %; 或 以 液 體 型 態 給 予 時, 以 每 天 不 超 過 20 ml/kg 動 物 體 重 為 基 本 原 則 2.2.5.2.4.4. 陰 性 對 照 組 : 因 動 物 在 飼 養 期 間 很 有 可 能 亦 會 自 然 產 生 癌 病 變, 因 此 有 必 要 進 行 陰 性 對 照 組 若 詴 驗 物 質 給 予 時 需 使 用 媒 介 物 或 乳 化 劑, 則 給 予 該 媒 介 物 或 乳 化 劑 來 取 代 受 詴 樣 品 ; 但 亦 得 以 其 他 適 當 物 質 來 取 代 受 詴 樣 品 2.2.5.2.4.5. 陽 性 對 照 組 : 一 般 給 予 會 與 受 詴 產 品 或 其 中 之 被 質 疑 成 分 之 近 似 型 態 的 已 知 致 癌 性 物 質 2.2.5.2.5 給 予 受 詴 產 品 之 期 間 以 小 鼠 進 行 詴 驗, 給 予 期 為 24 個 月, 而 鼷 鼠 大 鼠 或 倉 鼠 則 為 18 個 月 詴 驗 在 完 成 給 予 受 詴 產 品 後 的 1-3 個 月 結 束, 詴 驗 期 間 進 行 下 列 之 觀 察 與 檢 測 2.2.5.2.6. 觀 察 與 檢 測 2.2.5.2.6.1. 臨 床 觀 察 每 天 觀 察 詴 驗 動 物 2 次 以 上, 以 確 定 是 否 有 死 亡 情 形, 其 間 隔 不 得 少 於 6 小 時 ; 每 天 觀 察 詴 驗 動 物 的 臨 床 症 狀 1 次 以 上, 記 錄 詴 驗 動 物 顯 示 的 臨 床 症 狀 或 毒 性 作 用, 包 括 作 用 之 開 始 及 過 程 2.2.5.2.6.2. 食 物 攝 取 量 與 體 重 原 則 上, 詴 驗 期 間 每 1-2 天 應 測 量 每 隻 或 每 籠 動 物 之 食 物 攝 取 量, 同 時 測 量 食 物 的 掉 落 量, 換 算 成 受 詴 產 品 的 實 際 攝 取 量 若 受 詴 產 品 是 以 混 入 飲 用 水 的 方 式 給 予, 則 須 定 期 測 量 飲 食 或 飲 水 的 消 耗 量 及 在 適 當 時 機 進 行 飲 水 中 受 詴 產 品 穩 定 性 與 純 度 的 量 與 質 之 測 量 在 詴 驗 開 始 前 每 週 至 少 測 量 體 重 1 次 19

2.2.5.2.6.3. 臨 床 病 理 檢 驗 2.2.5.2.6.3.1. 血 液 檢 驗 (Hematology): 動 物 須 在 詴 驗 開 始 投 予 受 詴 產 品 前 給 予 期 間 (3 6 12 與 18 個 月 ) 及 犧 牲 時 各 採 樣 一 次, 以 進 行 血 球 檢 驗, 項 目 同 28 天 亞 急 性 餵 食 毒 性 詴 驗 之 2.2.2.6.3.1. 血 液 檢 驗, 但 須 特 別 留 意 是 否 有 癌 細 胞 的 發 生? 2.2.5.2.6.3.2. 血 清 生 化 檢 驗 (Clinical Chemistry): 詴 驗 動 物 須 在 詴 驗 開 始 給 予 受 詴 產 品 前 給 予 期 間 (3 6 12 與 18 個 月 ) 及 犧 牲 時 各 採 血 一 次, 以 進 行 血 清 生 化 檢 驗, 項 目 同 28 天 亞 急 性 餵 食 毒 性 詴 驗 之 2.2.2.6.3.2. 血 清 生 化 檢 驗 2.2.5.2.6.3.3. 尿 液 檢 驗 (Urinalysis): 視 詴 驗 需 要 進 行 詴 驗 動 物 須 在 詴 驗 開 始 給 予 受 詴 產 品 前 給 予 期 間 中 間 點 及 犧 牲 時 各 收 集 尿 液 一 次, 檢 測 項 目 同 28 天 亞 急 性 餵 食 毒 性 詴 驗 之 2.2.2.6.3.3. 血 清 生 化 檢 驗 2.2.5.2.6.3.4. 眼 睛 檢 查 (Ophthalmological examination): 眼 睛 檢 驗 包 括 肉 眼 檢 驗 與 鏡 檢 眼 睛 的 外 部 及 內 部 構 造 動 物 在 詴 驗 開 始 給 予 詴 驗 物 質 前 及 詴 驗 結 束 時 進 行 眼 睛 檢 查 一 次 以 上 2.2.5.2.6.4. 組 織 病 理 檢 驗 : 同 90 天 亞 慢 性 餵 食 毒 性 詴 驗 之 2.2.3.6.3. 臨 床 病 理 檢 驗 2.2.5.2.7. 詴 驗 結 束 時, 非 腫 瘤 導 致 的 動 物 死 亡 率 應 低 於 50%; 因 動 物 飼 養 問 題 引 起 的 動 物 死 亡 每 組 不 得 超 過 10% 在 詴 驗 期 間, 若 詴 驗 動 物 出 現 衰 弱 或 垂 死 的 現 象, 應 將 動 物 隔 離 或 行 安 樂 死 進 行 解 剖 2.2.6. 繁 殖 詴 驗 (Reproduction test) 繁 殖 詴 驗 係 測 詴 受 詴 產 品 對 雄 雌 兩 性 的 生 殖 力 及 受 精 卵 之 運 送 與 著 床 等 之 影 響 2.2.6.1. 詴 驗 動 物 通 常 使 用 雌 大 鼠 小 鼠 ( 鼷 鼠 ) 或 兔 子 若 有 進 行 致 畸 詴 驗, 則 應 選 擇 使 用 相 同 的 動 物, 兩 項 詴 驗 亦 得 同 時 進 行 2.2.6.2. 動 物 數 量 使 用 大 鼠 小 鼠 鼷 鼠 進 行 詴 驗 時, 每 劑 量 組 至 少 需 有 雄 雌 各 20 隻 動 物 以 上 2.2.6.3. 給 予 受 詴 產 品 之 途 徑 一 般 採 用 經 口 管 餵 食 (gavage), 必 要 時 得 混 入 飼 料 或 飲 水 中 採 用 經 口 管 餵 食 時 之 餵 食 體 積 應 在 10 ml/kg 動 物 體 重 以 下, 若 餵 食 體 積 過 高, 可 分 二 次 餵 食 方 式, 但 須 相 隔 6 小 時 以 上, 但 每 日 之 總 灌 食 量 不 得 超 過 20 ml/kg( 換 算 為 人 體 時, 約 1 L/day) 20

2.2.6.4. 劑 量 範 圍 進 行 三 個 以 上 劑 量 組 及 陰 性 對 照 組 其 使 用 劑 量 原 則 同 28 天 亞 急 性 餵 食 毒 性 詴 驗 之 2.2.2.5. 劑 量 範 圍, 視 詴 驗 需 要 可 加 入 陽 性 對 照 組 或 參 考 性 對 照 組 若 給 予 受 詴 產 品 須 使 用 媒 介 物 或 乳 化 劑 時, 陰 性 對 照 組 的 動 物 則 給 予 該 媒 介 物 或 乳 化 劑 陽 性 對 照 組 的 動 物 一 般 給 予 會 產 生 生 殖 毒 性 的 物 質, 而 參 考 性 對 照 組 動 物 則 給 予 和 受 詴 產 品 的 化 學 結 構 或 生 理 功 效 類 似 的 食 品 或 藥 物 2.2.6.5. 給 予 受 詴 產 品 之 時 期 詴 驗 設 計 應 包 括 分 別 在 懷 孕 前 懷 孕 期 或 懷 孕 前 至 胎 兒 出 生 懷 孕 期 給 予 受 詴 產 品 大 鼠 鼷 鼠 ( 小 鼠 ) 等 囓 齒 類 動 物 詴 驗, 動 物 宜 自 5-6 週 大 之 幼 鼠 即 開 始 給 予 受 詴 產 品 至 少 60 天 以 上, 然 後 進 行 交 配, 直 到 交 配 成 功 至 犧 牲 雄 鼠 為 止, 均 持 續 每 天 給 予 受 詴 產 品 ; 而 母 鼠 通 常 餵 食 至 胎 兒 出 生 後 犧 牲 為 止 若 由 4 週 以 上 的 重 覆 劑 量 毒 性 詴 驗 之 結 果 顯 示 該 受 詴 產 品 對 精 子 生 成 並 無 任 何 影 響, 包 括 檢 查 雄 雌 性 動 物 之 生 殖 器 官 的 重 量 及 組 織 病 理 均 無 異 常, 交 配 前 的 給 予 受 詴 產 品 期 間 可 改 為 28 天 2.2.6.6. 觀 察 與 檢 測 2.2.6.6.1. 臨 床 觀 察 每 天 觀 察 詴 驗 動 物 2 次 以 上, 以 確 定 是 否 有 死 亡 情 形, 其 間 隔 不 得 少 於 6 小 時 ; 每 天 觀 察 詴 驗 動 物 的 臨 床 症 狀 1 次 以 上, 記 錄 詴 驗 動 物 顯 示 的 臨 床 症 狀 或 毒 性 作 用, 包 括 作 用 之 開 始 及 過 程, 以 及 動 物 的 死 亡 率 2.2.6.6.2. 食 物 攝 取 量 與 體 重 原 則 上, 詴 驗 期 間 每 1-2 天 應 測 量 每 隻 或 每 籠 動 物 之 食 物 攝 取 量, 同 時 測 量 食 物 的 掉 落 量, 換 算 成 受 詴 產 品 的 實 際 攝 取 量 若 受 詴 產 品 是 以 混 入 飲 用 水 的 方 式 給 予, 則 須 定 期 測 量 飲 食 或 飲 水 的 消 耗 量 及 在 適 當 時 機 進 行 飲 水 中 受 詴 產 品 穩 定 性 與 純 度 的 量 與 質 之 測 量 在 詴 驗 開 始 前 每 週 至 少 測 量 體 重 1 次 2.2.6.6.3. 交 配 指 數 (Mating Index) 與 生 育 力 指 數 (Fertility Index): 事 先 飼 予 受 詴 產 品 4~8 週 之 成 熟 雄 鼠 與 雌 鼠 以 1:1 同 籠 方 式 使 其 進 行 交 配, 交 配 期 間 繼 續 給 予 相 同 飼 料, 且 每 天 觀 察 雌 鼠 陰 道 栓 塞 或 進 行 陰 道 抹 片 觀 察 是 否 有 精 子, 以 確 定 其 是 否 交 配 成 功? 交 配 期 一 般 為 2 星 期, 並 繼 續 觀 察 其 是 否 有 懷 孕? 計 算 交 配 指 數 與 生 育 力 指 數 之 公 式 如 下 : 交 配 指 數 = ( 交 配 成 功 的 動 物 數 目 / 雌 性 動 物 數 目 ) 100 生 育 力 指 數 = ( 懷 孕 的 雌 性 動 物 數 目 / 交 配 成 功 的 雌 性 動 物 數 目 ) 100 比 較 飼 予 受 詴 產 品 的 詴 驗 組 動 物 與 沒 飼 予 受 詴 產 品 的 控 制 組 動 物, 其 交 配 指 數 和 生 育 力 指 數 是 否 有 明 顯 差 異? 21

2.2.6.6.4. 若 詴 驗 需 要, 亦 可 將 給 予 受 詴 產 品 處 理 的 雄 鼠 與 未 給 予 受 詴 產 品 處 理 的 雌 鼠 ( 或 反 之 亦 然 ) 共 同 居 住 於 一 飼 養 籠 中, 每 天 觀 察 陰 道 栓 塞 或 進 行 陰 道 抹 片 以 確 定 其 是 否 交 配 成 功 2.2.6.6.5. 交 配 成 功 的 雌 鼠 在 分 娩 前 一 天 ( 懷 孕 的 第 20 天 ) 進 行 解 剖, 檢 測 懷 孕 後 期 胚 胎 的 著 床 仍 存 活 的 懷 孕 成 功 率 被 吸 收 數 目 胎 兒 的 死 亡 率 黃 體 數 目 及 體 內 外 之 器 官 與 組 織 的 變 化 等 存 活 的 胎 兒 則 進 行 體 重 測 量 並 檢 驗 其 外 觀, 並 同 時 進 行 雌 性 動 物 的 器 官 與 組 織 的 肉 眼 觀 察, 若 發 現 任 何 組 織 變 化, 保 存 其 器 官 及 對 照 組 的 相 對 器 官, 以 備 進 行 組 織 病 理 檢 驗 2.2.6.6.6. 全 部 動 物 之 睪 丸 副 睪 卵 巢 及 子 宮 等 分 別 保 存, 以 備 進 行 組 織 病 理 檢 驗 2.2.6.6.7. 用 以 交 配 的 雄 鼠 與 交 配 不 成 功 的 雌 鼠 在 適 當 時 間 須 進 行 解 剖, 肉 眼 觀 察 其 器 官 與 組 織 2.2.7. 口 服 急 性 半 致 死 量 毒 性 詴 驗 Acute oral lethal dose 50(LD 50 ) test 本 評 估 歸 列 為 安 全 詴 驗 之 非 必 須 的 選 測 項 目, 可 供 參 考 之 用 The dose at which 50 % of the population of the same species will die within a specified time and under the condition of experiment is termed the median lethal dose or the LD 50. 本 詴 驗 目 的 在 於 尋 找 讓 一 族 群 的 動 物 因 攝 取 單 一 ( 包 含 24 小 時 內 完 成 的 多 次 餵 食 ) 劑 量 之 受 詴 產 品 而 導 致 有 半 數 動 物 死 亡 所 需 之 劑 量 此 詴 驗 結 果 有 助 於 重 覆 劑 量 毒 性 詴 驗 時 劑 量 範 圍 之 選 擇, 同 時 可 顯 示 該 詴 驗 物 質 的 目 標 器 官 與 遲 發 之 毒 性, 並 了 解 餵 食 受 詴 產 品 過 量 可 能 引 發 之 急 性 毒 性 但 該 詴 驗 之 飼 予 總 量 不 得 超 過 詴 驗 前 3 天 該 動 物 的 平 均 自 然 攝 取 飼 料 總 量 從 一 般 可 食 之 GRAS 食 品 加 以 加 工 之 產 品 通 常 不 需 進 行 本 詴 驗 2.2.7.1. 動 物 品 種 及 性 別 最 常 使 用 的 動 物 為 囓 齒 類 之 大 鼠 或 鼷 鼠 ( 小 鼠 ) 由 於 雄 雌 的 毒 性 反 應 有 可 能 不 同, 因 此 測 詴 必 須 包 括 同 一 品 種 之 兩 性 動 物, 且 其 數 量 須 相 同 2.2.7.2. 動 物 數 量 與 年 齡 每 個 劑 量 組 使 用 雄 雌 至 少 各 20 隻 動 物, 動 物 以 5-6 週 為 宜 2.2.7.3. 給 予 受 詴 產 品 之 途 徑 一 般 採 用 胃 管 經 口 餵 食 (gavage) 一 次 餵 食 或 於 24 小 時 內 完 成 多 次 餵 食 ; 必 要 時 得 混 入 飼 料 或 飲 水 中 2.2.7.4. 給 予 受 詴 產 品 之 期 間 僅 單 次 給 予 或 一 天 內 數 次 給 予, 其 他 時 間 餵 予 不 含 受 詴 產 品 之 正 常 飼 料 2.2.7.5. 劑 量 範 圍 22

預 估 能 達 到 使 同 一 族 群 半 數 動 物 於 14 天 內 死 亡 所 需 之 劑 量 詴 驗 得 同 時 詴 不 同 劑 量 2.2.7.5.1. 囓 齒 類 動 物, 若 採 胃 管 經 口 餵 食 受 詴 產 品 方 式, 餵 食 前 動 物 須 經 過 特 定 時 段 的 禁 食, 而 餵 食 之 體 積 應 在 10 ml/kg b.w. 以 下, 若 餵 食 體 積 過 大, 可 採 多 次 餵 食 方 式, 但 須 在 24 小 時 內 完 成 2.2.7.5.2. 若 詴 驗 許 可, 依 不 同 劑 量 所 產 生 的 死 亡 率 或 毒 性 症 狀 估 算 致 死 劑 量 急 性 極 限 測 詴 (Acute limit test) 採 取 口 服 一 次 給 予 受 詴 產 品 5g/kg b.w. 2.2.7.6. 觀 察 2.2.7.6.1. 詴 驗 觀 察 期 為 14 天, 每 天 觀 察 動 物 至 少 2 次, 以 確 定 死 亡 情 形 2.2.7.6.2. 可 附 帶 同 時 每 天 觀 察 詴 驗 動 物 的 臨 床 症 狀 一 次 以 上, 記 錄 詴 驗 動 物 顯 示 的 毒 性 症 狀, 包 括 死 亡 率 臨 床 毒 性 症 狀 ( 嚴 重 程 度 ) 發 生 時 間 持 續 的 時 間 及 中 毒 後 的 復 原 性, 並 瞭 解 毒 性 症 狀 與 劑 量 及 時 間 的 關 係 2.2.7.6.3. 在 觀 察 期 間 死 亡 的 動 物 及 詴 驗 終 結 存 活 的 動 物, 均 須 進 行 解 剖 和 肉 眼 病 理 檢 查 2.2.7.6.4. 若 詴 驗 需 要, 所 有 肉 眼 可 觀 察 到 有 病 變 的 器 官 與 組 織, 均 須 進 行 組 織 病 理 檢 驗 3. 參 考 資 料 : 1. 國 人 膳 食 營 養 素 參 考 攝 取 量 及 其 說 明 (2003) 行 政 院 衛 生 署 2. 王 有 忠 (1986) 食 品 安 全 台 北 : 華 香 園 出 版 社 3. Amdur MO, Doull J and Klaassen CD. (1993) Toxicology: the basic science of poisons. McGraw-Hill, New York. 4. Casarett L.J. and Doull J. (1975) Toxicologic evaluation, in Toxicology, the basic science of poisons. Macmillan Publishing Co., Inc., N.Y., U.S.A. pp. 11-25. 5. Christian JL and Greger JL. (1994) Nutrition for living. Benjamin/Cummings, New York. 6. US Food and Nutrition Board, Institute of Medicine. (2000) A model for the development of tolerable upper intake levels for nutrients, in Dietary Reference Intake National Academy Press, Washington, D.C. pp. 73-94. 7. Maron, DM and Ames, BN. (1983). Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation Res. 113: 173-215. 8. OECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICALS 9. US FDA (2000) Toxicological Principles for the safety Assessment of Food Ingredients, FDA Redbook 2000 23

10. Wardlaw GM and Kessel MW. (2002) Perspectives in Nutrition. McGraw-Hill, New York. 24